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        丹皮酚改善大鼠痛風性關(guān)節(jié)炎與調(diào)節(jié)核因子κB活化的關(guān)系研究

        2018-12-18 06:10:02殷鐘意鄭旭煦
        中國藥理學通報 2018年12期
        關(guān)鍵詞:丹皮滑膜痛風

        陳 剛,殷鐘意,鄭旭煦

        (重慶市天然藥物研究重點實驗室,重慶工商大學環(huán)境與資源學院,重慶 400067)

        隨著人們生活水平的提高和飲食習慣的改變,近幾十年來痛風的發(fā)病率逐年升高[1]。痛風是因為血尿酸濃度過高,導致尿酸鹽(monosodium urate,MSU)晶體沉積在關(guān)節(jié)及其周圍組織中,激發(fā)機體產(chǎn)生的無菌性炎癥反應。越來越多的資料提示,MSU誘導的核因子κB(nuclear factor κB,NF-κB)活化和炎性介質(zhì)大量產(chǎn)生在痛風炎癥發(fā)生、發(fā)展中起了重要作用[2]。在非活化狀態(tài)下,NF-κB p65蛋白與NF-κB抑制蛋白(inhibitor of NF-κB,IκB)α結(jié)合而存在于細胞質(zhì)中。MSU可與關(guān)節(jié)局部細胞,如巨噬細胞、單核細胞、成纖維樣滑膜細胞表面的Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)-2和TLR-4結(jié)合,通過磷脂酶C和D、Src酪氨酸激酶、G蛋白或者絲裂原激活的蛋白激酶等信號通路,促使IκBα泛素化降解,導致p65蛋白核轉(zhuǎn)移,促進多種炎性介質(zhì)基因如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、白細胞介素(interleukin,IL)-1β和IL-6大量轉(zhuǎn)錄,最終促進痛風炎癥的發(fā)生與發(fā)展[3]。

        在中醫(yī)藥臨床實踐中,牡丹皮是用于痛風治療的常用中藥之一。丹皮酚是牡丹皮中主要的藥理成分,已被證實具有抗炎、鎮(zhèn)痛、降血糖、降血脂、抗動脈粥樣硬化、抗心律失常、抗菌、抗腫瘤等藥理作用[4]。丹皮酚抗炎藥理作用已經(jīng)在多種動物炎性模型上得到證實[5],但是丹皮酚對MSU誘導的痛風炎癥發(fā)生、發(fā)展影響如何,至今未見報道。本研究擬采用MSU誘導的大鼠痛風性關(guān)節(jié)炎(MSU-induced gouty arthritis,MGA)模型,觀察丹皮酚對關(guān)節(jié)腫脹、關(guān)節(jié)功能、關(guān)節(jié)病理損傷、炎性介質(zhì)表達和NF-κB活化的影響,以明確丹皮酚是否有抗痛風的藥理作用及其潛在的藥理機制,為利用丹皮酚研發(fā)新的抗痛風藥物提供科學依據(jù)。

        1 材料

        1.1試劑丹皮酚、尿酸、抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP)試劑盒,均購自美國Sigma公司;秋水仙堿(colchicine)片購自云南植物藥業(yè)有限公司(國藥準字H5302016,批號20160802);TNF-α抗體、IL-1β抗體、IL-6抗體、免疫組織化學染色試劑盒(二步法),均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;IκBα抗體、p65抗體、β-actin抗體,均購自美國Santa Cruz公司;PVDF膜和ECL試劑購自美國Milipore公司;RIPA裂解液和BCA蛋白測定試劑盒均購自碧云天生物技術(shù)有限公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

        1.2儀器RC24型高速冷凍離心機(Thermo Scientific Sorvall公司);PBC7140足體積檢測儀(Ugo Basile公司);Infinite M200型全標儀(BioTek公司);ChemiDoc XRS型成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司);80i型正置熒光顯微鏡(Nikon公司)。

