樊輕亞，王萬(wàn)好，代春美

(1.信陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南 信陽(yáng) 464000;2.河南同源制藥有限公司，河南 信陽(yáng) 464000;3.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院，北京 100700)

倒提壺(CynoglossumamabileStapfetDrumm)是紫草科琉璃草屬植物，分布于不丹及中國(guó)的西藏、云南等地。倒提壺全草入藥，其味苦，性涼，有清熱利濕、散瘀止血、止咳、鎮(zhèn)痛之功效，常用于治療瘧疾、肝炎、痢疾、咳嗽、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、尿道炎等[1-3]。倒提壺的主要成分為生物堿，如天芥菜堿、毛果天芥菜堿、天芥菜品和天芥菜定等[4-8]，這些生物堿具有廣泛的藥理和毒理活性，如抗腫瘤、抗菌、抑制微生物及肝毒性等，因此研究倒提壺的生物堿成分具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。

反膠束萃取技術(shù)是20世紀(jì)80年代初發(fā)展的分離、純化技術(shù)，具有萃取環(huán)境溫和、選擇性高、不改變樣品生物活性、極少使用有機(jī)溶劑等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)、酶、氨基酸等生物大分子的分離純化中。近年來(lái)開(kāi)始應(yīng)用于中藥有效成分的萃取分離方面，并顯示了良好的應(yīng)用前景[9-13]。本文首次將反膠束萃取技術(shù)用于倒提壺中有效成分的分離，獲得二(2-乙基己基)磷酸酯(DOLPA)/ 二(2-乙基己基)丁二酸酯磺酸鈉(AOT)-異辛烷反膠束萃取倒提壺生物堿的最佳工藝條件。超高效液相色譜法(UPLC)具有方法簡(jiǎn)便、分析時(shí)間短和溶劑消耗少等特點(diǎn)，尤其適用于中藥材中多指標(biāo)成分的定量檢測(cè)[14-16]。本文采用 UPLC技術(shù)，建立了測(cè)定倒提壺中天芥菜品、天芥菜堿、毛果天芥菜堿和天芥菜定含量的方法，可為倒提壺制劑的開(kāi)發(fā)及質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

DFY-200搖擺式高速中藥粉碎機(jī)(溫嶺市大德中藥機(jī)械有限公司)；B-260型恒溫水浴(上海雅榮生化設(shè)備儀器有限公司)；美國(guó) Waters 超高效液相色譜 Accuricy(UPLC)系統(tǒng)，包括二元超高壓溶劑系統(tǒng)(BSM)、二極管陣列檢測(cè)器(PDA)。

天芥菜品(111810-201512，純度>98%)、天芥菜堿(111830-201512，純度>98%)、毛果天芥菜堿(111920-201510，純度>98%)、天芥菜定(111520-201511，純度>98%)購(gòu)于成都普菲德生物技術(shù)有限公司；二(2-乙基己基)丁二酸酯磺酸鈉(AOT)、二(2-乙基己基)磷酸酯(DOLPA)、三乙胺、氨水、95%乙醇、鹽酸、氯仿(分析純，鄭州德眾化學(xué)試劑廠)；甲醇、乙腈(色譜純，美國(guó)Merck 公司)；實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水；倒提壺(廣西玉林藥材市場(chǎng))經(jīng)信陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)院聶新奇院長(zhǎng)鑒定為倒提壺(CynoglossumamabileStapfetDrumm)全草。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1乙醇回流法提取生物堿稱取一定量粉碎過(guò)100目篩的倒提壺藥材，加4倍量的95%乙醇回流3次，每次1.5 h，過(guò)濾，合并濾液后濃縮，備用。

1.2.2反膠束溶液的配制稱取一定量的DOLPA和AOT(質(zhì)量比1∶1)置于250 mL燒杯中，加入適量異辛烷，在磁力攪拌器上攪拌使其完全溶解，得到透明澄清的反膠束溶液。

