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        豬胸膜肺炎放線桿菌ftsI基因的克隆及分析

        2018-12-19 02:41:14郝知友鄒玖零禹小芳屈蓓蓓李英明黃復(fù)深
        畜牧獸醫(yī)科學(xué) 2018年17期
        關(guān)鍵詞:細(xì)胞分裂放線血清型

        郝知友,鄒玖零,禹小芳,屈蓓蓓,李英明,黃復(fù)深

        (1.湖南省永州市畜牧水產(chǎn)局,永州 425000;2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué),長沙 410000)

        0 引言

        豬傳染性胸膜肺炎(Porcine infectious pleuropneumonia)是由豬胸膜肺炎放線桿菌感染引起的一種高度傳染性呼吸系統(tǒng)疾病。主要表現(xiàn)為急性出血性纖維素性胸膜肺炎和慢性纖維素性壞死性胸膜肺炎,該病發(fā)病快,常引起大批豬只死亡[1]。該病的防治主要采用抗生素和滅活苗進(jìn)行,但由于豬胸膜肺炎放線桿菌血清型多,各地流行存在差異,滅活苗交叉保護(hù)效果離臨床要求較遠(yuǎn),因此多采用抗生素進(jìn)行治療??股氐氖褂每赡墚a(chǎn)生耐藥性,因此需尋找新的藥物靶點(diǎn),篩選新的藥物[2-3]。研究細(xì)菌細(xì)胞分裂是篩選藥物新靶點(diǎn)的途徑之一[4-5]。

        FtsI是在細(xì)菌分裂過程中一個重要的蛋白分子[6],F(xiàn)tsI是原核細(xì)胞分裂時的主要細(xì)胞骨架蛋白,與微管蛋白同源,細(xì)胞分裂時可與其他的細(xì)胞分裂蛋白組裝成Z環(huán),Z環(huán)的收縮促進(jìn)細(xì)胞分裂。研究表明[7-10]:關(guān)于ftsI的報道主要見于植物葉綠體和人患疾病的研究,但是專門針對APP的FtsI基因及相應(yīng)的編碼蛋白卻未見研究報道。目前研究最多的是FtsI,它廣泛存在于原核生物、真核生物,而且不同物種中ftsI基因在序列和結(jié)構(gòu)上呈現(xiàn)高度的保守性[4,11-14]。細(xì)菌細(xì)胞分裂與FtsI蛋白水平密切相關(guān),純化的ftsI蛋白是一種具有GTP酶活性的GTP結(jié)合蛋白[15],而且GTP酶活性和ftsI蛋白的濃度密切相關(guān)。研究表明至少含有21個與App細(xì)胞分裂體相關(guān)蛋白質(zhì)的基因參與了App的細(xì)胞分裂過程,其中ftsL參與分裂體成熟和穩(wěn)定的肽聚糖(PG)結(jié)合蛋白基因[14]。本研究的目的是通過對App ftsI基因的分析,了解其在豬胸膜肺炎放線桿菌細(xì)胞分裂的意義,為下一步研究藥物奠定基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 菌種、培養(yǎng)基

        豬胸膜肺炎放線桿菌血清型Ⅰ于本實(shí)驗(yàn)室保存,胰蛋白大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)購自青島日水生物技術(shù)有限公司,無支原體超級新生牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司,NAD氧化型輔酶Ⅰ購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司。

        1.2 主要試劑

        PCR反應(yīng)用試劑(2×Taq PCR Master Mix)、DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量(D2 000 Maker)購自北京天根生化科技有限公司。

        1.3 FtsI基因的擴(kuò)增與鑒定

        常規(guī)方法提取細(xì)菌基因組DNA。根據(jù)GenBank中已收錄的App基因組序列收錄的FtsI基因序列,采用軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)FtsI外引物一對。PF:5’-AAATCAGCACGAGGGAGATAAAA-3’,PR:5’-GTTTGCCCC TTATTCCTATCTTA-3'。FtsI基因的PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性50 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,共30個循環(huán),最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)l%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,確定后送上海生物工程公司測序。

        1.4 ftsI序列

        測序結(jié)果采用開放式閱讀框ORF在線分析軟件分析,跨膜區(qū)采用應(yīng)用TMHMM軟件和SOPMA(https://npsaprabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl)軟件分析,將其相應(yīng)的氨基酸序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能分析。應(yīng)用在線blast軟件找出豬胸膜肺炎放線桿菌不同血清型的ftsI蛋白的相關(guān)序列,用臨接法(NJ)繪制出基因進(jìn)化樹進(jìn)行分析,同時采用Megalign軟件對不同血清型的所有蛋白質(zhì)序列進(jìn)行相似性分析。

        2 結(jié)果

        2.1 APP的ftsI目的基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

        以豬胸膜肺炎放線桿菌血清型1的基因組為模板,對目的基因ftsI進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳,可見一條2 000 bps左右的特異擴(kuò)增產(chǎn)物帶,與目的基因基本一致,ftsI基因PCR擴(kuò)增電泳圖見圖1。核苷酸序列在GenBank登錄,登錄序列號:KT253252。經(jīng)ORF分析發(fā)現(xiàn),該基因全長1 752 bp,含1個完整開放的閱讀框(ORF),由起始密碼子ATG至終止密子TAA,編碼584個氨基酸,編碼蛋白的理論分子量為42.6 kD,等電點(diǎn)為4.72。

