馮 穎， 赫子涵

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧沈陽 110866)

無梗五加(AcanthopanaxsessiliflorusSeem)別稱短梗五加，衛(wèi)生部于2008年第12號(hào)公告批準(zhǔn)其為新資源食品，是一種藥食同源的食品[1]。研究表明，無梗五加的果實(shí)具有降血脂[2]、抗腫瘤[3]、抗血小板[4-5]、清除自由基、耐缺氧、抗疲勞等作用[6-8]。近些年來，國內(nèi)外不斷有將無梗五加果制成果汁、果酒、果干等的報(bào)道[9]，其作為新型營養(yǎng)健康食品也受到越來越多的關(guān)注。已有研究表明，無梗五加果的主要活性成分包括黃酮、皂苷、香豆素、三萜、酚酸、多糖等[6，10-11]，其中黃酮類化合物是研究的熱點(diǎn)。安琪研究了無梗五加果中總黃酮含量的測定方法[10]。李春芳等建立了無梗五加果提取物中總黃酮含量及金絲桃苷含量的測定方法[12]。李林在對無梗五加果實(shí)化學(xué)成分的研究中，以金絲桃苷及東莨菪內(nèi)酯為指標(biāo)，建立了無梗五加果的質(zhì)量控制方法[13]。筆者所在課題組通過前期試驗(yàn)，建立了無梗五加果中黃酮類化合物含量的測定方法、乙醇回流提取及大孔樹脂純化工藝參數(shù)，并通過烘箱高溫誘導(dǎo)法、化學(xué)發(fā)光法及濾紙片法測定表明，無梗五加果黃酮類化合物具有抗油脂氧化、清除羥自由基和超氧自由基的能力，并具有一定的抑菌活性[8，14]。本研究在前期試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用超聲波法提取無梗五加果黃酮類化合物，用響應(yīng)面法優(yōu)化其提取工藝參數(shù)，以提高其提取效率和提取量，并對提取物的各種自由基的清除活性進(jìn)行測定和比較，旨在促進(jìn)無梗五加果黃酮類化合物在食品及保健品領(lǐng)域的應(yīng)用步伐。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

無梗五加干果，購自遼寧省丹東農(nóng)業(yè)科學(xué)院。蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品、金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)品、槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)，均購自北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司；乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、鹽酸、鄰苯三酚、水楊酸、硫酸亞鐵、過氧化氫等均為分析純；甲醇、乙腈為色譜純。

高速中藥粉碎機(jī)，浙江省溫嶺市創(chuàng)力藥材器械廠；電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；KQ-250A型超聲反應(yīng)器，昆山市超聲儀器有限公司；UV-1600型紫外可見分光光度計(jì)，北京瑞利分析儀器公司；高效液相色譜，日本島津公司；微量移液器，上海求精生化試劑儀器有限公司；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海博通經(jīng)貿(mào)有限公司；SHZ-ⅢB型循環(huán)水真空泵，上?；茖W(xué)儀器有限公司；LG0.2型真空冷凍干燥機(jī)，新陽速凍設(shè)備制造有限公司。

1.2 方法

1.2.1 無梗五加果黃酮類化合物的提取工藝

1.2.1.1 單因素試驗(yàn) 將無梗五加果干燥果實(shí)粉碎，過40目篩，準(zhǔn)確稱取1 g無梗五加果粉末，置于100 mL三角瓶中，加入不同體積、一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，用玻璃紙密封好后置于超聲波反應(yīng)器中，在超聲功率250 W、室溫(設(shè)定為 25 ℃)下超聲提取一定時(shí)間。待超聲處理完畢后，真空過濾取濾液，用相應(yīng)提取溶劑定容至100 mL。取適量體積的溶液，測定其中黃酮類化合物含量。

1.2.1.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以乙醇濃度、超聲提取時(shí)間、提取劑用量為自變量，采用Design Expert 8.0軟件中的中心組合(Box-Behnken)試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)(表1)。采用Design Expert 8.0軟件中的響應(yīng)優(yōu)化器進(jìn)行優(yōu)化分析，得到回歸模型和優(yōu)化的工藝參數(shù)。

1.2.2 黃酮類化合物含量的測定方法[14]用移液管吸取1.0 mL 樣品溶液于10 mL試管中，加入0.3 mL 5% NaNO2溶液，混勻后，靜置6 min，再加入0.3 mL 10% Al(NO3)3，搖勻后放置6 min。加入4.0 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的NaOH溶液，用濃度為30%的乙醇定容，搖勻，放置10 min。用紫外-可見分光光度計(jì)在500 nm處測定吸光度。同時(shí)以不加樣品液的試劑作為空白參比液。將吸光度值代入以蕓香苷為標(biāo)準(zhǔn)品制作的回歸方程中，計(jì)算黃酮的含量。

