張艷群，徐 慶，曾永聯(lián)，羅 琴，鄒海凡，譚 寧

(桂林醫(yī)學(xué)院1.藥學(xué)院、2.廣西肝臟損傷與修復(fù)分子醫(yī)學(xué)重點實驗室、3.科學(xué)實驗中心，廣西 桂林 541004)

原發(fā)性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，全國每年約有38.3萬人死于肝癌，占全球肝癌死亡總?cè)藬?shù)的51%[1]。目前，醫(yī)治HCC仍以手術(shù)為主，兼物理療法、化學(xué)藥物療法等在內(nèi)的綜合治療。臨床常用的肝癌化療藥物如蒽環(huán)類抗瘤藥等，缺乏高度的組織選擇性，在發(fā)揮療效的同時，往往產(chǎn)生較嚴(yán)重的全身性毒副作用[2]。因此，如何使化療藥物既提高腫瘤化療效果，又減輕化療藥物的毒副作用，已成為腫瘤藥物治療亟待解決的關(guān)鍵問題。

強(qiáng)心苷類(Cardiac glycosides，CGS)是一類從植物中提取的類固醇衍生物，能明顯興奮心肌細(xì)胞，目前作為心衰和心房顫動的常用治療藥物。自1960年，相繼有研究發(fā)現(xiàn)，洋地黃毒苷、地高辛、哇巴因等強(qiáng)心苷類藥物具有預(yù)防和治療腫瘤的作用[3]。Stenkvist等[4]研究表明，乳腺癌患者在使用洋地黃治療后，腫瘤轉(zhuǎn)變?yōu)榱夹缘谋壤?，且在乳房切除術(shù)5年后，使用洋地黃治療的患者乳腺癌復(fù)發(fā)率僅為對照組的10.42%。同時，Goldin等[5]在給予127位癌癥患者使用洋地黃治療后，發(fā)現(xiàn)21例癌癥死亡中僅有1例屬于洋地黃組。并且CGS能選擇性地抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡，而對正常細(xì)胞無明顯影響[6]，因而強(qiáng)心苷類化合物被認(rèn)為是一類新型的抗癌藥物。為了進(jìn)一步證實CGS抗腫瘤治療的臨床價值，美國FDA正在進(jìn)行小規(guī)模的Ⅰ期和Ⅱ期臨床試驗，結(jié)果尚未公布。本實驗采用不同濃度的毛花苷C(lanatoside C)溶液干預(yù)肝癌Huh-7細(xì)胞，研究毛花苷C對其增殖、凋亡及凋亡相關(guān)酶caspase-7活化的影響，初步探討毛花苷C對肝癌的抑制作用，為其臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株 肝癌Huh-7細(xì)胞株購自中科院上海生物科學(xué)研究所細(xì)胞資源中心。

1.1.2試劑 毛花苷C(上海旭東海普藥業(yè)有限公司，CAS：#17575-22-3)，采用嘧啶試劑作溶劑溶解毛花苷C，使其終濃度為20 g·L-1，過濾除菌后，室溫避光存放備用。DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco公司，貨號11885-076)；胎牛血清FBS(Corille公司，C1015-05)；Cell Counting Kit-8試劑(上海同仁化學(xué)研究所，CK04)；caspase-7單克隆抗體(12827)購自CST公司；抗β-actin一抗(SC-47778)購自Santa Cruz公司；Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒(上海東仁化學(xué)科技，AD10)。

