王 萍，閆東明，黃 茜，鄭曉瓊，任 超，楊兆祥，張建文

(昆藥集團股份有限公司藥物研發(fā)平臺生物學部，云南 昆明 650100)

腦卒中是由于腦部血管突然阻塞或破裂，導致血液不能進入大腦相應組織，引起的因缺血、缺氧導致的一類腦部疾病。據最新統(tǒng)計，我國卒中患者總數以及死亡率已經躍居世界第一[1]。阿替普酶(r-tPA)自1996年問世以來，仍然是全球唯一公認的臨床上最有效的溶栓治療藥物。然而，由于狹窄的時間窗(4.5 h內)，以及潛在的出血風險和炎性細胞毒副反應，其溶栓率在發(fā)達國家不到10%，而國內的使用率還不到1.5%[1]。因此，開拓針對急性缺血性腦卒中新的治療手段成為了一項巨大和迫切的臨床需求。

缺血性腦損傷病理生理十分復雜，是一個多信號通路同時激活，導致神經細胞死亡的過程。在此過程中，免疫細胞和神經細胞的活化是觸發(fā)缺血后炎癥反應的關鍵因素。臨床治療中，把溶栓療法與其他神經保護制劑聯(lián)用，以減少r-tPA使用過程中出現的再灌注損傷，并且延長溶栓治療窗已成為當今卒中治療新的探索方向，也有可能成為未來卒中治療的主要手段[2]，其中溶栓法與抗炎癥神經保護劑聯(lián)用的研究進展最為引人矚目。近期，1項由200名急性缺血性卒中患者參與的前瞻性臨床研究證明，三七總皂苷(PanaxNotoginsengsaponins，PNS)與r-tPA聯(lián)用不但降低了溶栓過程中患者的出血性轉化風險，而且聯(lián)合治療組患者在12個月后隨訪調查預后更好[3]，該研究表明PNS可用于卒中的搶救治療。本研究采用凝血酶致大鼠腦缺血模型，考察了r-tPA、PNS聯(lián)用對模型動物腦損傷的神經保護作用，證實兩藥聯(lián)用可以明顯減少卒中動物的腦損傷和神經功能評分。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器紅四氮唑(TTC)購于國藥集團化學試劑公司；凝血酶(Lot：T4648)、Percoll(Lot：P4937)、膠原蛋白酶(Type XI，Lot：C7657；TypeI-S，Lot：C1639)、透明質酸酶(Lot：H1115000)、Dulbecco磷酸鹽緩沖液(DPBS，Lot：D8662)、細胞篩(Lot：Z742103)、脂多糖(lipopolysaccharides，LPS，Lot：025M4040V)，均為Sigma公司產品；小鼠F4/80熒光抗體，購于BD公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清，購于BI公司；PNS由昆藥集團股份有限公司提供；阿替普酶(批號：705546)購自勃林格殷格翰；依達拉奉注射液(批號：618160521)，南京先聲東元制藥有限公司產品；泊馬度胺(pomalidomide，Lot：S156703)購自Selleck公司；小鼠TNF-α ELISA試劑盒(Lot：228271215)、小鼠IL-6 ELISA試劑盒(Lot：220680144)購于聯(lián)科生物。Biofuge冷凍高速離心機(Thermo公司)；Adventurer天平(奧豪斯儀器上海有限公司)；多功能酶標儀(BioTek公司)；Accuri C6流式細胞儀(BD公司)。

1.2動物模型的制備與分組處理

1.2.2凝血酶致大鼠局灶性腦缺血模型 凝血酶致大鼠局灶性腦缺血模型制作過程，參照郝春華等[5]報道方法，簡述如下。健康♂SD大鼠，分為5組，分別為假手術組、模型組、缺血后3 h給藥組(分別為r-tPA組、r-tPA+PNS 10 mg·kg-1組、r-tPA+PNS 40 mg·kg-1組)，將大鼠以12%的水合氯醛腹腔注射麻醉(360 mg·kg-1)后，仰臥固定于手術臺上。室溫維持在25℃左右。切開右側頸部皮膚，分離、結扎右側頸總動脈、頸外動脈及其分支動脈。分離右側頸總、頸內及頸外動脈，至鼓泡處可見其顱外分支翼腭動脈，根部結扎該分支。在頸外動脈遠端結扎備線、放置動脈夾，頸外動脈拉直后在分叉處切口，插入改造過的充滿凝血酶(5 U·μL-1)的PE-50管，管較粗端連接微量注射器，將PE-50管細端預先吸入4 μL凝血酶，然后經頸外動脈、頸內動脈插入至大腦中動脈(middle cerebral artery，MCA)起始端附近，回抽10 μL動脈血并留置10 min，后將血栓及凝血酶一起推入血管，留置導管至15 min后拔出。扎緊備線并縫合皮膚，并將手術大鼠分籠飼養(yǎng)。各實驗組分別于缺血后3 h靜脈注射給藥，給藥體積為2 mL·kg-1。術后24 h斷頭取腦，將大腦平均冠狀切為5片，放于TTC溶液中，37℃溫育5～10 min染色，隨后拍照統(tǒng)計。

