陳 剛，殷鐘意，鄭旭煦

(重慶市天然藥物研究重點實驗室，重慶工商大學環(huán)境與資源學院，重慶 400067)

隨著人們生活水平的提高和飲食習慣的改變，近幾十年來痛風的發(fā)病率逐年升高[1]。痛風是因為血尿酸濃度過高，導致尿酸鹽(monosodium urate，MSU)晶體沉積在關(guān)節(jié)及其周圍組織中，激發(fā)機體產(chǎn)生的無菌性炎癥反應。越來越多的資料提示，MSU誘導的核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)活化和炎性介質(zhì)大量產(chǎn)生在痛風炎癥發(fā)生、發(fā)展中起了重要作用[2]。在非活化狀態(tài)下，NF-κB p65蛋白與NF-κB抑制蛋白(inhibitor of NF-κB，IκB)α結(jié)合而存在于細胞質(zhì)中。MSU可與關(guān)節(jié)局部細胞，如巨噬細胞、單核細胞、成纖維樣滑膜細胞表面的Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)-2和TLR-4結(jié)合，通過磷脂酶C和D、Src酪氨酸激酶、G蛋白或者絲裂原激活的蛋白激酶等信號通路，促使IκBα泛素化降解，導致p65蛋白核轉(zhuǎn)移，促進多種炎性介質(zhì)基因如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白細胞介素(interleukin，IL)-1β和IL-6大量轉(zhuǎn)錄，最終促進痛風炎癥的發(fā)生與發(fā)展[3]。

在中醫(yī)藥臨床實踐中，牡丹皮是用于痛風治療的常用中藥之一。丹皮酚是牡丹皮中主要的藥理成分，已被證實具有抗炎、鎮(zhèn)痛、降血糖、降血脂、抗動脈粥樣硬化、抗心律失常、抗菌、抗腫瘤等藥理作用[4]。丹皮酚抗炎藥理作用已經(jīng)在多種動物炎性模型上得到證實[5]，但是丹皮酚對MSU誘導的痛風炎癥發(fā)生、發(fā)展影響如何，至今未見報道。本研究擬采用MSU誘導的大鼠痛風性關(guān)節(jié)炎(MSU-induced gouty arthritis，MGA)模型，觀察丹皮酚對關(guān)節(jié)腫脹、關(guān)節(jié)功能、關(guān)節(jié)病理損傷、炎性介質(zhì)表達和NF-κB活化的影響，以明確丹皮酚是否有抗痛風的藥理作用及其潛在的藥理機制，為利用丹皮酚研發(fā)新的抗痛風藥物提供科學依據(jù)。

1 材料

1.1試劑丹皮酚、尿酸、抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)試劑盒，均購自美國Sigma公司；秋水仙堿(colchicine)片購自云南植物藥業(yè)有限公司(國藥準字H5302016，批號20160802)；TNF-α抗體、IL-1β抗體、IL-6抗體、免疫組織化學染色試劑盒(二步法)，均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；IκBα抗體、p65抗體、β-actin抗體，均購自美國Santa Cruz公司；PVDF膜和ECL試劑購自美國Milipore公司；RIPA裂解液和BCA蛋白測定試劑盒均購自碧云天生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2儀器RC24型高速冷凍離心機(Thermo Scientific Sorvall公司)；PBC7140足體積檢測儀(Ugo Basile公司)；Infinite M200型全標儀(BioTek公司)；ChemiDoc XRS型成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司)；80i型正置熒光顯微鏡(Nikon公司)。

1.3實驗動物SD大鼠，♂，體質(zhì)量(200～240) g，購自重慶醫(yī)科大學實驗動物中心，動物合格證號：SCXK(渝)2016-0012。所有動物適應性喂養(yǎng)1周后開始實驗。

2 方法

2.1MSU晶體的制備[6]4 g尿酸溶解于預熱至60℃的800 mL蒸餾水中，用0.5 mol·L-1氫氧化鈉調(diào)整pH至8.9后，4℃靜置過夜。溶液經(jīng)4 000 r·min-1離心10 min，取沉淀為MSU晶體，純乙醇洗3次，干燥后高壓滅菌。

2.2模型制備與分組給藥SD大鼠隨機分為6組，每組10只，具體如下：對照組(Control)、模型組(MGA)、陽性對照組(0.3 mg·kg-1秋水仙堿)、丹皮酚組(50、100、200 mg·kg-1)。丹皮酚、秋水仙堿組連續(xù)灌胃給藥7 d，每天1次，對照組與模型組給予同體積生理鹽水。d 5給藥后1 h 給予大鼠右后足踝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射0.1 mL MSU溶液[7](MSU混懸于生理鹽水，終濃度為20 g·L-1)，對照組大鼠右踝關(guān)節(jié)腔注射0.1 mL生理鹽水。繼續(xù)給藥2 d，于造模后48 h麻醉處死動物，取材進行相關(guān)檢測。