1.1.3儀器 Elix3+30L+3YNERGY超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)；311氣套式CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；Infinite M200 pro Nano Quant光柵型連續(xù)波長酶標(biāo)儀(瑞士TECAN公司)；Allegra X-22R冷凍離心機(jī)(美國貝克曼庫爾特公司)；ChemiDoc XRS+凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；BD FACSAriaⅢ分選型流式細(xì)胞儀(美國BD公司)；LSM710激光共聚焦掃描顯微鏡(德國蔡司公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將Huh-7細(xì)胞接種于含支原體抗生素的改良DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，胰蛋白酶常規(guī)消化傳代，選擇處于對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.2.2細(xì)胞增殖實驗 胰酶室溫常規(guī)消化細(xì)胞后，用含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基吹打成分布均勻的單細(xì)胞懸液，按1×103個/孔接種于96孔板中，培養(yǎng)于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，細(xì)胞貼壁24 h后，加入毛花苷C使其終濃度為0.003 2、0.016、0.08、0.4、2 mg·L-1，以等體積嘧啶作為對照，同一濃度設(shè)置3個復(fù)孔，分別培養(yǎng)2 h及1、3、5、7 d后，棄去培養(yǎng)基，每孔加入CCK-8溶液100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，使用酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處吸光值。增殖抑制率/%=(對照組A450值-加藥組A450值)/對照組A450值×100%。

1.2.3克隆形成實驗 胰酶室溫常規(guī)消化細(xì)胞后，用含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基吹打成分布均勻的單細(xì)胞懸液，按1.6×103個/孔接種于6孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)于恒溫培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)10 d后加毛花苷C，使其終濃度為0.003 2、0.016、0.08、0.4、2 mg·L-1，以等體積嘧啶代替毛花苷C作為對照組，同一濃度設(shè)置3個復(fù)孔，再繼續(xù)培養(yǎng)6 d后棄去上層培養(yǎng)基，PBS輕柔洗板2次，細(xì)胞用4%多聚甲醛固定15 min，棄多聚甲醛，結(jié)晶紫溶液染色15 min，清水反復(fù)浸洗，室溫晾干，采集圖像保存后，每孔加入2 mL 10%的冰醋酸溶液溶解結(jié)晶紫，每孔再取100 μL置于96孔板中，使用酶標(biāo)儀檢測各孔560 nm波長處吸光度值，并按以下公式計算克隆抑制率[7]?？寺∫种坡?%=(對照組A560值-加藥組A560值)/對照組A560值×100%。

1.2.4細(xì)胞凋亡檢測 取處于對數(shù)期的Huh-7細(xì)胞，以1×106個細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿，培養(yǎng)24 h細(xì)胞貼壁后，加入毛花苷C，使其終濃度為0.003 2、2 mg·L-1，加等體積嘧啶作為對照組。待毛花苷C作用48 h后，消化細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液并離心，棄上清，D-PBS重懸清洗1次，離心棄上清液，1×Annexin V Binding buffer重懸細(xì)胞，并吹打混勻，加入10 μL Annexin V/FITC和10 μL PI染色液(20 mg·L-1),避光染色30 min。300目篩網(wǎng)過濾細(xì)胞懸液，使用流式細(xì)胞儀測定并采集數(shù)據(jù)[8]。并通過激光共聚焦顯微鏡采集加入毛花苷C 48 h后，以及相應(yīng)對照組Annexin V/FITC及PI染色圖像，F(xiàn)ITC檢測波長為510～550 nm。

1.2.5Western blot檢測 將Huh-7細(xì)胞室溫消化后接種于培養(yǎng)皿中，24 h貼壁后，加入毛花苷C，使其終濃度為0.003 2、0.016、0.08、0.4、2 mg·L-1，加等體積嘧啶作為對照組，作用48 h后收集細(xì)胞，采用RIPA裂解細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度，再在蛋白樣品中加入上樣緩沖液混勻后，95℃金屬浴10 min，冰上放置10 min后，保存于-20℃冰箱備用。采用SDS-PAGE凝膠電泳分離總蛋白樣品，轉(zhuǎn)移至NC膜上，5%脫脂奶粉(TBST配制)室溫?fù)u床封閉1.5 h，4℃孵育一抗過夜，TBST洗膜5次，每次10 min，室溫孵育二抗1.5 h，TBST洗膜5次，每次5 min，與ECL發(fā)光液反應(yīng)2～3 min后，X線片曝光、顯影、定影，采用Gel-Pro Analyzer圖像分析系統(tǒng)計算分析X線片吸光度值。