        2.2 ftsI基因序列

        ftsI基因序列與GenBank中已報道的APP的血清1、3、5、7、8型相似度為96%~100%。系統(tǒng)進(jìn)化樹可見,App的ftsI基因?qū)儆谶M(jìn)化的一個分支,與副嗜血桿菌有相近的親緣關(guān)系,而與大腸桿菌等的親緣關(guān)系較遠(yuǎn),ftsI的系統(tǒng)發(fā)育見圖 2。

        圖1 ftsI基因PCR擴(kuò)增電泳圖

        圖2 ftsI的系統(tǒng)發(fā)育

        2.3 ftsI蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能

        應(yīng)用SOPMA軟件和TMHMM軟件分析發(fā)現(xiàn),F(xiàn)tsI蛋白跨膜蛋白具1個跨膜區(qū),跨膜區(qū)分析見圖3。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測具有α-螺旋區(qū)、β-折疊區(qū)、β-轉(zhuǎn)角區(qū)和無規(guī)卷曲4個結(jié)構(gòu)類型,其中α-螺旋區(qū)占二級結(jié)構(gòu)的66.90%,β-折疊占二級結(jié)構(gòu)的60.00%,轉(zhuǎn)角占15.40%。分析三級結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)其具有2個模塊(Motif),App FtsI的三級結(jié)構(gòu)見圖4。

        圖3 跨膜區(qū)分析

        3 討論與結(jié)論

        研究表明豬胸膜肺炎放線桿菌呈短桿狀或球桿狀,菌體長短不一,菌體表層面有絨毛,其一端有一明顯的凹陷;細(xì)胞的分裂可發(fā)生在細(xì)胞中部或細(xì)胞的一極。至少含有21個與App細(xì)胞分裂體相關(guān)蛋白質(zhì)的基因參與了App的細(xì)胞分裂過程,其中ftsL參與分裂體成熟和穩(wěn)定的肽聚糖(PG)結(jié)合蛋白基因的過程[14]。

        圖4 App FtsI的三級結(jié)構(gòu)

        研究從App基因組中擴(kuò)增了App的FtsI 基因。研究表明該基因全長1 746 bp,含一個開放閱讀框(ORF),由起始密碼子ATG至終止密子TAA,編碼582個氨基酸。編碼蛋白的理論分子量為42.6 kD,等電點(diǎn)為4.72。與APP的血清1、3、4、5型相似度為96%~100%。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明,App的ftsI基因?qū)儆谶M(jìn)化的一個分支,與副嗜血桿菌有相近的親緣關(guān)系,而與大腸桿菌等的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。蛋白質(zhì)序列分析發(fā)現(xiàn),ftsI蛋白在APP各血清型的同源性甚高,該蛋白可能成為App的廣普藥靶,且在其他病原菌也有一定的作用。

        細(xì)菌細(xì)胞分裂涉及一類對熱敏感的基因,當(dāng)外界環(huán)境的溫度升高時,這些基因的突變體表現(xiàn)出分裂活動的停滯,形成不分裂的長絲狀菌體,但在正常的生長溫度條件下,則進(jìn)行正常的細(xì)胞分裂活動,這些對熱敏感的細(xì)胞分裂突變體統(tǒng)稱為fts突變體[8]。研究表明fts突變體涉及多個基因的參與,包括ftsL、ftsI、ftsW、ftsQ、ftsA、ftsZ、ftsJ、ftsH、ftsK、ftsB、ftsX、ftsY等,這些基因編碼的蛋白質(zhì)參與細(xì)菌細(xì)胞分裂中的多個過程[4]。

        研究以App血清1型基因組DNA為模板,PCR擴(kuò)增出ftsL的目的基因片斷。FtsI廣泛存在于細(xì)菌中,是細(xì)胞分裂的一種重要功能蛋白。細(xì)菌細(xì)胞分裂時,單體FtsI蛋白聚集在一起組裝合成肌纖維,于分裂位點(diǎn)處形成Z-ring(Z環(huán)),與細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)表面鑲嵌。Z環(huán)所在平面為分裂母細(xì)胞分裂部位[16]。FtsI的N端具有ATPase結(jié)構(gòu)域,水解GTP,為質(zhì)膜收縮供給動力,并順利分裂細(xì)胞[10],F(xiàn)tsI與其他細(xì)胞分裂相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白的共同作用,參與DNA的分離和細(xì)胞生長等重要生理過程[10,13]。同時,F(xiàn)tsI參與細(xì)菌細(xì)胞分裂時染色體的凝集[17]以及細(xì)胞壁的形成[16]。綠膿假單胞菌的研究表明,該基因的表達(dá)與細(xì)菌的耐藥性相關(guān)[18],該研究為進(jìn)一步研究App的 FtsI的功能及其在藥物篩選的意義奠定了基礎(chǔ)。

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