2.3關(guān)節(jié)體積檢測分別于造模前(0 h)，造模后2、6、12、24、48 h檢測右踝關(guān)節(jié)體積。

2.4步態(tài)評分檢測造模后24 h檢測大鼠步態(tài)評分，評分標準如下[7]，0分：雙足正常行走；1分：輕度跛行，左后足可著地；2分：中度跛行，左后足可著地但馬上收回；3分：重度跛行，左后足不能著地，只能3足著地行走。

2.5組織學評分檢測取大鼠右后足踝關(guān)節(jié)，于4%多聚甲醛緩沖液中固定24 h，10% EDTA溶液脫鈣28 d，常規(guī)脫水，透明，包埋，切片，蘇木精伊紅染色，然后進行組織學評分[8]。評分參數(shù)包括組織腫脹、炎性細胞浸潤、滑膜組織增生和組織壞死。計分標準如下，0分：正常；1分：輕度病變；2分：中度病變；3分：重度病變。關(guān)節(jié)體積、步態(tài)分析及組織學評分檢測均由不知道本研究方案的實驗員完成。

2.6TRAP染色檢測取上述實驗所制備的切片，按照TRAP染色試劑盒說明書進行染色，100倍鏡下計數(shù)TRAP陽性(酒紅色)染色細胞數(shù)作為破骨細胞數(shù)量。

2.7免疫組織化學染色檢測取上述實驗制備的切片，按照“二步法”免疫組織化學染色試劑盒說明書操作。所用抗體分別為抗TNF-α、抗IL-1β、抗IL-6抗體。DAB顯色，中性樹膠封片。200倍鏡下分析陽性染色的光密度值，隨機取同組10張切片的平均光密度值代表該細胞因子的表達值。

2.8Westernblot檢測取大鼠左后足踝關(guān)節(jié)滑膜組織，加入RIPA裂解液及蛋白酶抑制劑反復勻漿，4℃下12 000 r·min-1離心15 min后取上清。取等量蛋白進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉，4℃下與IκBα抗體、p65抗體或者β-actin抗體共同孵育過夜，再與相應的二抗室溫共同孵育1 h，加入ECL發(fā)光試劑后，成像系統(tǒng)檢測分析信號。以目的蛋白與內(nèi)參蛋白的光密度比值代表該目的蛋白的表達值。

3 結(jié)果

3.1丹皮酚對MGA大鼠足腫脹和步態(tài)評分的影響如Tab 1所示，與對照組相比，踝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射MSU 6 h后大鼠即出現(xiàn)明顯的足腫脹(P<0.01)，12 h后足腫脹達到最高值(P<0.01)，并持續(xù)至注射MSU后48 h(P<0.01)，而對照組大鼠足體積則無明顯變化。與MGA組相比，給予0.3 mg·kg-1秋水仙堿、丹皮酚(100、200 mg·kg-1)治療后，均使得MSU致炎48 h后的大鼠足腫脹明顯減輕(P<0.05或P<0.01)；但給予50 mg·kg-1丹皮酚治療對MSU致炎48 h后的大鼠足腫脹無明顯影響。與此同時，如Tab 2所示，踝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射MSU 24 h導致大鼠步態(tài)評分數(shù)值明顯增高。與MGA組相比，給予0.3 mg·kg-1秋水仙堿、丹皮酚(100、200 mg·kg-1)治療后，均使MGA大鼠步態(tài)評分明顯降低(P<0.05或P<0.01)，但給予50 mg·kg-1丹皮酚治療對MGA大鼠步態(tài)評分無明顯影響。

3.2丹皮酚對MGA大鼠組織學評分和破骨細胞活化的影響如Tab 2、Fig 1所示，與對照組比較，注射MSU 48 h后，大鼠踝關(guān)節(jié)出現(xiàn)明顯的滑膜增生、腫脹，嚴重者出現(xiàn)壞死，同時伴隨有大量的炎性細胞浸潤，因此模型組組織學評分數(shù)值明顯升高。與此同時，注射MSU 48 h后大鼠踝關(guān)節(jié)TRAP陽性染色細胞數(shù)量也比對照組明顯增加(P<0.01)。與MGA組比較，給予0.3 mg·kg-1秋水仙堿、丹皮酚(100、200 mg·kg-1)治療則明顯降低了MGA大鼠組織學評分和TRAP陽性染色細胞數(shù)(P<0.05或P<0.01)，且呈劑量依賴性；但給予50 mg·kg-1丹皮酚治療對MGA大鼠組織學評分和TRAP陽性染色細胞數(shù)均無明顯影響。

