江亞 詹俊鋒 王林 劉群 劉鍇 陳燕 卞育俊 吳剛 楊祖華*

1. 合肥市第三人民醫(yī)院骨2科，安徽 合肥 230022 2. 安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院骨2科，安徽 合肥 230000 3. 皖南醫(yī)學院弋磯山醫(yī)院創(chuàng)傷骨科，安徽 蕪湖 241000

流行病學研究表明，隨著年齡的增加，男性股骨頸、髖部和前臂遠端的骨密度降低，尤其是50歲以后[1]。骨質疏松癥被定義為退行性骨骼疾病，其特征在于骨量減少和微結構退化，導致骨折風險增加[2]。雖然男性脆性骨折不太常見，但與女性相比，其發(fā)病率和死亡率更高[3]。雷公藤多甙已被廣泛用于治療類風濕性關節(jié)炎、腎病綜合征、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和強直性脊柱炎等各種疾病[4-6]。雷公藤內酯醇是雷公藤多甙的主要成分，以其抗炎和免疫抑制活性而聞名[7]。最近，雷公藤內酯的心血管保護和抗腫瘤特性引起了研究人員的注意，此外，雷公藤也因其對其他病理狀況的潛在有益作用而引起研究人員的注意[8]。最近的研究表明，雷公藤內酯醇能夠通過抑制破骨細胞發(fā)育所需的RANKL誘導的NF-κB活化來抑制破骨細胞形成，進一步研究表明雷公藤內酯醇可以預防大鼠模型中鈦顆粒引起的局部骨質疏松癥的作用[8]。

基于上述所述，雷公藤內酯顯示出對骨丟失疾病的潛在影響。然而，雷公藤內酯對治療男性骨質疏松癥的潛在治療作用尚未被研究。因此，筆者進行了這項體內研究觀察雷公藤內酯對睪丸切除雄性大鼠骨丟失的保護作用。

1 材料和方法

1.1 動物和治療

3月齡體重230～260 g雄性Sprague-Dawley大鼠，購自上海動物史萊克公司。大鼠適應飼養(yǎng)1周后，將30只大鼠隨機分為3組即對照組(Sham組)、睪丸切除組(CON組)和雷公藤內酯治療組(LGT組)，每組 10大鼠。睪丸切除組和雷公藤內酯治療組雙側睪丸均被切除，而對照組陰囊被打開但睪丸被保留。雷公藤內酯治療組術后大鼠腹腔注射上海純優(yōu)生物提供的雷公藤內酯醇15μg/(kg·d)，對照組和睪丸切除組每日皮下注射等量生理鹽水(0.9%氯化鈉的雙蒸水)，治療共12周。所有實驗期間大鼠均飼養(yǎng)在23 ℃恒溫條件下12 h光暗循環(huán)的房間中，且所有大鼠都可以自由飲水和標準的嚙齒動物飲食。治療結束后，處死所有大鼠。當大鼠處于麻醉狀態(tài)時通過心臟穿刺收集血液，并收集左側脛骨進行分析。

1.2 Micro-CT掃描

通過Micro-CT(SkyScan 1176，Bruker-MicroCT，Kontich，比利時)將每組5只大鼠用于測量脛骨近端中的小梁骨結構。在相同條件(分辨率：18 mm，源電壓：65 kV，源電流：385 μA，旋轉步驟：0.7°)下掃描所有骨骼。對整個脛骨進行掃描，并且對每個Micro-CT平掃圖像繪制骨小梁區(qū)域。掃描后，將Micro-CT圖像數(shù)據(jù)傳輸?shù)焦ぷ髡?，并通過Micro-CT系統(tǒng)中的軟件進行分析。評估骨小梁微結構的以下參數(shù)，如骨密度(bone mineral density，BMD)，骨體積分數(shù)、骨小梁厚度、骨小梁數(shù)目和骨小梁分離度，具體操作步驟參考文獻[9]。