表1 試驗(yàn)因素水平及編碼值

1.2.3 高效液相色譜分析條件 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制：用甲醇水溶液(甲醇、水的體積比為1 ∶1)溶解配制成金絲桃苷、蕓香苷、槲皮素濃度分別為0.046、0.057、0.051 mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

樣品溶液的配制：將超聲提取得到的無梗五加果黃酮提取液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀真空濃縮后凍干，用甲醇水溶液(甲醇、水的體積比為 1 ∶1)配制成濃度為1.3 mg/mL的樣品溶液，混合均勻即得待測樣品溶液。

將上述標(biāo)準(zhǔn)品溶液與樣品溶液分別過0.4 μm濾膜，進(jìn)樣后依據(jù)保留時(shí)間定性，確定無梗五加果黃酮類化合物組成。高效液相色譜條件：色譜柱為Agilent TC-C18，柱溫為25 ℃，檢測波長為360 nm，進(jìn)樣量為10 μL。梯度程序設(shè)定見表2。

表2 液相梯度條件

1.2.4 自由基清除活性的測定 將超聲提取得到的無梗五加果黃酮提取液，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀真空濃縮后凍干，用50%乙醇配制成不同濃度的樣品溶液，進(jìn)行自由基清除活性的測定。

1.2.4.1 DPPH自由基清除活性的測定[15]取3.3 mL樣品溶液，加入配制好的0.5 mL濃度為1.0×10-5mol/L的DPPH無水乙醇溶液，搖勻，室溫避光反應(yīng)30 min后于520 nm測定吸光度。自由基清除率計(jì)算公式如下：

清除率=[1-(Ds-Db)/Dc]×100%。

式中：Dc為對照吸光度；Ds為樣品吸光度；Db為樣品空白吸光度。

樣品活性的測定：將1 mL樣品溶液、3.2 mL蒸餾水、4.5 mL pH值為8.2的50 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液混勻，然后按照上述相同的方法測定325 nm處的吸光度。自由基清除率計(jì)算公式如下：

清除率=(Dc-Ds)/Dc×100%。

式中：Dc為加入樣品前的吸光度；Ds為加入樣品5 min后的吸光度。

1.2.4.3 羥自由基(·OH)清除活性的測定[17]取濃度為60 mmol/L的FeSO4溶液、水楊酸-乙醇溶液各2 mL，搖勻混合，加入1.0 mL樣品溶液，加蒸餾水定容至20 mL，加入2 mL 6 mmol/L H2O2，反應(yīng)10 min，在520 nm處測定吸光度。自由基清除率計(jì)算公式如下：

[1-(Ds-Db)/Dc]×100%。

式中：Dc為對照吸光度；Ds為樣品吸光度；Db為樣品空白吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波法提取無梗五加果黃酮單因素試驗(yàn)

2.1.1 乙醇濃度對黃酮提取的影響 從圖1中可看出，隨著乙醇濃度的升高，黃酮提取量增加，當(dāng)乙醇濃度為30%時(shí)，提取量達(dá)到最大值；隨著乙醇濃度繼續(xù)增加，水溶性黃酮溶解性降低，黃酮提取量隨之下降。

2.1.2 超聲提取時(shí)間對黃酮提取的影響 從圖2可以看出，隨著提取時(shí)間的增加，黃酮提取量逐漸增加，在40 min時(shí)達(dá)到最大值；隨著提取時(shí)間繼續(xù)增加，提取量反而下降，原因可能是提取出的黃酮在超聲波的作用下被逐漸分解。

2.1.3 提取劑用量對黃酮提取的影響 從圖3可以看出，隨著提取劑用量的不斷增加，黃酮的提取量也不斷增加，當(dāng)提取劑用量為50 mL/g時(shí)，黃酮提取量達(dá)到最大值；隨著提取劑用量繼續(xù)增加，黃酮提取量有所下降，當(dāng)提取劑用量在50～90 mL/g 范圍內(nèi)時(shí)，提取量較高。

2.2 超聲波法提取無梗五加果黃酮響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

將表3試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸擬合，得到回歸方程如下：Y=40.85+0.59A+2.40B-9.32C-0.99AB-0.15AC-1.43BC-3.19A2-1.77B2+2.15C2。

表3 響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表4方差分析及顯著性檢驗(yàn)結(jié)果可知，該回歸方程模型影響極顯著(P<0.000 1)，回歸模型的R2=0.984 6，說明該模型能夠解釋98.46%的變化，回歸方程失擬項(xiàng)檢驗(yàn)不顯著(P=0.064 5>0.05)，說明所得回歸方程有較好的準(zhǔn)確度和可靠性，擬合度良好，可用該模型分析和預(yù)測無梗五加果黃酮超聲提取的結(jié)果?；貧w方程系數(shù)的顯著性分析結(jié)果表明，各因素對黃酮提取量的影響程度排序?yàn)樘崛┯昧?超聲提取時(shí)間>乙醇濃度(C>B>A)，方程的一次項(xiàng)提取時(shí)間(B)、料液比(C)對響應(yīng)值的影響極顯著；二次項(xiàng)A2對總黃酮含量的影響極顯著，二次項(xiàng)B2、C2對響應(yīng)值的影響顯著。綜上所述，單個(gè)試驗(yàn)因素對黃酮提取量的影響并非只是線性關(guān)系。