        1.3實驗動物SD大鼠,♂,體質(zhì)量(200~240) g,購自重慶醫(yī)科大學實驗動物中心,動物合格證號:SCXK(渝)2016-0012。所有動物適應性喂養(yǎng)1周后開始實驗。

        2 方法

        2.1MSU晶體的制備[6]4 g尿酸溶解于預熱至60℃的800 mL蒸餾水中,用0.5 mol·L-1氫氧化鈉調(diào)整pH至8.9后,4℃靜置過夜。溶液經(jīng)4 000 r·min-1離心10 min,取沉淀為MSU晶體,純乙醇洗3次,干燥后高壓滅菌。

        2.2模型制備與分組給藥SD大鼠隨機分為6組,每組10只,具體如下:對照組(Control)、模型組(MGA)、陽性對照組(0.3 mg·kg-1秋水仙堿)、丹皮酚組(50、100、200 mg·kg-1)。丹皮酚、秋水仙堿組連續(xù)灌胃給藥7 d,每天1次,對照組與模型組給予同體積生理鹽水。d 5給藥后1 h 給予大鼠右后足踝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射0.1 mL MSU溶液[7](MSU混懸于生理鹽水,終濃度為20 g·L-1),對照組大鼠右踝關(guān)節(jié)腔注射0.1 mL生理鹽水。繼續(xù)給藥2 d,于造模后48 h麻醉處死動物,取材進行相關(guān)檢測。

        2.3關(guān)節(jié)體積檢測分別于造模前(0 h),造模后2、6、12、24、48 h檢測右踝關(guān)節(jié)體積。

        2.4步態(tài)評分檢測造模后24 h檢測大鼠步態(tài)評分,評分標準如下[7],0分:雙足正常行走;1分:輕度跛行,左后足可著地;2分:中度跛行,左后足可著地但馬上收回;3分:重度跛行,左后足不能著地,只能3足著地行走。

        2.5組織學評分檢測取大鼠右后足踝關(guān)節(jié),于4%多聚甲醛緩沖液中固定24 h,10% EDTA溶液脫鈣28 d,常規(guī)脫水,透明,包埋,切片,蘇木精伊紅染色,然后進行組織學評分[8]。評分參數(shù)包括組織腫脹、炎性細胞浸潤、滑膜組織增生和組織壞死。計分標準如下,0分:正常;1分:輕度病變;2分:中度病變;3分:重度病變。關(guān)節(jié)體積、步態(tài)分析及組織學評分檢測均由不知道本研究方案的實驗員完成。

        2.6TRAP染色檢測取上述實驗所制備的切片,按照TRAP染色試劑盒說明書進行染色,100倍鏡下計數(shù)TRAP陽性(酒紅色)染色細胞數(shù)作為破骨細胞數(shù)量。

        2.7免疫組織化學染色檢測取上述實驗制備的切片,按照“二步法”免疫組織化學染色試劑盒說明書操作。所用抗體分別為抗TNF-α、抗IL-1β、抗IL-6抗體。DAB顯色,中性樹膠封片。200倍鏡下分析陽性染色的光密度值,隨機取同組10張切片的平均光密度值代表該細胞因子的表達值。

        2.8Westernblot檢測取大鼠左后足踝關(guān)節(jié)滑膜組織,加入RIPA裂解液及蛋白酶抑制劑反復勻漿,4℃下12 000 r·min-1離心15 min后取上清。取等量蛋白進行SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜,5%脫脂奶粉封閉,4℃下與IκBα抗體、p65抗體或者β-actin抗體共同孵育過夜,再與相應的二抗室溫共同孵育1 h,加入ECL發(fā)光試劑后,成像系統(tǒng)檢測分析信號。以目的蛋白與內(nèi)參蛋白的光密度比值代表該目的蛋白的表達值。