1.3 骨轉換指標檢測

收集的血液以3000 rpm離心10 min以提取血清。它被存儲在-20 ℃冰箱中直到分析。 根據(jù)制造商的說明，使用酶聯(lián)免疫吸附通過中國武漢精細生物技術有限公司提供的試劑盒檢測血清1型前膠原氨基末端前肽(type 1 procollagen amino terminal propeptide，P1NP)和I型膠原羧基端肽(type I collagen carboxy terminal peptide，CTX-1)濃度的水平。

1.4 骨生物力學檢測

將包裹在氯化鈉中的右側脛骨進行生物力學測試。將樣品放置在37 ℃±0.9%氯化鈉中12 h，然后進行測試。對每個樣品在8874型號力學機進行三點彎曲測試(美國馬薩諸塞州諾伍德的Instron公司)，主載荷跨度為14.5 mm。以0.1 mm/s的位移速率將骨載荷至出現(xiàn)骨折，并測量載荷和位移。測試后，計算機記錄載荷-位移曲線，從載荷-變形曲線計算極限載荷(N)，能量(J)和剛度(N/mm)。

1.5 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 大鼠骨密度的改變

圖1 各組大鼠手術12周時脛骨骨密度注：和Sham組比較，*P<0.05；和CON組比較，#P<0.05。Fig.1 Tibia bone density at 12 weeks after surgery in all groups

手術及治療12周，3組大鼠脛骨的骨密度見圖1，切除睪丸后12周，CON組較Sham組大鼠的骨密度顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；術后使用雷公藤治療的LGT組其骨密度較CON組顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；這表明雷公藤對去睪丸雄性大鼠的骨密度有一定的保護作用。

2.2 Micro-CT檢測結果

手術12周時大鼠的脛骨Mciro-CT掃描結果見圖2，微觀參數(shù)見圖3。與Sham組相比， CON組的脛骨骨量和小梁厚度顯著降低(P<0.05)；CON組的小梁間距增加(P<0.05)，而LGT的上述指標明顯優(yōu)于CON組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。骨組織形態(tài)計量學參數(shù)顯示，LGT對去卵巢大鼠脛骨骨量有保護作用。

圖3 治療12周后大鼠脛骨微觀參數(shù)比較注：和Sham組比較，*P<0.05；和CON組比較，#P<0.05。Fig.3 Microscopic parameters of tibia in rats after 12 weeks of treatment

2.3 生物力學性能

生物力學測試獲得的數(shù)據(jù)見圖4，Sham組具有最高的極限載荷、能量和剛度；與CON組比較，LGT組極限載荷、能量和剛度明顯增加，比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖2 治療12周后大鼠脛骨Micro-CT掃描結果Fig.2 Micro-CT scans of tibia in rats after 12 weeks of treatment

2.4 治療后大鼠血清CTX-1和P1NP的影響

治療后大鼠血清CTX-1和P1NP的變化見圖5。與Sham組比較，CON和LGT組的CTX-1和P1NP顯著增加(P<0.05)。 LGT組的CTX-1和P1NP較CON組明顯降低，比較差異有統(tǒng)計學(P<0.05)。

3 討論

圖4 治療對大鼠股骨生物力學的影響注：和Sham組比較，*P<0.05；和CON組比較，#P<0.05。Fig.4 Effects of treatment on femur biomechanics

圖5 治療對大鼠血清CTX-1和P1NP的影響注：和Sham組比較，*P<0.05；和CON組比較，#P<0.05。Fig.5 Effects of treatment on serum CTX-1 and P1NP.

