張璐莎，陳 璐，李春曉，尤星宇，房志銳，宋 敏，Joel Wake Coffie， 張麗媛，王 虹

(天津中醫(yī)藥大學(xué)天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，天津市中藥藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，方劑學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 301617)

外周動脈疾病(peripheral artery disease,PAD) 是由于動脈粥樣硬化導(dǎo)致周圍動脈閉塞或狹窄而引起的缺血性疾病。據(jù)估計(jì)，全世界有超過2 億人患有PAD，在老年人中發(fā)病尤其普遍，在55歲以上的人群中約有24%～32%患此病，患者運(yùn)動能力明顯下降，甚至面臨截肢的危險(xiǎn)，因此PAD是全球性的健康負(fù)擔(dān)[1-3]。PAD是一種復(fù)雜的具有損傷性炎癥反應(yīng)的疾病，它包括激活免疫細(xì)胞的過度炎癥反應(yīng)以及促炎性細(xì)胞因子的釋放，其將穩(wěn)定斑塊轉(zhuǎn)化為易損的不穩(wěn)定斑塊，進(jìn)而加重肢體缺血損傷，越來越多的證據(jù)表明，炎癥在PAD的病理生理學(xué)中起到關(guān)鍵作用[4-5]。腦心通膠囊(Naoxintong capsule, NXT ) 由16味中藥組成，具有活血化瘀、行氣止痛之功效，是臨床應(yīng)用的大復(fù)方，其中丹參、當(dāng)歸、紅花、赤芍具有活血化瘀功效，黃芪具有補(bǔ)氣升陽、助血行氣之功效，多個(gè)成分協(xié)同作用，最大限度地發(fā)揮各自的藥理作用。NXT在臨床上廣泛應(yīng)用于缺血性心腦血管疾病的治療及二級預(yù)防，取得良好療效，但其抗缺血組織損傷炎性反應(yīng)機(jī)制尚不明確。本研究采用小鼠后下肢缺血(hind limb ischemia, HLI)模型，探討NXT對外周缺血組織炎癥反應(yīng)的作用及其可能的作用機(jī)制。

1 材料

1.1實(shí)驗(yàn)動物52只SPF級健康ICR小鼠，♂，體質(zhì)量 ( 30±2 ) g，8 周齡，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK (京) 2012-0001。實(shí)驗(yàn)動物于天津市中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)放射工程研究所動物房中分籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食，飼養(yǎng)溫度(22～25)℃，相對濕度40%～60% 。

1.2藥物與試劑NXT超微粉(陜西步長制藥有限公司)。三溴乙醇(avertin，美國Sigma)；流式抗體PE anti-F4/80、APC-Cy7 anti-Ly-6G、PerCP anti-CD45 (美國Becton, Dickinson and Company，貨號分別為565410、560600、561047)；0.9%氯化鈉注射液(山東科倫藥業(yè)有限公司)；實(shí)驗(yàn)用水為去離子水；Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (貨號：04897030001)、FastStart Universal SYBR Green Master (ROX) (貨號：04913914001)，均購自美國Roche公司。

1.3儀器體式顯微鏡LEICA S8APO(德國Leica公司)；流式細(xì)胞儀(美國BD公司)；64R型低溫高速離心機(jī)(美國Beckman公司)；小動物手術(shù)器械包(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；COMPAC5小動物多功能麻醉機(jī)(美國VETEQUIP)；7500 Real-time PCR(美國Applied Biosystems)。

2 方法

2.1單側(cè)后肢缺血模型(hindlimbischemia,HLI)的建立根據(jù)文獻(xiàn)方法，建立小鼠單側(cè)后肢缺血模型。在腹部側(cè)面和腹股溝韌帶表面形成5 mm的橫向切口，以6/0號縫合線結(jié)扎動脈血管上下兩端，在結(jié)扎線之間橫切血管，縫合皮膚。術(shù)后血流量降低到術(shù)前的10%以下，且血流的頻譜發(fā)生明顯改變，以此作為后肢缺血模型成功建立的標(biāo)準(zhǔn)，然后將小鼠置于37℃電熱毯上直至蘇醒，不符合此標(biāo)準(zhǔn)的動物剔除。