        3 結(jié)果

        3.1丹皮酚對MGA大鼠足腫脹和步態(tài)評分的影響如Tab 1所示,與對照組相比,踝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射MSU 6 h后大鼠即出現(xiàn)明顯的足腫脹(P<0.01),12 h后足腫脹達到最高值(P<0.01),并持續(xù)至注射MSU后48 h(P<0.01),而對照組大鼠足體積則無明顯變化。與MGA組相比,給予0.3 mg·kg-1秋水仙堿、丹皮酚(100、200 mg·kg-1)治療后,均使得MSU致炎48 h后的大鼠足腫脹明顯減輕(P<0.05或P<0.01);但給予50 mg·kg-1丹皮酚治療對MSU致炎48 h后的大鼠足腫脹無明顯影響。與此同時,如Tab 2所示,踝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射MSU 24 h導致大鼠步態(tài)評分數(shù)值明顯增高。與MGA組相比,給予0.3 mg·kg-1秋水仙堿、丹皮酚(100、200 mg·kg-1)治療后,均使MGA大鼠步態(tài)評分明顯降低(P<0.05或P<0.01),但給予50 mg·kg-1丹皮酚治療對MGA大鼠步態(tài)評分無明顯影響。

        3.2丹皮酚對MGA大鼠組織學評分和破骨細胞活化的影響如Tab 2、Fig 1所示,與對照組比較,注射MSU 48 h后,大鼠踝關(guān)節(jié)出現(xiàn)明顯的滑膜增生、腫脹,嚴重者出現(xiàn)壞死,同時伴隨有大量的炎性細胞浸潤,因此模型組組織學評分數(shù)值明顯升高。與此同時,注射MSU 48 h后大鼠踝關(guān)節(jié)TRAP陽性染色細胞數(shù)量也比對照組明顯增加(P<0.01)。與MGA組比較,給予0.3 mg·kg-1秋水仙堿、丹皮酚(100、200 mg·kg-1)治療則明顯降低了MGA大鼠組織學評分和TRAP陽性染色細胞數(shù)(P<0.05或P<0.01),且呈劑量依賴性;但給予50 mg·kg-1丹皮酚治療對MGA大鼠組織學評分和TRAP陽性染色細胞數(shù)均無明顯影響。

        3.3丹皮酚對MGA大鼠關(guān)節(jié)組織TNF-α、IL-1β和IL-6表達的影響如Tab 3、Fig 2所示,與對照組相比,注射MSU 48 h后大鼠關(guān)節(jié)組織中TNF-α、IL-1β、IL-6表達均明顯升高(P<0.01)。與MGA組相比,給予0.3 mg·kg-1秋水仙堿、丹皮酚(100、200 mg·kg-1)治療明顯降低了MGA大鼠關(guān)節(jié)組織中TNF-α、IL-1β和IL-6表達,且呈現(xiàn)出劑量依賴性(P<0.05或P<0.01);但給予50 mg·kg-1丹皮酚治療對MGA大鼠關(guān)節(jié)組織中TNF-α、IL-1β和IL-6表達無明顯影響。

        Tab 2 Effects of paeonol on gait score, histological score and osteoclast formation in MGA rats n=10)

        ##P<0.01vscontrol;*P<0.05,**P<0.01vsMGA

        Tab 1 Effect of paeonol on paw swelling in MGA rats n=10)

        ##P<0.01vscontrol;*P<0.05,**P<0.01vsMGA

        Fig 1 Effect of paeonol on histological damage and osteoclast formation in MGA rats (×100)

        Fig 2 Effects of paeonol on expressions of TNF-α, IL-1β and IL-6 in ankle joints of MGA rats analyzed by immunohistochemistry staining (×200)

        Tab 3 Effects of paeonol on levels of TNF-α, IL-1β, IL-6, p65 and IκBα in MGA rats