2 結(jié)果

2.1毛花苷C抑制Huh-7細(xì)胞增殖Tab 1的CCK-8實驗結(jié)果顯示，在加入毛花苷C后3 d，可發(fā)現(xiàn)毛花苷C對Huh-7細(xì)胞增殖的抑制作用隨著藥物濃度的增加而明顯增強(qiáng)。加藥5 d時，Huh-7細(xì)胞生長抑制率分別為(3.86±1.45)%、(8.64±1.43)%、(14.11±4.87)%、(79.72±2.23)%、(84.27±0.04)%。其中，0.003 2 mg·L-1毛花苷C組與對照組相比，無明顯差異(P>0.05)；0.016、0.08、0.4、2 mg·L-1毛花苷C組與相應(yīng)對照組相比，呈現(xiàn)明顯差異(P<0.05)。

2.2毛花苷C抑制Huh-7細(xì)胞克隆形成Fig 1的克隆形成實驗結(jié)果顯示，毛花苷C對Huh-7細(xì)胞克隆形成具有明顯的抑制作用(P<0.05)，隨著毛花苷C濃度增高，Huh-7細(xì)胞克隆抑制率隨之增大。0.003 2、0.016、0.08、0.4、2 mg·L-1的毛花苷C干預(yù)Huh-7細(xì)胞10 d后，克隆抑制率分別為(3.29±2.84)%、(19.41±2.66)%、(56.08±3.66)%、(69.03±1.81)%、(65.02±1.12)%。其中，0.003 2 mg·L-1毛花苷C組與對照組相比無明顯差異(P>0.05)，0.016、0.08、0.4、2 mg·L-1毛花苷C組較對照組表現(xiàn)出明顯差異(P<0.05)。

2.3毛花苷C促進(jìn)Huh-7細(xì)胞凋亡取對數(shù)生長期的Huh-7細(xì)胞，給予不同濃度的毛花苷C培養(yǎng)48 h后，離心收集細(xì)胞，以Annexin-V/PI雙重染色后，使用流式細(xì)胞儀分析。如Fig 2A、2B所示，2 mg·L-1毛花苷C組與對照組晚期凋亡細(xì)胞(Q2)分別為(12.03±1.09)%、(6.97±0.25)%，早期凋亡細(xì)胞(Q4)分別為(7.63±0.61)%、(1.50±0.14)%，差異明顯(P<0.01)。通過激光共聚焦顯微鏡觀察(Fig 2C)，發(fā)現(xiàn)2 mg·L-1毛花苷C組Annexin-V染色(綠色熒光)高于對照組。

Tab 1 Lanatoside C inhibited hepatocellular Huh-7 cell proliferation

*P<0.05vscontrol

Fig 1 Lanatoside C inhibited hepatocellularA:Different concentrations of lanatoside C inhibited clonal proliferation of Huh-7 cells; B: Comparison of different concentrations of lanatoside C inhibiting Huh-7 cell clonal formation(A560 nm).*P<0.05,**P<0.01 vs control.

2.4毛花苷C促進(jìn)Huh-7細(xì)胞凋亡蛋白caspase-7的活化不同濃度毛花苷C干預(yù)Huh-7細(xì)胞48 h后，F(xiàn)ig 3蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，毛花苷C可以明顯促進(jìn)Huh-7細(xì)胞caspase-7蛋白從35 ku全長蛋白形式，活化為18 ku活性蛋白形式，對照組caspase-7蛋白并未出現(xiàn)明顯活化。

3 討論

2000年，Haux等[9]對9 271例使用洋地黃治療的患者進(jìn)行分析，雖未發(fā)現(xiàn)該化合物具有明顯的抗癌作用，但血藥濃度高能降低患白血病和尿道癌風(fēng)險，為強(qiáng)心苷的抗癌作用研究提供了基礎(chǔ)，現(xiàn)已有上千篇報道強(qiáng)心苷類化合物體外抗癌特性的論文發(fā)表。