2.2實(shí)驗(yàn)分組與給藥按照隨機(jī)雙盲的方法，將動物分成3組：假手術(shù)組、模型組、給藥組(模型+NXT 700 mg·kg-1·d-1)，每組16～18只。術(shù)后1 h，假手術(shù)組與模型組灌胃生理鹽水0.01 mL·g-1，給藥組灌胃NXT，每天1次，3 d后取材。

2.3流式細(xì)胞術(shù)鑒定中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞參考文獻(xiàn)方法[6]，從小鼠腓腸肌中分離出白細(xì)胞，用相應(yīng)的流式抗體標(biāo)記后，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的陽性比例。

2.4定量RT-PCR法檢測Emr1、TNF-α、IL-1βmRNA的表達(dá)使用TRIzol從小鼠腓腸肌中提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，使用FastStart Universal SYBR? Green Master (ROX) 進(jìn)行qRT-PCR，檢測Emr1 (F4/80)、TNF-α、IL-1β的表達(dá)。F4/80正向引物: 5′-CTGCACCTGTAAACGAGGCTT-3′, 反向引物: 5′-TTGAAAGTTGGTTTGTCCATTGC-3′；TNF-α正向引物: 5′-AGAAACACAAGATGCTGGGACAGT-3′,反向引物: 5′-CCTTTGCAGAACTCAGGAATGG-3′; IL-1β正向引物: 5′-GCAACTGTTCCTGAACTCAACT-3′, 反向引物: 5′-ATCTTTTGGGGTCCGTCAACT-3′。

2.5蛋白芯片檢測相關(guān)蛋白的變化依據(jù)蛋白芯片(R&D公司，貨號：ARY028)說明書，進(jìn)行后續(xù)操作。

3 結(jié)果

3.1NXT對HLI小鼠腓腸肌組織中中性粒細(xì)胞數(shù)目的影響構(gòu)建小鼠單側(cè)HLI損傷模型，術(shù)后d 3采用流式細(xì)胞術(shù)檢測腓腸肌中中性粒細(xì)胞的數(shù)量。用Cell Quest軟件建立獲取模板 FSC/SSC雙參數(shù)散點(diǎn)圖，設(shè)P1門選定腓腸肌組織中除細(xì)胞碎片外的所有細(xì)胞為目的細(xì)胞 (Fig 1A )。建立分析模板APC-Cy7-Ly6G/PE-F4/80熒光雙參數(shù)十字門散點(diǎn)圖，橫坐標(biāo)代表PE-F4/80熒光強(qiáng)度，縱坐標(biāo)代表APC-Cy7-Ly6G熒光強(qiáng)度，分析腓腸肌中中性粒細(xì)胞陽性細(xì)胞比例，中性粒細(xì)胞為表達(dá)Ly6G陽性、F4/80陰性的細(xì)胞，如Fig 1C Q1門所示。術(shù)后3 d(Fig 1B、1C)，與假手術(shù)組相比，模型組Ly6G+F4/80-細(xì)胞數(shù)量明顯上調(diào) (P<0.01)；與模型組相比，NXT組Ly6G+F4/80-細(xì)胞數(shù)量明顯下調(diào) (P<0.01)。結(jié)果提示，NXT在術(shù)后3 d時(shí)可以下調(diào)中性粒細(xì)胞的數(shù)量。