3.3丹皮酚對MGA大鼠關(guān)節(jié)組織TNF-α、IL-1β和IL-6表達的影響如Tab 3、Fig 2所示，與對照組相比，注射MSU 48 h后大鼠關(guān)節(jié)組織中TNF-α、IL-1β、IL-6表達均明顯升高(P<0.01)。與MGA組相比，給予0.3 mg·kg-1秋水仙堿、丹皮酚(100、200 mg·kg-1)治療明顯降低了MGA大鼠關(guān)節(jié)組織中TNF-α、IL-1β和IL-6表達，且呈現(xiàn)出劑量依賴性(P<0.05或P<0.01)；但給予50 mg·kg-1丹皮酚治療對MGA大鼠關(guān)節(jié)組織中TNF-α、IL-1β和IL-6表達無明顯影響。

Tab 2 Effects of paeonol on gait score, histological score and osteoclast formation in MGA rats n=10)

##P<0.01vscontrol;*P<0.05,**P<0.01vsMGA

Tab 1 Effect of paeonol on paw swelling in MGA rats n=10)

##P<0.01vscontrol;*P<0.05,**P<0.01vsMGA

Fig 1 Effect of paeonol on histological damage and osteoclast formation in MGA rats (×100)

Fig 2 Effects of paeonol on expressions of TNF-α, IL-1β and IL-6 in ankle joints of MGA rats analyzed by immunohistochemistry staining (×200)

Tab 3 Effects of paeonol on levels of TNF-α, IL-1β, IL-6, p65 and IκBα in MGA rats

##P<0.01vscontrol;*P<0.05,**P<0.01vsMGA

3.4丹皮酚對MGA大鼠關(guān)節(jié)滑膜p65和IκBα蛋白水平的影響如Tab 3、Fig 3所示，與對照組相比，注射MSU 48 h后大鼠關(guān)節(jié)滑膜中p65蛋白水平明顯升高，IκBα蛋白水平則明顯降低(P<0.01)。與MGA組相比，給予0.3 mg·kg-1秋水仙堿、丹皮酚(100、200 mg·kg-1)治療明顯提高了MGA大鼠關(guān)節(jié)滑膜中IκBα蛋白水平(P<0.05)；但給予50 mg·kg-1丹皮酚治療對MGA大鼠關(guān)節(jié)滑膜IκBα蛋白水平無明顯影響。同時，本研究中不同劑量的丹皮酚對MGA大鼠關(guān)節(jié)滑膜中p65蛋白水平均無明顯影響。

Fig 3 Effects of paeonol on levels of p65 and IκBα in synovium of MGA rats n=3)

4 討論

本研究應用大鼠MGA模型，證實了丹皮酚(100、200 mg·kg-1)可明顯減輕大鼠足腫脹，改善步態(tài)評分、組織學評分和破骨細胞形成，降低關(guān)節(jié)組織中TNF-α、IL-1β、IL-6表達，提高IκBα蛋白水平，但對p65蛋白水平無明顯影響。

由于近幾十年痛風發(fā)病率明顯上升，MSU誘導痛風炎癥發(fā)生、發(fā)展的分子機制逐漸成為研究熱點。MSU被證實是最強有力的促炎信號之一，其可激活巨噬細胞、單核細胞、中性粒細胞、滑膜成纖維細胞等表達促炎細胞因子、趨化因子、黏附分子和組織蛋白酶，啟動痛風炎癥的發(fā)生、發(fā)展和關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)的病理損傷[9]。因此，通過向?qū)嶒瀯游镪P(guān)節(jié)腔注射MSU誘導關(guān)節(jié)炎癥(MGA模型)已成為國內(nèi)外廣泛認同和使用的痛風動物模型[10]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射MSU后6 h就快速誘導了大鼠關(guān)節(jié)腫脹，12 h關(guān)節(jié)腫脹達到峰值，注射后48 h關(guān)節(jié)腫脹仍然明顯，這一結(jié)果與Silva等[20]研究結(jié)論相一致。MSU注射后的步態(tài)評分和病理評分均明顯升高，提示MSU導致了關(guān)節(jié)功能障礙和組織病理損傷。給予丹皮酚治療后，關(guān)節(jié)腫脹明顯減輕，步態(tài)評分和病理評分均明顯降低。破骨細胞是介導炎癥狀態(tài)下關(guān)節(jié)骨質(zhì)破壞的主要效應細胞，這一結(jié)論在類風濕關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、痛風性關(guān)節(jié)炎等疾病中均得到證實[11]。本研究中，我們應用TRAP染色法觀察到MSU誘導激活了大量破骨細胞，而丹皮酚治療后激活的破骨細胞數(shù)量明顯減少。綜合上述結(jié)果表明，丹皮酚緩解了MSU誘導的關(guān)節(jié)炎癥狀，改善了關(guān)節(jié)功能障礙和關(guān)節(jié)病理損傷，提示丹皮酚有抗大鼠MGA的藥理作用。

