王保國(guó)

(河北省廊坊市第四人民醫(yī)院 普外科, 河北 廊坊, 065700)

在惡性腫瘤患者中，結(jié)腸、直腸癌是較為常見(jiàn)的消化道類疾病。趨化因子作為一種腫瘤分子標(biāo)志物，其檢測(cè)具有操作簡(jiǎn)便、價(jià)格較低以及創(chuàng)傷較小等優(yōu)勢(shì)[1]。相關(guān)研究[2]顯示，趨化因子是細(xì)胞因子超家族的一種，具有控制細(xì)胞向炎癥定向遷移的能力，趨化因子的功能由相應(yīng)受體介導(dǎo)，二者的相互作用控制著各種免疫細(xì)胞在循環(huán)系統(tǒng)及組織間的定向遷移。趨化因子受體CCR4在某些腫瘤細(xì)胞中呈高表達(dá)，與多種腫瘤的生物學(xué)行為有關(guān)，其配體為CC趨化因子配體17(CCL17)，配體對(duì)受體的吸引可以促進(jìn)CCR4表達(dá)陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞循配體濃度梯度定向轉(zhuǎn)移，可能形成了腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制[3]。本研究檢測(cè)趨化因子受體CCR4在結(jié)腸、直腸癌中的表達(dá)情況，探討趨化因子體CCR4在結(jié)腸、直腸癌中的相關(guān)作用，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年1—2018年2月廊坊市第四人民醫(yī)院結(jié)腸、直腸癌原發(fā)灶外科手術(shù)標(biāo)本41例用作免疫組織化學(xué)分析，設(shè)為實(shí)驗(yàn)組。選取同期良性結(jié)腸直腸腫瘤患者30例，設(shè)為對(duì)照組。趨化因子受體CCR4在結(jié)腸、直腸癌中的相關(guān)功能采用分組對(duì)比分析，分組依據(jù)為臨床病理相關(guān)因素。納入標(biāo)準(zhǔn): ① 所有標(biāo)本均經(jīng)病理證實(shí)為腫瘤和非腫瘤組織; ② 所有入選患者未接受過(guò)放化療; ③ 經(jīng)患者本人及家屬同意簽字確認(rèn)[4]。排除標(biāo)準(zhǔn): ① 排除接受過(guò)放化療的患者; ② 排除未經(jīng)病理證實(shí)的患者標(biāo)本[5]。

1.2 方法

儀器與試劑: Systems cxcr4抗體購(gòu)自德國(guó); 免疫組化試劑盒為KIT-9901; 檸檬酸組織抗原修復(fù)液、PBS、DAB均購(gòu)自福州邁新; Trizol、焦碳酸二乙酯(DEPC)、K1622、EP0404、R0191均購(gòu)自法國(guó)[7]。CXCR4引物序列: 上游引物5′-ACAGCAGGCA CAGACAGGCA GU-3′(表達(dá)方式1); 下游引物5′-UAGCAGCGGG AACAGUUCUGTGG-3′(表達(dá)方式2)。手術(shù)過(guò)程中取結(jié)腸直腸腫瘤組織，并置入液氮中冷存。

1.3 測(cè)定方法

本研究采用免疫組化二步法行免疫組化染色。RT-PCR法所用的試劑[8]: 0.1% DEPC溶液、Trizol、氯仿、異丙醇、DEPC水配制的75%乙醇、RNase-free的純水，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、dNTP mix, Taq酶，buffer、凝膠電泳緩沖液等。儀器、耗材[9]: 離心管、PCR管、PCR儀、冷凍離心機(jī)、水平電泳槽、電泳儀等。具體方法、步驟依據(jù)說(shuō)明書執(zhí)行。免疫組化二步法實(shí)驗(yàn)步驟: 預(yù)處理: 雙蒸水(ddH2O)或PBS洗，利用二四苯梯度酒精、石蠟切片，脫蠟、水化，再行冰凍切片，再行烤片，溫度控制在37 ℃, 以此作為抗原修復(fù)。3%過(guò)氧化氫(H2O2)，孵育10 min, 交內(nèi)源性過(guò)氧化物酶去除。DAB顯色，復(fù)染，脫水與透明，再行封片。