3.2NXT對HLI小鼠腓腸肌組織中巨噬細(xì)胞數(shù)目的影響術(shù)后d 3采用流式細(xì)胞術(shù)檢測腓腸肌中巨噬細(xì)胞的數(shù)量，同樣用Cell Quest軟件建立獲取模板FSC/SSC雙參數(shù)散點(diǎn)圖，設(shè)P1門選定腓腸肌組織中除細(xì)胞碎片外的所有細(xì)胞為目的細(xì)胞(Fig 2A)。再用該軟件建立分析模板PerCp-CD45/PE-F4/80熒光雙參數(shù)十字門散點(diǎn)圖，橫坐標(biāo)代表PE-F4/80熒光強(qiáng)度，縱坐標(biāo)代表PerCp-CD45熒光強(qiáng)度，分析腓腸肌中巨噬細(xì)胞陽性細(xì)胞比例，巨噬細(xì)胞為同時(shí)表達(dá)F4/80、CD45的雙陽性細(xì)胞，如Fig 2C中Q2-1所示。術(shù)后3 d，與假手術(shù)組相比，模型組CD45+F4/80+細(xì)胞數(shù)量明顯上調(diào) (P<0.01)；與模型組相比，NXT組CD45+F4/80+細(xì)胞數(shù)量明顯下調(diào) (P<0.01)，可知NXT在術(shù)后3 d時(shí)可以下調(diào)巨噬細(xì)胞的數(shù)量(Fig 2A-2C)。Emr1基因是指征巨噬細(xì)胞的標(biāo)志性基因，術(shù)后3 d通過qPCR方法檢測腓腸肌中Emr1表達(dá)水平。結(jié)果顯示：與流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果一致，術(shù)后3 d，與假手術(shù)組相比，模型組Emr1 mRNA表達(dá)明顯上調(diào) (P<0.01)；與模型組相比，NXT組Emr1的表達(dá)明顯下調(diào) (P<0.01) (Fig 2D)。以上結(jié)果表明，NXT在后下肢缺血后3 d時(shí)可以下調(diào)巨噬細(xì)胞的數(shù)量。

3.3NXT對炎癥信號通路中IL-1β、TNF-αmRNA表達(dá)的影響IL-1β、TNF-α是參與炎癥的主要細(xì)胞因子，本研究通過qPCR方法檢測NXT加藥處理后腓腸肌中IL-1β和TNF-α的表達(dá)水平。Fig 3結(jié)果顯示，術(shù)后3 d腓腸肌組織中，與假手術(shù)組相比，模型組IL-1β、TNF-α mRNA表達(dá)上調(diào)(P<0.05，P<0.01)；與模型組相比，NXT組IL-1β、TNF-α mRNA表達(dá)下調(diào) (P<0.05，P<0.01)。 結(jié)果顯示，NXT可以下調(diào)IL-1β、TNF-α的基因轉(zhuǎn)錄水平。

3.4NXT對炎癥相關(guān)蛋白表達(dá)的影響為了進(jìn)一步闡釋NXT抗炎的作用機(jī)制，術(shù)后d 3取手術(shù)側(cè)腓腸肌組織進(jìn)行組織蛋白提取，利用小鼠細(xì)胞因子陣列試劑盒 (Proteome ProflerTMArray )進(jìn)行檢測。如Fig 4所示，F(xiàn)ig 4A黑色框中顯示NXT給藥后表達(dá)上調(diào)的蛋白，與模型組相比，NXT組表達(dá)上調(diào)的蛋白有CCL17、CCL22、白介素1受體拮抗劑(interleukin 1 receptor antagonist，IL-1ra)、IL-4、IL-13、IL-10，量化圖見Fig 4B。其中，CCL17與CCL22是M2a型巨噬細(xì)胞的標(biāo)志物[7-8]，IL-4誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2a型轉(zhuǎn)化，M2a型巨噬細(xì)胞促進(jìn)組織修復(fù)或組織重塑[9]。提示NXT治療后，M2a型巨噬細(xì)胞的表達(dá)量較模型組增多可能與IL-4、CCL17、CCL22表達(dá)量增多有關(guān)。

Fig 1 Effect of NXT on neutrophil inhibition 3 d after HLI injury n=5～6)

Fig 4C黑色框顯示NXT給藥后表達(dá)下調(diào)的蛋白，與模型組相比，NXT組表達(dá)下調(diào)的蛋白7個(gè)，量化圖見Fig 4D。其中，CCL5、CXCL9蛋白是M1促炎型巨噬細(xì)胞的生物標(biāo)志[8]，參與調(diào)控白細(xì)胞的趨化活性及炎性反應(yīng)等各種生理功能，TNF-α是體內(nèi)重要的炎性因子，參與M1型巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)化[10]。NXT治療后，CCL5、CXCL9、TNF-α等的表達(dá)量下降，提示NXT組M1巨噬細(xì)胞較模型組表達(dá)量降低。