1.2.3反膠束法萃取提取液取按“1.2.1”方法提取的倒提壺生物堿粗提液浸膏，用鹽酸或氫氧化鈉分別調(diào)節(jié)水相的 pH 值為4.0。以 KCl調(diào)節(jié)水相的離子強(qiáng)度，使水相中 KCl 的濃度為 0.2 mol/L，加入粗提液4倍體積的DOLPA/AOT-異辛烷反膠束溶液，室溫下電磁攪拌萃取10 min，取上清液，轉(zhuǎn)入分液漏斗靜置分層，取上層有機(jī)相轉(zhuǎn)移至一小錐形瓶中，加入等體積的水后，室溫下電磁攪拌反萃取 30 min；轉(zhuǎn)入分液漏斗靜置分層，取下層水相待測(cè)。

1.2.4溶劑法萃取提取液取按“1.2.1”方法提取的倒提壺生物堿粗提液浸膏，用30 mL稀鹽酸超聲溶解，傾出上清液，置于分液漏斗，用氯仿萃取，萃取后的水相用1% NaOH溶液調(diào)至pH 10.0，再用氯仿萃取3次，收集氯仿層，旋干，用甲醇溶解、定容，待測(cè)。

1.2.5UPLC測(cè)定條件色譜柱為Waters BET C18( 2.1 mm×150 mm，1.7 μm) ，流動(dòng)相為乙腈(A)-0.2%三乙胺水溶液(B)，梯度洗脫程序:0～1 min，5% A；1～7 min，5%～10% A;7～12 min，10%～15%A;12～16 min，15%～25% A；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，流速0.25 mL/min，柱溫45 ℃，進(jìn)樣量1 μL。

1.2.6對(duì)照品溶液的制備精密稱取對(duì)照品天芥菜品6.0 mg、天芥菜堿12.0 mg、毛果天芥菜堿9.0 mg、天芥菜定4.0 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL，即得混合對(duì)照品溶液。

圖1 反膠束體系對(duì)4種生物堿萃取率的影響Fig.1 Effects of different reverse micelles on extraction efficiencies of four alkaloids1.heliosupine, 2.heliotrine, 3.lasiocarpine, 4.heliotridine

2 結(jié)果與討論

2.1 反膠束體系的篩選及萃取條件的優(yōu)化

2.1.1表面活性劑種類及濃度的影響根據(jù)近年來(lái)的相關(guān)報(bào)道及本實(shí)驗(yàn)室的相關(guān)研究成果[6-8]，在用離子表面活性劑形成的反膠束進(jìn)行萃取時(shí)，反膠束萃取的最主要推動(dòng)力是正負(fù)電荷間的靜電吸引。表面活性劑和被萃取物所帶的異性電荷數(shù)量越多，靜電吸引作用越強(qiáng)，越容易被帶相反電荷的反膠束萃取。4種生物堿在酸性條件下與 H+結(jié)合而帶正電荷，因此陰離子表面活性劑形成的反膠束更適于萃取堿性物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)考察了AOT、十二烷基苯磺酸鈉(SDBS)、十二烷基磺酸鈉(SDS)、十二烷基硫酸鈉(SLS)、DOLPA 5種表面活性劑形成的反膠束體系的萃取效果，結(jié)果顯示,SDBS、SDS、SLS形成的反膠束體系不穩(wěn)定，而DOLPA和AOT均可形成均一、穩(wěn)定透明的反膠束體系。進(jìn)一步考察了DOLPA-異辛烷、AOT-異辛烷、DOLPA/AOT-異辛烷反膠束體系對(duì)萃取結(jié)果的影響(圖1)。結(jié)果顯示，DOLPA/AOT-異辛烷混合反膠束體系對(duì)倒提壺生物堿的萃取性能最好。其原因可能是由于DOLPA 和AOT分子均為雙鏈結(jié)構(gòu)，其極性基團(tuán)較小，兩者混合后反膠束體系中的膠束由圓形過(guò)渡到棒狀結(jié)構(gòu)，這種棒狀膠束對(duì)膠束內(nèi)核的被增溶物具有較大的溶解能力，有利于分子較大的生物堿進(jìn)入。因此實(shí)驗(yàn)選擇DOLPA/AOT-異辛烷體系作為最佳反膠束體系。