2.3 超聲波法提取無梗五加果黃酮響應(yīng)曲面圖與等高線圖分析

由圖4可知，隨乙醇濃度的不斷增大，黃酮提取量先增高后下降(圖4-a、圖4-b)；而當(dāng)提取劑用量不斷增加時(shí)，黃酮提取量不斷下降(圖4-b、圖4-c)； 黃酮提取量隨著超聲提取時(shí)間的不斷增加，則呈現(xiàn)先增加后趨于平穩(wěn)的趨勢(圖 4-a、圖4-c)。由此可見，各因素之間沒有明顯的交互作用。如果某個(gè)響應(yīng)曲面坡度非常陡峭，則表明響應(yīng)值對于處理?xiàng)l件的改變非常敏感[14]。從響應(yīng)曲面坡度來看，黃酮提取量對于提取劑用量的改變最敏感，其次是超聲提取時(shí)間，而黃酮提取量對乙醇濃度的改變不敏感，與表4回歸模型方差分析結(jié)果一致。

表4 回歸模型方差分析

注：“*”表示在0.05水平影響顯著；“**”表示在0.01水平影響顯著。

利用響應(yīng)面分析得到最佳提取工藝預(yù)測值，即乙醇濃度為29.21%，提取時(shí)間為40 min，料液比為1 g ∶50 mL，此時(shí)黃酮提取量理論值可達(dá)54.37 mg/g。將此提取工藝運(yùn)用到實(shí)際操作當(dāng)中，優(yōu)化參數(shù)，即提取濃度為30%，提取時(shí)間為 40 min，料液比為1 g ∶50 mL，時(shí)，實(shí)際的黃酮提取量為 54.21 mg/g，達(dá)到預(yù)期值的99.71%。

2.4 無梗五加果黃酮提取物組成的高效液相色譜分析

本試驗(yàn)采用梯度洗脫條件對無梗五加果黃酮組分進(jìn)行了分離。圖5顯示，標(biāo)準(zhǔn)品蕓香苷、金絲桃苷、槲皮素的出峰保留時(shí)間分別為26.602、27.343、42.873 min。由圖6可以看出，樣品在保留時(shí)間分別為26.704、27.450、42.977 min處出峰，與標(biāo)準(zhǔn)品蕓香苷、槲皮素、金絲桃苷出峰時(shí)間基本一致。馮勝等采用單一成分測定的高效液相色譜法分別對無梗五加果中的蕓香苷、槲皮素和金絲桃苷含量進(jìn)行了測定，結(jié)果表明，無梗五加果中含有金絲桃苷、蕓香苷、槲皮素，但后兩者的含量較低[18]， 從本試驗(yàn)的液相色譜圖出峰結(jié)果看， 與其研究結(jié)果相同。

2.5 無梗五加果黃酮提取物的自由基清除活性的測定和比較

由圖7可以看出，在所考察濃度范圍內(nèi)，無梗五加果黃酮提取物對羥自由基的清除活性最強(qiáng)，對DPPH自由基的清除活性則隨其濃度增加而明顯增強(qiáng)，當(dāng)濃度較低時(shí)，其自由基清除活性為三者中最弱的，但當(dāng)濃度接近0.4 mg/mL時(shí)，其自由基清除活性已超過對超氧陰離子自由基的清除活性。

3 結(jié)論

本研究在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法對無梗五加果黃酮類化合物超聲波提取工藝進(jìn)行了參數(shù)的優(yōu)化，并結(jié)合實(shí)際試驗(yàn)操作條件，最終確定最優(yōu)的操作工藝參數(shù)為乙醇濃度30%，料液比1 g ∶50 mL，提取時(shí)間40 min，實(shí)際提取量為54.21 mg/g，達(dá)到預(yù)期值的99.71%。

對于提取后的無梗五加果黃酮提取物，通過與標(biāo)準(zhǔn)品(對照)保留時(shí)間進(jìn)行比較，利用高效液相色譜法進(jìn)行定性分析，確定其黃酮類組成包括蕓香苷、金絲桃苷、槲皮素。

在所考察濃度范圍內(nèi)(0.05～0.4 mg/mL)，無梗五加果黃酮提取物對羥基自由基的清除活性最強(qiáng)，對DPPH自由基的清除活性隨濃度增加而增強(qiáng)的趨勢最為明顯。