        ##P<0.01vscontrol;*P<0.05,**P<0.01vsMGA

        3.4丹皮酚對MGA大鼠關(guān)節(jié)滑膜p65和IκBα蛋白水平的影響如Tab 3、Fig 3所示,與對照組相比,注射MSU 48 h后大鼠關(guān)節(jié)滑膜中p65蛋白水平明顯升高,IκBα蛋白水平則明顯降低(P<0.01)。與MGA組相比,給予0.3 mg·kg-1秋水仙堿、丹皮酚(100、200 mg·kg-1)治療明顯提高了MGA大鼠關(guān)節(jié)滑膜中IκBα蛋白水平(P<0.05);但給予50 mg·kg-1丹皮酚治療對MGA大鼠關(guān)節(jié)滑膜IκBα蛋白水平無明顯影響。同時,本研究中不同劑量的丹皮酚對MGA大鼠關(guān)節(jié)滑膜中p65蛋白水平均無明顯影響。

        Fig 3 Effects of paeonol on levels of p65 and IκBα in synovium of MGA rats n=3)

        4 討論

        本研究應用大鼠MGA模型,證實了丹皮酚(100、200 mg·kg-1)可明顯減輕大鼠足腫脹,改善步態(tài)評分、組織學評分和破骨細胞形成,降低關(guān)節(jié)組織中TNF-α、IL-1β、IL-6表達,提高IκBα蛋白水平,但對p65蛋白水平無明顯影響。

        由于近幾十年痛風發(fā)病率明顯上升,MSU誘導痛風炎癥發(fā)生、發(fā)展的分子機制逐漸成為研究熱點。MSU被證實是最強有力的促炎信號之一,其可激活巨噬細胞、單核細胞、中性粒細胞、滑膜成纖維細胞等表達促炎細胞因子、趨化因子、黏附分子和組織蛋白酶,啟動痛風炎癥的發(fā)生、發(fā)展和關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)的病理損傷[9]。因此,通過向?qū)嶒瀯游镪P(guān)節(jié)腔注射MSU誘導關(guān)節(jié)炎癥(MGA模型)已成為國內(nèi)外廣泛認同和使用的痛風動物模型[10]。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射MSU后6 h就快速誘導了大鼠關(guān)節(jié)腫脹,12 h關(guān)節(jié)腫脹達到峰值,注射后48 h關(guān)節(jié)腫脹仍然明顯,這一結(jié)果與Silva等[20]研究結(jié)論相一致。MSU注射后的步態(tài)評分和病理評分均明顯升高,提示MSU導致了關(guān)節(jié)功能障礙和組織病理損傷。給予丹皮酚治療后,關(guān)節(jié)腫脹明顯減輕,步態(tài)評分和病理評分均明顯降低。破骨細胞是介導炎癥狀態(tài)下關(guān)節(jié)骨質(zhì)破壞的主要效應細胞,這一結(jié)論在類風濕關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、痛風性關(guān)節(jié)炎等疾病中均得到證實[11]。本研究中,我們應用TRAP染色法觀察到MSU誘導激活了大量破骨細胞,而丹皮酚治療后激活的破骨細胞數(shù)量明顯減少。綜合上述結(jié)果表明,丹皮酚緩解了MSU誘導的關(guān)節(jié)炎癥狀,改善了關(guān)節(jié)功能障礙和關(guān)節(jié)病理損傷,提示丹皮酚有抗大鼠MGA的藥理作用。