3.5差異表達(dá)蛋白的生物信息學(xué)分析進(jìn)一步對蛋白芯片結(jié)果進(jìn)行分析，應(yīng)用panther和string查詢差異蛋白的功能及相互關(guān)系。Fig 5A顯示差異蛋白所涉及到的信號通路主要有介導(dǎo)炎癥的趨化因子和細(xì)胞因子信號通路、白介素信號通路，這些通路可能參與NXT抗炎藥理作用的過程，同時(shí)提示NXT抗炎的作用機(jī)制可能與趨化因子和細(xì)胞因子信號通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)相關(guān)。為了進(jìn)一步研究蛋白之間的相互關(guān)系，通過string分析上調(diào)和下調(diào)的差異蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果顯示：NXT加藥處理后，表達(dá)上調(diào)的蛋白相互作用包括細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體之間的相互作用，以及IL-4、IL-13調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的激活，即調(diào)節(jié)M2a的激活，如Fig 5B所示；NXT加藥處理后，表達(dá)下調(diào)的蛋白相互作用包括參與炎癥反應(yīng)以及調(diào)節(jié)細(xì)胞分化，如Fig 5C所示，經(jīng)過查閱文獻(xiàn)，其中介導(dǎo)細(xì)胞分化的CCL5、CXCL9、IL-5、TNF-α參與M1型巨噬細(xì)胞的表達(dá)與募集。差異蛋白參與的通路以及相互作用進(jìn)一步表明，與模型組相比，NXT組抗炎作用可能與M1型巨噬細(xì)胞表達(dá)減少，M2a型巨噬細(xì)胞增多有關(guān)。

Fig 2 Effect of NXT on macrophage inhibition 3 d after HLI injury n=5～6)

Fig 3 Expression of IL-1β and TNF-α mRNA in skeletal muscles down-regulated by NXT n=3)

4 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NXT可以減少中性粒細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞在損傷部位的積累，降低巨噬細(xì)胞標(biāo)志性基因Emr1的表達(dá)，降低炎性因子TNF-α、IL-1β的表達(dá)，提示NXT能夠降低缺血后肢的炎性損傷，為后續(xù)組織修復(fù)提供良好的微環(huán)境。蛋白芯片結(jié)果提示，NXT在后下肢缺血模型中降低炎癥反應(yīng)，可能是通過調(diào)節(jié)CCL5、CXCL9、IL-4、CCL17、CCL22等上下游蛋白，介導(dǎo)M1型巨噬細(xì)胞向M2a型巨噬細(xì)胞之間的轉(zhuǎn)變來實(shí)現(xiàn)，后期本課題組將對以上假說進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

從炎癥消退到組織修復(fù)的過渡階段，炎性介質(zhì)可能會隨著血運(yùn)重建，繼續(xù)參與后續(xù)的修復(fù)反應(yīng)。慢性炎癥是血運(yùn)重建中的關(guān)鍵障礙，其在外周動脈疾病中損害內(nèi)源性血管再形成，并限制血運(yùn)重建治療的有效性，一些炎癥介質(zhì)的參與導(dǎo)致臨床上治療外周動脈疾病效果不佳[11]。由此可見，炎癥與缺血性疾病有重要聯(lián)系。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NXT可以降低損傷部位中性粒細(xì)胞的募集，當(dāng)創(chuàng)傷發(fā)生后，最先到達(dá)炎癥部位的有核細(xì)胞是中性粒細(xì)胞，中性粒細(xì)胞滲出血管并聚集到損傷部位，可通過釋放細(xì)胞因子、蛋白水解酶等，引起機(jī)體正常組織的損傷，并可能延緩炎癥反應(yīng)的解決過程。 Kyriakides等[12]結(jié)果證明，中性粒細(xì)胞在骨骼肌損傷后還可以導(dǎo)致肌肉二次損傷，不利于肌肉再生。在后肢缺血模型中，NXT可以降低位于損傷部位的中性粒細(xì)胞數(shù)量，提示NXT可以降低中性粒細(xì)胞參與的炎癥反應(yīng)的發(fā)生。