進(jìn)一步考察了DOLPA/AOT總濃度在0～1.0 mol/L范圍內(nèi)對(duì)4種生物堿萃取率的影響。結(jié)果顯示，隨著DOLPA/AOT濃度的增大，4種生物堿的萃取率呈先增大后減小的趨勢(shì)。這是因?yàn)殡S著DOLPA/AOT 濃度的增大，有機(jī)相中的反膠束數(shù)量增多，使得萃取率增加，但當(dāng)DOLPA/AOT濃度增至 0.6 mol/L時(shí)，其在異辛烷中的溶解度達(dá)到飽和，繼續(xù)增加DOLPA/AOT的濃度，表面活性劑開(kāi)始團(tuán)聚，反膠束體系粘度變大，從而增加了萃取過(guò)程中的傳質(zhì)阻力，導(dǎo)致萃取率降低。因此實(shí)驗(yàn)選擇DOLPA/AOT的最佳濃度為0.6 mol/L。

圖2 水相pH值對(duì)4種生物堿萃取率的影響Fig.2 Effects of pH value on extraction efficiencies of four alkaloids1.heliosupine, 2.heliotrine, 3.lasiocarpine, 4.heliotridine

圖3 鹽種類對(duì)4種生物堿萃取率的影響Fig.3 Effects of different salts on extraction efficiencies of four alkaloids1.heliosupine, 2.heliotrine, 3.lasiocarpine, 4.heliotridine

2.1.2水相pH值的影響考察了不同水相pH值對(duì)4種生物堿萃取率的影響，以稀HCl和稀NaOH調(diào)節(jié)水相pH 值為 2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0，分別進(jìn)行反膠束萃取(圖2)。由圖可知，生物堿的萃取率最初隨著水相pH值的升高而增加，且在pH 4.0時(shí)萃取率達(dá)最大；當(dāng)pH>4.0 時(shí)，生物堿的萃取率降低；pH 12.0時(shí)的萃取率幾乎為0，這是由于隨著 pH值的增大(pH>8.0)，帶正電荷的生物堿離子減少，生物堿主要以游離分子存在，則與DOLPA/AOT 的靜電引力逐漸減弱，導(dǎo)致萃取率降低。因此選擇最佳pH值為4.0。

2.1.3水相鹽種類與濃度的影響反膠束萃取過(guò)程中向水相加鹽后，會(huì)影響表面活性劑的解離以及反膠束中內(nèi)表面的電荷密度，從而影響反膠束的萃取效果，因此考察了水相中KCl、CaCl2、BaCl2對(duì)4種生物堿萃取率的影響(圖3)。由圖可知KCl的萃取效率最高，這是因?yàn)樵陉庪x子相同的情況下，鹽對(duì)DOLPA/AOT反膠束萃取的影響主要來(lái)自陽(yáng)離子，且陽(yáng)離子所帶電荷越少萃取效果越好，因此KCl的效果最好。

考察了KCl濃度(0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 mol/L)對(duì)生物堿萃取率的影響。 結(jié)果顯示，萃取率隨KCl濃度的增大而增加，當(dāng)KCl濃度為 0.2 mol/L時(shí)，萃取率達(dá)最大。此后繼續(xù)增大KCl濃度，生物堿的萃取率反而明顯下降，原因可能是離子濃度越大，離子對(duì)反膠束雙電層的壓縮越嚴(yán)重，對(duì)生物堿及DOLPA/AOT靜電吸引的屏蔽過(guò)強(qiáng)，導(dǎo)致萃取劑對(duì)生物堿的加溶能力急劇下降，從而使生物堿的萃取率迅速降低。因此選擇最佳KCl 濃度為0.2 mol/L。