        由于炎癥因子在痛風炎癥發(fā)生、發(fā)展中扮演著關(guān)鍵角色,在初步證實了丹皮酚抗大鼠MGA發(fā)展的基礎(chǔ)上,我們接著探討了丹皮酚對MGA大鼠炎癥因子表達的影響。眾多的炎癥因子如TNF-α、IL-1β、IL-6均在痛風炎癥發(fā)展中起了關(guān)鍵作用,其中尤以IL-1β的作用備受關(guān)注[9]。IL-1β既可刺激多種炎性細胞表達趨化因子、黏附分子和其它促炎細胞因子,也可誘導破骨細胞活化而導致關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)的病理損傷,還可作用于神經(jīng)元,導致痛風患者對炎癥疼痛過度敏感。可溶性IL-1誘餌受體列洛西普、IL-1β單克隆抗體卡那單抗均表現(xiàn)出優(yōu)異的抗痛風療效,更加凸顯了IL-1β在痛風炎癥病理過程中的核心地位[12]。本研究中,我們首先觀察到MGA大鼠病變關(guān)節(jié)組織中TNF-α、IL-1β、IL-6的表達均明顯升高,這一結(jié)果與文獻報道基本一致,也再次證明了炎癥因子在MGA發(fā)展中的核心作用[3]。以往的研究已經(jīng)證實了經(jīng)典抗痛風藥物秋水仙堿對MSU誘導的多種炎性介質(zhì)表達有抑制作用[13]。本研究中,我們也觀察到秋水仙堿明顯降低了MGA大鼠病變關(guān)節(jié)組織中TNF-α、IL-1β、IL-6的表達。給予丹皮酚治療后,MGA大鼠病變關(guān)節(jié)組織中TNF-α、IL-1β、IL-6的表達都明顯降低,提示丹皮酚抗大鼠MGA的藥理作用與拮抗炎癥因子的表達密切相關(guān)。

        已有的研究結(jié)果提示,激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB是MSU誘導炎癥因子表達的核心機制之一。MSU可直接結(jié)合TLR-2和TLR-4,通過多個信號轉(zhuǎn)導通路促進IκBα的泛素化降解,使得p65蛋白游離并核轉(zhuǎn)移,從而增加炎性細胞因子、黏附分子、趨化因子、組織蛋白酶等基因表達,促進痛風炎癥的發(fā)生、發(fā)展和關(guān)節(jié)組織的病理損傷[3]。與此同時,研究人員還發(fā)現(xiàn)了MSU誘導NF-κB活化的另一個機制。MSU 晶體可被單核細胞、巨噬細胞等吞噬進入細胞質(zhì),通過鉀離子流出、活性氧或者溶酶體損傷等機制,激活細胞質(zhì)中的NALP3炎性體復合體,然后活化caspase-1,促進前體IL-1β剪切成為成熟體IL-1β并分泌至細胞外[14]。胞外的IL-1β通過與炎性細胞胞膜上相應受體結(jié)合,激活NF-κB,最終促進痛風炎癥的發(fā)展。因此,我們在證實了丹皮酚抑制MGA大鼠炎癥因子表達的基礎(chǔ)上,觀察了丹皮酚對MSU誘導的NF-κB活化的影響。本實驗發(fā)現(xiàn),MGA大鼠病變關(guān)節(jié)組織中IκBα水平明顯降低,提示MSU誘導了IκBα降解,從而促進了NF-κB活化。給予丹皮酚治療后,MGA大鼠病變關(guān)節(jié)組織中IκBα水平明顯增高,提示丹皮酚阻遏了MSU誘導的IκBα降解,提高了組織中IκBα水平,從而抑制了NF-κB活化。有意思的是,我們發(fā)現(xiàn)丹皮酚對MGA大鼠關(guān)節(jié)組織中p65蛋白表達水平無明顯影響,提示丹皮酚抑制NF-κB活化的藥理作用主要是通過阻斷其活化的信號途徑,而非影響其表達量而實現(xiàn)。

        綜上所述,本研究證實了丹皮酚可明顯抑制大鼠痛風性關(guān)節(jié)炎的發(fā)展,其機制與抑制關(guān)節(jié)組織中NF-κB活化,從而降低炎性介質(zhì)表達密切相關(guān)。本研究為中醫(yī)臨床應用中藥牡丹皮治療痛風的科學性提供了證據(jù),也為利用丹皮酚研發(fā)新的抗痛風藥物提供了初步的藥理實驗依據(jù)。

        (致謝:本實驗在重慶工商大學重慶市天然藥物研究重點實驗室完成,感謝孔淑貞博士、殷鐘意高級實驗師給予的技術(shù)支持。)

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