Fig 4 Effect of NXT on related proteins 3 d after HLI injury (n=3)

同時(shí)發(fā)現(xiàn)NXT可以降低損傷部位巨噬細(xì)胞的募集，以及降低巨噬細(xì)胞的標(biāo)志性基因Emr1的表達(dá)。研究顯示[13]，巨噬細(xì)胞比率在傷后6～12 h，保持在較穩(wěn)定的低水平，傷后1 d時(shí)迅速升高達(dá)到高峰值，傷后3 d急劇減少，但仍顯示占有極少量的比率。如果巨噬細(xì)胞在損傷部位持續(xù)積累將會導(dǎo)致局部持續(xù)的炎癥，組織損傷進(jìn)一步加重，創(chuàng)傷修復(fù)就會明顯延遲，甚至無法完成修復(fù)。Emr1(F4/80)基因是單核細(xì)胞從血液到達(dá)創(chuàng)傷部位獲得的屬于巨噬細(xì)胞的一種表型。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在經(jīng)歷后肢缺血模型3 d時(shí)，NXT可以降低巨噬細(xì)胞在損傷部位的數(shù)量，降低巨噬細(xì)胞的標(biāo)志性基因Emr1的表達(dá)，提示NXT可以降低巨噬細(xì)胞在損傷部位的積累，降低巨噬細(xì)胞參與的炎癥反應(yīng)的發(fā)生。

NXT可以降低炎性因子TNF-α、IL-1β的表達(dá)。TNF-α、IL-1β由促炎型巨噬細(xì)胞分泌產(chǎn)生，TNF-α在許多炎癥性疾病中起關(guān)鍵作用；IL-1β是早期的促炎因子，IL-1β能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞通透性的增加，刺激趨化因子的釋放和大量黏附分子的表達(dá)，導(dǎo)致單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞向缺血區(qū)域的募集，擴(kuò)大炎癥反應(yīng)導(dǎo)致進(jìn)一步的損傷。本研究的蛋白芯片和qPCR結(jié)果共同表明，在后下肢缺血模型中，NXT可以降低TNF-α、IL-1β炎性因子的表達(dá)，提示NXT可以降低TNF-α、IL-1β參與的炎癥反應(yīng)的發(fā)生。

研究結(jié)果提示，NXT在組織缺血后通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變，抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生，與Wang等[14]的報(bào)道一致。此外，通過蛋白芯片與生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，此轉(zhuǎn)變可能與IL-4、CCL17、CCL22、CCL5、CXCL9、TNF-α參與的信號通路相關(guān)。體內(nèi)M1與M2處于相對平衡的狀態(tài)，研究證實(shí)巨噬細(xì)胞的損傷主要是由炎性M1巨噬細(xì)胞導(dǎo)致的，而替代激活的M2巨噬細(xì)胞是組織修復(fù)或重塑階段晚期的主要影響因素[15]，M2巨噬細(xì)胞可分為M2a (IL-4/13激活型)、M2c (IL-10激活型)。綜合蛋白芯片以及蛋白之間相互關(guān)系結(jié)果，提示在小鼠后下肢缺血后3 d時(shí)，NXT抗炎作用可能是通過誘導(dǎo)M1巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)變向M2a型巨噬細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)。

綜上所述，NXT可以通過抑制外周缺血組織促炎因子的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化發(fā)揮抗炎作用，參與調(diào)節(jié)的蛋白包括CCL5、CXCL9、TNF-α、IL-4、CCL17、CCL22，涉及趨化因子和細(xì)胞因子調(diào)節(jié)信號通路。本研究證實(shí)NXT對于治療外周動脈疾病具有一定的應(yīng)用前景，但其作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步探討。