強(qiáng)心苷類物質(zhì)抗癌機(jī)制包括抑制Na+/K+-ATP酶活性、抑制缺氧誘導(dǎo)因子1活性、抑制成纖維細(xì)胞因子2(fibroblast growth factor-2, FGF-2)和NFκB、抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶的活性、阻斷ER、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等[10]。而化療藥物引起癌細(xì)胞死亡的關(guān)鍵機(jī)制為誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，caspase是參與細(xì)胞凋亡的主要蛋白酶。Badr等[11]在人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，毛花苷C可激活caspase蛋白的表達(dá)，從而誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡。Caspase最初以酶原存在于細(xì)胞中，當(dāng)起始凋亡蛋白酶如caspase-8、caspase-9通過低聚反應(yīng)而激活時，進(jìn)一步激活caspase-3、caspase-6、caspase-7等效應(yīng)凋亡蛋白酶，從而導(dǎo)致與凋亡表型相關(guān)的一系列生物化學(xué)及形態(tài)學(xué)變化[12]。

Caspase可通過外源性途徑及線粒體內(nèi)源性途徑激活[13]，當(dāng)FasL與腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)分別與細(xì)胞膜上的死亡受體Fas及腫瘤壞死因子受體TNFR發(fā)生特異性結(jié)合，隨即引發(fā)死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合體(death-inducing signaling complex，DISC)的形成，DISC募集caspase-8，并促進(jìn)下游的caspase酶原激活。而內(nèi)源性途徑則是由各種細(xì)胞內(nèi)外應(yīng)激如癌基因的活化、DNA損傷、細(xì)胞缺氧等引起[14]。在內(nèi)源性凋亡途徑中，激活后線粒體外膜通透性增加，從而使細(xì)胞色素C及其他促凋亡因子由線粒體向胞質(zhì)釋放，這一過程主要受Bcl-2蛋白家族調(diào)控。Bcl-2蛋白家族的Bak、Bax等激活后，與線粒體外膜受體結(jié)合，在線粒體膜上形成孔道，使線粒體內(nèi)部一些大分子蛋白如Smac/DIAB-LO、HtrA家族成員Omi/HtrA2以及細(xì)胞色素C由孔道釋放到細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞色素 C上存在caspase活化因子1(Apaf-1)特異性結(jié)合位點，Apaf-1與之反應(yīng)后，誘導(dǎo)別構(gòu)效應(yīng)而激活[15]，Apaf-1上具有與caspase-9同源的caspase募集與激活結(jié)合域(caspase raised and activating domain，CRAD)，活化的Apaf-1能夠以CARD-CARD方式聚集并活化caspase-9，形成由細(xì)胞色素C、Apaf-1、caspase-9組成的凋亡小體，該凋亡小體可激活caspase-7，進(jìn)而誘導(dǎo)下游蛋白的降解，最終引起細(xì)胞凋亡。在本實驗中，采用不同濃度的毛花苷C干預(yù)肝癌Huh-7細(xì)胞，結(jié)果顯示，毛花苷C能明顯抑制Huh-7細(xì)胞增殖，促進(jìn)Huh-7細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)caspase-7的活化水平。提示毛花苷C誘導(dǎo)細(xì)胞Huh-7發(fā)生凋亡可能與細(xì)胞內(nèi)源性凋亡途徑有關(guān)，具體作用機(jī)制尚不明確，需要進(jìn)一步實驗進(jìn)行證實。

Fig 3 Lanatoside C up-regulated activationof caspase-7 in Huh-7

(致謝：本實驗在桂林醫(yī)學(xué)院科學(xué)實驗中心完成，感謝對本課題研究給予幫助的老師和同學(xué)。)