1.3 評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

比較免疫組化二步法與RT-PCR法檢測(cè)趨化因子受體CCR4在結(jié)腸、直腸癌組織的陽(yáng)性率。比較免疫組化二步法、RT-PCR法檢測(cè)趨化因子受體CCR4與臨床各病理因素的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 兩種檢測(cè)方法檢測(cè)趨化因子受體CCR4在結(jié)腸、直腸癌組織的陽(yáng)性率比較

實(shí)驗(yàn)組中免疫組化法檢測(cè)陽(yáng)性患者比例顯著高于對(duì)照組中免疫組化法檢測(cè)陽(yáng)性患者比例(P<0.05); 實(shí)驗(yàn)組中RT-PCR法檢測(cè)陽(yáng)性患者比例顯著高于對(duì)照組中RT-PCR法檢測(cè)陽(yáng)性患者比例(P<0.05); 實(shí)驗(yàn)組PCR條帶灰度比值顯著高于對(duì)照組PCR條帶灰度比值(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩種檢測(cè)方法檢測(cè)趨化因子受體CCR4在結(jié)腸、直腸癌組織的陽(yáng)性率比較

2.2 兩組檢測(cè)方法檢測(cè)趨化因子受體CCR4與臨床各病理因素的關(guān)系

結(jié)腸癌腫瘤組織中CCR4陽(yáng)性檢測(cè)表達(dá)水平在性別、不同年齡、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移、部位等臨床病理因素?zé)o顯著差異(P>0.05)。結(jié)腸癌腫瘤組織中CCR4陽(yáng)性檢測(cè)表達(dá)水平中, Duke分期存在顯著差異(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 兩種檢測(cè)方法檢測(cè)趨化因子受體CCR4與臨床各病理因素的關(guān)系

3 討 論

CCL14-CCR4通道與腫瘤學(xué)生物學(xué)行為的研究[10-17]證實(shí)，趨化因子及其受體既能通過(guò)趨化、活化免疫細(xì)胞后抑制血管增殖而起到抗腫瘤的作用，又能通過(guò)刺激腫瘤生長(zhǎng)、趨化瘤細(xì)胞以及促進(jìn)血管增殖和促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)降解而達(dá)到促腫瘤生長(zhǎng)浸潤(rùn)、侵犯、轉(zhuǎn)移的效應(yīng)。由此可見(jiàn)，趨化因子受體及配體系統(tǒng)與腫瘤的關(guān)系具有雙向性，且趨化因子受體及其配體網(wǎng)絡(luò)調(diào)控受諸多因素的影響，腫瘤的形成和發(fā)展中趨化因子網(wǎng)絡(luò)的參與是復(fù)雜而精細(xì)的。合理的應(yīng)用恰當(dāng)?shù)内吇蜃踊蚱涫荏w可有效地誘導(dǎo)、活化、趨化免疫效應(yīng)細(xì)胞，導(dǎo)向殺傷腫瘤細(xì)胞。趨化因子中和抗體、受體拮抗劑、抑制劑也可阻斷異常的信號(hào)傳導(dǎo)通路[18-20]。

本研究結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組免疫組化法檢測(cè)陽(yáng)性率39.02%, 顯著高于對(duì)照組免疫組化法陽(yáng)性檢測(cè)率13.33%(P<0.05); 實(shí)驗(yàn)組RT-PCR法陽(yáng)性檢測(cè)率43.90%, 顯著高于對(duì)照組RT-PCR法陽(yáng)性檢測(cè)率10.00%(P<0.05); 實(shí)驗(yàn)組PCR條帶灰度比值(0.548 1±0.062 4), 顯著高于對(duì)照組PCR條帶灰度比值(0.341 7±0.069 6) (P<0.05)。結(jié)腸癌腫瘤組織中CCR4陽(yáng)性檢測(cè)表達(dá)水平在性別、不同年齡、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移、部位等臨床病理因素?zé)o顯著差異(P>0.05)。結(jié)腸癌腫瘤組織中CCR4陽(yáng)性檢測(cè)表達(dá)水平中Duke分期存在顯著差異(P<0.05)?？傊±頇z測(cè)可提示患者Duke分期情況，結(jié)腸癌腫瘤組織中CCR4在患者機(jī)體免疫調(diào)節(jié)中具有重要作用。