在目前的研究中，本研究結果表明腹腔注射雷公藤內酯能夠抑制破骨細胞，從而防止老年大鼠脛骨骨質流失和改善小梁微結構。老年性骨質疏松癥正在成為一個公共衛(wèi)生問題，因為它導致脆性骨折增加，并伴隨高昂的醫(yī)療和社會經濟成本，亟需有效的策略來對抗這種疾病。然而，與年齡相關的骨丟失和微結構退化的潛在分子機制仍然知之甚少。許多年齡相關的變化與炎癥狀態(tài)的升高相關，炎癥狀態(tài)的升高表明炎癥細胞因子水平升高，如TNF-α和IL-6。此外，以前的研究表明，炎癥在年齡相關性骨丟失的病理學中也發(fā)揮重要作用[10]。更高的循環(huán)C-反應蛋白被認為是全身炎癥的敏感標志物，與老年女性的骨密度降低相關[11]。此外，許多促炎細胞因子如IL-1和IL-6被證明具有促進破骨細胞分化、活化和骨吸收的能力[12]。此外，流行病學研究顯示，在各種炎癥條件下發(fā)生骨質疏松癥的風險增加。上述結果支持炎癥顯著促成老年性骨質疏松癥發(fā)病機理的理論。因此，抗炎可能是治療老年骨質疏松癥的潛在治療靶點。雷公藤內酯是一種炎癥抑制劑，其抗炎活性已有文獻報道。由于這種抗炎性質，雷公藤內酯被廣泛用于治療各種疾病，如類風濕性關節(jié)炎、腎病綜合征和癌癥。巧合的是，這些疾病與骨質流失有關，導致患者出現(xiàn)額外的并發(fā)癥。因此，研究雷公藤甲素對骨骼的影響是有意義的。

一些體外研究顯示，雷公藤內酯具有抑制破骨細胞分化和功能的作用[8]。此外，以前的研究還表明，雷公藤內酯醇能夠通過抑制膠原誘導的小鼠中的破骨細胞分化和形成來預防骨質破壞和骨吸收[8]。另外，雷公藤內酯被證明具有減弱鈦顆粒誘導的骨溶解的能力[8]。以上結果表明雷公藤甲素可能對預防骨質流失有潛在的作用。然而，就筆者所知，本研究首先揭示了雷公藤內酯在預防雄性大鼠去除睪丸復制的骨丟失和改善骨結構的有益作用。為了確定骨重塑中的變化是否可以解釋雷公藤內酯對去除睪丸所致骨丟失的保護作用，筆者對脛骨進行了Mirco-CT分析。在本研究中，雷公藤甲素對骨小梁有顯著的影響。本研究確定雷公藤對去除睪丸所致雄性骨質疏松癥大鼠骨丟失確切的保護作用。

同時，用雷公藤內酯醇治療后，破骨細胞活性顯著降低，從骨代謝指標CTX-1和P1NP水平降低可以反映。這些結果與有些學者的研究結果一致，表明雷公藤內酯能夠抑制鈦顆粒介導的骨溶解大鼠模型中的破骨細胞活性。一般認為骨質疏松癥由于破骨細胞和成骨細胞的活性之間的失衡而發(fā)生骨丟失。因此，本研究表明雷公藤內酯促進脛骨骨密度，增加骨強度，并可能通過抑制破骨細胞活性改善大鼠骨組織。本研究顯示，雷公藤甲素具有抑制破骨細胞活性的能力。盡管雷公藤內酯被證明對許多疾病具有許多藥理學作用，但其相關的不良反應使其不能在臨床實踐中廣泛使用。然而，越來越多的研究表明雷公藤內酯誘導的毒性取決于劑量和給藥時間。研究報道，體內雷公藤內酯的最小毒性劑量為28 d為50 μg/(kg·d)或49 d為40 μg/(kg·d)[13]。本研究中使用的雷公藤內酯劑量為15 μg/(kg·d)，84 d，低于最小毒性劑量。因此本研究中使用的雷公藤甲素劑量為15 μg/ (kg·d)，84 d可能被認為是中等和安全的。

總之，在大鼠模型中，雷公藤內酯醇以15 μg/(kg·d)的劑量持續(xù)84 d似乎對于治療性腺功能下降相關的骨丟失是安全和有效的。此外，雷公藤內酯的骨保護作用似乎部分通過降低骨轉換來介導的?；谀壳暗难芯?，雷公藤內酯可能具有治療老年男性骨質疏松癥的潛力。