由于炎癥因子在痛風炎癥發(fā)生、發(fā)展中扮演著關(guān)鍵角色，在初步證實了丹皮酚抗大鼠MGA發(fā)展的基礎(chǔ)上，我們接著探討了丹皮酚對MGA大鼠炎癥因子表達的影響。眾多的炎癥因子如TNF-α、IL-1β、IL-6均在痛風炎癥發(fā)展中起了關(guān)鍵作用，其中尤以IL-1β的作用備受關(guān)注[9]。IL-1β既可刺激多種炎性細胞表達趨化因子、黏附分子和其它促炎細胞因子，也可誘導破骨細胞活化而導致關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)的病理損傷，還可作用于神經(jīng)元，導致痛風患者對炎癥疼痛過度敏感。可溶性IL-1誘餌受體列洛西普、IL-1β單克隆抗體卡那單抗均表現(xiàn)出優(yōu)異的抗痛風療效，更加凸顯了IL-1β在痛風炎癥病理過程中的核心地位[12]。本研究中，我們首先觀察到MGA大鼠病變關(guān)節(jié)組織中TNF-α、IL-1β、IL-6的表達均明顯升高，這一結(jié)果與文獻報道基本一致，也再次證明了炎癥因子在MGA發(fā)展中的核心作用[3]。以往的研究已經(jīng)證實了經(jīng)典抗痛風藥物秋水仙堿對MSU誘導的多種炎性介質(zhì)表達有抑制作用[13]。本研究中，我們也觀察到秋水仙堿明顯降低了MGA大鼠病變關(guān)節(jié)組織中TNF-α、IL-1β、IL-6的表達。給予丹皮酚治療后，MGA大鼠病變關(guān)節(jié)組織中TNF-α、IL-1β、IL-6的表達都明顯降低，提示丹皮酚抗大鼠MGA的藥理作用與拮抗炎癥因子的表達密切相關(guān)。

已有的研究結(jié)果提示，激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB是MSU誘導炎癥因子表達的核心機制之一。MSU可直接結(jié)合TLR-2和TLR-4，通過多個信號轉(zhuǎn)導通路促進IκBα的泛素化降解，使得p65蛋白游離并核轉(zhuǎn)移，從而增加炎性細胞因子、黏附分子、趨化因子、組織蛋白酶等基因表達，促進痛風炎癥的發(fā)生、發(fā)展和關(guān)節(jié)組織的病理損傷[3]。與此同時，研究人員還發(fā)現(xiàn)了MSU誘導NF-κB活化的另一個機制。MSU 晶體可被單核細胞、巨噬細胞等吞噬進入細胞質(zhì)，通過鉀離子流出、活性氧或者溶酶體損傷等機制，激活細胞質(zhì)中的NALP3炎性體復合體，然后活化caspase-1，促進前體IL-1β剪切成為成熟體IL-1β并分泌至細胞外[14]。胞外的IL-1β通過與炎性細胞胞膜上相應受體結(jié)合，激活NF-κB，最終促進痛風炎癥的發(fā)展。因此，我們在證實了丹皮酚抑制MGA大鼠炎癥因子表達的基礎(chǔ)上，觀察了丹皮酚對MSU誘導的NF-κB活化的影響。本實驗發(fā)現(xiàn)，MGA大鼠病變關(guān)節(jié)組織中IκBα水平明顯降低，提示MSU誘導了IκBα降解，從而促進了NF-κB活化。給予丹皮酚治療后，MGA大鼠病變關(guān)節(jié)組織中IκBα水平明顯增高，提示丹皮酚阻遏了MSU誘導的IκBα降解，提高了組織中IκBα水平，從而抑制了NF-κB活化。有意思的是，我們發(fā)現(xiàn)丹皮酚對MGA大鼠關(guān)節(jié)組織中p65蛋白表達水平無明顯影響，提示丹皮酚抑制NF-κB活化的藥理作用主要是通過阻斷其活化的信號途徑，而非影響其表達量而實現(xiàn)。

綜上所述，本研究證實了丹皮酚可明顯抑制大鼠痛風性關(guān)節(jié)炎的發(fā)展，其機制與抑制關(guān)節(jié)組織中NF-κB活化，從而降低炎性介質(zhì)表達密切相關(guān)。本研究為中醫(yī)臨床應用中藥牡丹皮治療痛風的科學性提供了證據(jù)，也為利用丹皮酚研發(fā)新的抗痛風藥物提供了初步的藥理實驗依據(jù)。

(致謝：本實驗在重慶工商大學重慶市天然藥物研究重點實驗室完成，感謝孔淑貞博士、殷鐘意高級實驗師給予的技術(shù)支持。)