2.1.4萃取劑相比、萃取時(shí)間及反萃取時(shí)間的影響取“1.2.1”提取后的生物堿儲(chǔ)備液，分別按體積比0.5∶1、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1加入DOLPA/AOT-異辛烷反膠束萃取劑，考察了萃取物體積與反膠束萃取劑用量相比的影響。結(jié)果顯示，隨著萃取劑用量的增大，生物堿的萃取率逐漸增大，這是因?yàn)橐欢康姆茨z束萃取劑所含“水池”數(shù)目有限，對(duì)生物堿的萃取能力有限，隨著萃取劑用量的增加，所萃取的生物堿更多，直至萃取劑相比達(dá)到4∶1(體積比)時(shí)，萃取劑可將生物堿萃取完全，繼續(xù)增加萃取劑，萃取率變化不大。故選擇最佳萃取相比為4∶1(體積比)。

考察了萃取時(shí)間對(duì)生物堿萃取率的影響。結(jié)果表明，當(dāng)萃取時(shí)間為2～10 min 時(shí)，隨著萃取時(shí)間的延長(zhǎng)，生物堿的萃取率增加，萃取10 min時(shí)萃取率達(dá)最大，繼續(xù)延長(zhǎng)萃取時(shí)間，生物堿的萃取率基本不變。原因可能是在萃取開(kāi)始階段，表面活性劑層與水相中的生物堿充分接觸，生物堿受靜電引力作用與表面活性劑電性相反的極性頭結(jié)合被包裹在反膠束內(nèi)，達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡后，反膠束的形成與破壞速度相當(dāng)，體系中反膠束數(shù)量不因萃取時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，因而萃取率不再增加。進(jìn)一步考察了反萃取時(shí)間對(duì)生物堿萃取率的影響，結(jié)果顯示，隨著反萃取時(shí)間的延長(zhǎng)，生物堿的萃取率不斷增加，且在30 min時(shí)達(dá)到平衡，這是由于反萃取需破壞反膠束膠團(tuán)，因此所需時(shí)間比萃取時(shí)間長(zhǎng)。綜合考慮，選擇萃取時(shí)間為 10 min，反萃取時(shí)間為30 min。

綜上所述，最佳反膠束萃取條件為：DOLPA/AOT為表面活性劑，DOLPA/AOT的總濃度為0.6 mol/L，水相pH值為4.0，KCl濃度為0.2 mol/L，萃取相比為4∶1，萃取時(shí)間為 10 min，反萃取時(shí)間為30 min。

2.2 倒提壺中4種生物堿的含量測(cè)定

2.2.1色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)對(duì)倒提壺粗提液和反膠束萃取后提取液進(jìn)行UPLC分析，結(jié)果表明，粗提液中雜質(zhì)較多，且毛果天芥菜堿和天芥菜定均無(wú)法完全分離(圖4A)，經(jīng)反膠束萃取后，提取液的雜質(zhì)較少，4種生物堿均得到良好分離，且分離度(R)均大于1.5(圖4B)。

考察了有機(jī)相(乙腈、甲醇)與不同水相(二乙胺、三乙胺、氨水)按不同配比作為流動(dòng)相的分離效果，結(jié)果表明，以乙腈-0.2%三乙胺為流動(dòng)相時(shí)的分離效果較好。采用二極管陣列檢測(cè)器分別對(duì)4種生物堿的對(duì)照品溶液在200～400 nm 進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果顯示4種生物堿在254 nm 處均有良好的紫外吸收，且響應(yīng)信號(hào)較穩(wěn)定。因此，本文的最佳色譜條件如“1.2.5”所示，在該條件下，天芥菜品、天芥菜堿、毛果天芥菜堿和天芥菜定的保留時(shí)間分別為4.18、7.47、9.40、12.42 min，與 HPLC 法[7]相比大大縮短了分析時(shí)間，且色譜峰峰形好、對(duì)稱，柱效更高。

