崔 帆，楊凱環(huán)，李曉曉，李素琴，吳成斌，任 杰

（山西杏花村汾酒廠股份有限公司技術(shù)中心，山西汾陽(yáng)032205）

竹葉青酒是中國(guó)古老的傳統(tǒng)保健名酒，其歷史可追溯到南北朝。它以優(yōu)質(zhì)汾酒為基酒，配以淡竹葉、菊花、陳皮、砂仁等十余種名貴中藥材加工而成，具有改善腸道菌群的保健功能。竹葉青酒以梔子苷、橙皮苷、黃酮類化合物等為主要成分，而橙皮苷具有維持滲透壓、增強(qiáng)毛細(xì)血管韌性、降低膽固醇等作用。對(duì)3種色譜條件下測(cè)定竹葉青酒中橙皮苷含量的方法進(jìn)行了比較研究，選擇了一種適合我公司的測(cè)定方法，該方法成本低，操作簡(jiǎn)單，出峰較快，精密度好。

1 材料

1.1 儀器

Waters e2695型高效液相色譜儀，美國(guó)Waters ACQUITY H-CLASS/TUV；FA1004B型電子天平；KQ-300DE超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）；優(yōu)普純水系統(tǒng)及超純水機(jī)（成都超純科技有限公司）。

1.2 藥品與試劑

甲醇、醋酸均為色譜純，莫克公司；超純水（自制）；橙皮苷，德國(guó)ehrenstorfer Quality。

樣品：38%vol竹葉青酒。

2 方法與結(jié)果

2.1 橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

精密稱取橙皮苷0.0084 g用甲醇定容于10 mL容量瓶中，超聲振蕩，搖勻備用。

對(duì)照品溶液制備：分別精密吸取25 μL、50 μL、100 μL、200 μL、1 mL、3 mL橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別用甲醇定容至10 mL，搖勻即得對(duì)照品溶液。

2.2 供試品溶液制備

將待測(cè)竹葉青酒樣用0.2 μm濾膜過(guò)濾至樣品瓶中，即得供試品溶液。

2.3 色譜條件

2.3.1 條件一 ：ACQUITY UPLC H-CLASS，BEH C18色譜柱（1.7 μm，2.1×50 mm），流動(dòng)相為混合流動(dòng)相（甲醇∶醋酸∶水=35∶4∶61）∶水=72∶28，檢測(cè)波長(zhǎng)為283 nm，流速為0.5 mL/min，柱溫30℃，進(jìn)樣量10 μL。

2.3.2 條件二：Symmetry C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相：甲醇-3%冰醋酸溶液（45∶55），流速 1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：283 nm；柱溫30℃，進(jìn)樣量為10 μL。

2.3.3 條件三：Symmetry C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相：甲醇∶醋酸∶水=35∶4∶61，檢測(cè)波長(zhǎng)為283 nm，流速為0.5 mL/min，柱溫30℃，進(jìn)樣量10 μL。

2.4 陰性干擾試驗(yàn)

分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，在3種色譜條件下進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果陰性對(duì)照品溶液在橙皮苷色譜峰相應(yīng)位置上無(wú)吸收峰出現(xiàn)，表明陰性對(duì)照無(wú)干擾（見(jiàn)圖1）。

圖1 2.3.2條件下的高效液相色譜圖

2.5 線性關(guān)系考察

取2.1.1制備的0.0021 mg/mL、0.0042 mg/mL、0.0084mg/mL、0.0168mg/mL、0.084mg/mL、0.252 mg/mL橙皮苷標(biāo)液，按“2.3”項(xiàng)下的3種色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以6個(gè)濃度水平繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)作校正曲線并進(jìn)行線性回歸。

3種條件下的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：

結(jié)果均表明，橙皮苷在0.0021～0.252 mg/mL范圍內(nèi)線性良好（3種色譜條件下同一標(biāo)品的色譜圖見(jiàn)圖2、圖3、圖4）。

2.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一對(duì)照品溶液（0.252 mg/mL）10 μL，在3種色譜條件下，重復(fù)進(jìn)樣5次，記錄橙皮苷峰面積。得到的RSD分別為0.73%、0.73%、0.72%，表明儀器精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取按“2.2”項(xiàng)制備的供試品，在3種色譜條件下，分別連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄各峰面積，并按外標(biāo)法計(jì)算其中橙皮苷的含量，分別為0.051 mg/mL、0.047 mg/mL、0.045 mg/mL，樣品中橙皮苷含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為1.32%、1.43%、1.49%。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，在3種色譜條件下分別于0、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h進(jìn)樣10 μL，測(cè)定橙皮苷峰面積。得到的RSD分別為1.2%、1.4%、1.5%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

圖2 2.3.1條件下的標(biāo)品色譜圖

圖3 2.3.2條件下的標(biāo)品色譜圖

圖4 2.3.3條件下的標(biāo)品色譜圖

2.9 加標(biāo)回收試驗(yàn)

吸取橙皮苷含量為0.048 mg/mL的供試品溶液5 mL，共3份，分別置于10 mL量瓶中，各加入橙皮苷對(duì)照品溶液（0.252 mg/mL）0.8 mL、1 mL、1.2 mL，加供試品溶液至刻度，搖勻，用0.2 μm濾膜過(guò)濾至樣品瓶中。按上述3種色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定并計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1、表2、表3。

表1 竹葉青加標(biāo)回收試驗(yàn)UPLC法

表2 竹葉青加標(biāo)回收試驗(yàn) HPLC法

表3 竹葉青加標(biāo)回收試驗(yàn)HPLC法

2.10 樣品含量測(cè)定

取3批樣品，按供試品溶液制備方法制備溶液，在3種色譜條件下分別進(jìn)樣10 μL，依法測(cè)定，以外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果3個(gè)批號(hào)的樣品在3種色譜條件下測(cè)得含量分別：0.051 mg/mL、0.045 mg/mL、0.047mg/mL；0.050mg/mL、0.046mg/mL、0.045mg/mL；0.049 mg/mL、0.045 mg/mL、0.048 mg/mL。

3 討論

橙皮苷作為竹葉青酒的主要成分，對(duì)其含量的定量控制是確保竹葉青酒質(zhì)量穩(wěn)定性的一個(gè)重要方面，因此對(duì)竹葉青酒中橙皮苷含量的測(cè)定方法研究很有必要，3個(gè)方法的檢測(cè)效果對(duì)比見(jiàn)表4。

從表4綜合來(lái)看，方法二成本低，柱子不易堵塞，出峰時(shí)間較快，回收率好，誤差較小，所以考慮選擇方法二測(cè)定竹葉青酒中的橙皮苷含量。

表4 3種檢測(cè)方法的檢測(cè)效果和經(jīng)濟(jì)性