2.2.2線性關(guān)系與檢出限取一定量的4種生物堿混合標(biāo)準(zhǔn)品，配制成一系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進(jìn)樣10 μL按本方法進(jìn)行分析，以峰面積(A)和質(zhì)量濃度(ρ，mg/L)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，按3倍信噪比(S/N=3)計(jì)算檢出限，4種生物堿的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線、線性范圍及檢出限見(jiàn)表1。由表1可知，4種生物堿的相關(guān)系數(shù)均大于0.999，檢出限為0.020～0.050 mg/L，滿足倒提壺提取液中生物堿的含量測(cè)定要求。

表1 4種生物堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)(r)、線性范圍及檢出限Table 1 Calibration curves,correlation coefficients(r),linear ranges and detection limits of four alkaloids

2.2.3精密度、穩(wěn)定性及重復(fù)性精密稱取倒提壺藥材細(xì)粉6份，按“1.2”方法分別進(jìn)行萃取、處理和測(cè)定，取樣品和對(duì)照品溶液于室溫下放置0～12 h，并取同一樣品進(jìn)樣測(cè)定5次。結(jié)果表明，天芥菜品、天芥菜堿、毛果天芥菜堿和天芥菜定精密度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD,n=3)分別為1.8%、1.9%、1.1%、1.5%，穩(wěn)定性的RSD(n=3)分別為2.3%、1.7%、1.2%、1.3%，重復(fù)性的RSD(n=3)分別為1.7%、2.0%、2.3%、0.9%。表明儀器的精密度良好，分析方法具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

2.2.4加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)精密稱取已測(cè)定含量的倒提壺樣品9 份，按照高、中、低3個(gè)濃度分別加入天芥菜品、天芥菜堿、毛果天芥菜堿和天芥菜定對(duì)照品溶液，按“1.2”方法制備供試品溶液并進(jìn)行測(cè)定。天芥菜品、天芥菜堿、毛果天芥菜堿和天芥菜定的回收率分別為98.2%～103%、97.9%～102%、98.1%～101%、97.8%～104%，RSD(n=3)分別為 1.5%、1.1%、1.7%、1.9%。

2.3 實(shí)際樣品的應(yīng)用

精密稱取3個(gè)批次的倒提壺藥材各100 g，采用本方法萃取藥材中的4種生物堿后進(jìn)行測(cè)定，并與“1.2.4”所示的溶劑萃取法(SRE)進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果見(jiàn)表2。由表可知，經(jīng)DOLPA/AOT-異辛烷萃取后4種生物堿的萃取效率約為氯仿溶劑萃取法的2倍。原因可能為反膠束萃取法主要通過(guò)靜電作用力使目標(biāo)物增溶到“水池”中，萃取過(guò)程與有機(jī)溶劑隔絕，萃取條件溫和，不改變萃取物的生物活性，可以實(shí)現(xiàn)被萃取物質(zhì)與溶劑的徹底分離，萃取率高，工藝簡(jiǎn)單、省時(shí)省力。

表2 不同批次的提取分析結(jié)果(n=3)Table 2 The results extracted from Cynoglossum amabile Stapf et Drumm(n=3)

3 結(jié) 論

本文將DOLPA/AOT-異辛烷反膠束萃取技術(shù)應(yīng)用于倒提壺中4種生物堿的萃取，通過(guò)單因素試驗(yàn)對(duì)生物堿的萃取條件進(jìn)行了優(yōu)化，建立了生物堿含量的UPLC測(cè)定法。本方法萃取率高，且反膠束可重復(fù)利用，萃取成本低，綠色環(huán)保；UPLC法的分析時(shí)間短，所用溶劑少，靈敏度及重現(xiàn)性好，精密度高，可滿足倒提壺藥材中4種生物堿的檢測(cè)要求。