1.3流式細胞術檢測線栓法致小鼠局灶性腦缺血梗死側大腦巨噬細胞的聚集健康ICR小鼠，♂，體質量(27±1)g，由昆藥集團提供，動物生產許可證號為SCXK (滇)K2014-0001。根據體質量均勻分為3組，分別為假手術組、模型組、PNS 70 mg·kg-1組(再灌同時靜脈注射給藥)。參照文獻[6]的方法制備缺血/再灌模型，并于24 h后迅速處死小鼠，取出大腦，分離左右半腦，取右腦以DPBS沖洗后，按照文獻[7]的方法得到大腦單細胞混懸液，計數后，調整細胞濃度為1×109·L-1。隨后加入1 mL含1%胎牛血清的DPBS，以1 000 r·min-1離心5 min，去上清后，剩余約100 μL細胞混懸液，隨即加入小鼠F4/80熒光抗體，于4℃避光孵育20 min。再加入1 mL含1%胎牛血清的DPBS，1 000 r·min-1離心5 min，洗去殘留抗體，去上清后，剩余約500 μL細胞混懸液，加2%的多聚甲醛固定。用流式細胞儀檢測，每個樣品檢測1×105個細胞。

1.4巨噬細胞/小膠質細胞LPS刺激實驗取對數生長期的RAW264.7和BV-細胞(細胞株均來源于中國科學院昆明細胞庫)，調整細胞密度為2×108·L-1，每孔100 μL接種于96孔培養(yǎng)板，待細胞貼壁后，進行實驗，具體分組為RAW264.7細胞：空白對照組、LPS(0.1 mg·L-1)處理組、LPS(0.1 mg·L-1)+PNS(100 mg·L-1)處理組、LPS(0.1 mg·L-1)+泊馬度胺(0.1 μmol·L-1)處理組；BV-細胞：空白對照組、LPS(0.5 mg·L-1)處理組、LPS(0.5 mg·L-1)+PNS(100 mg·L-1)處理組、LPS(0.5 mg·L-1)+泊馬度胺(0.1 μmol·L-1)處理組，泊馬度胺為陽性藥。各組處理24 h后，收集培養(yǎng)上清液，按照ELISA試劑盒說明書檢測TNF-α和IL-6的水平。

2 結果

2.1不同時間給予PNS對線栓法致局灶性腦缺血模型大鼠的影響造模后，大鼠出現明顯的行為學缺陷，同時出現明顯的腦組織壞死，表明造模成功(Tab 1、Fig 1)。再灌注后，立即尾靜脈給予PNS(10 mg·kg-1)對大鼠的行為學評分及腦梗死百分率都有明顯的降低作用(P<0.01)。為了探討PNS對卒中損傷的預防性治療效果，再灌注前10 min尾靜脈給予PNS(10 mg·kg-1)，結果表明，預防給藥組大鼠的行為學評分及腦梗死面積有明顯的改善(P<0.05)。陽性對照藥依達拉奉注射液(5 mg·kg-1)可明顯降低大鼠的行為學評分及腦梗死百分率(P<0.05，P<0.01)。

2.2聯(lián)合用藥對凝血酶致局灶性腦缺血模型大鼠的治療作用為了探討PNS與r-tPA聯(lián)用減少卒中后再灌注損傷的機制，建立了與臨床相關度較高的凝血酶致大鼠局灶性腦缺血模型。造模后，大鼠有明顯的行為學缺陷，同時出現了明顯的腦組織壞死，表明造模成功(Tab 2、Fig 2)。缺血后3 h尾靜脈給予r-tPA，對大鼠的行為學評分及腦梗死百分率都有明顯的降低作用(P<0.05)，表明通過r-tPA啟動的溶栓作用使血栓溶解，并實現了再灌；r-tPA聯(lián)合PNS低劑量組(10 mg·kg-1)可降低大鼠的腦梗死百分率及行為學評分，但與r-tPA組比較差異無顯著性(P>0.05)。然而，r-tPA聯(lián)合PNS高劑量組(40 mg·kg-1)明顯降低了大鼠的行為學評分及腦梗死百分率(P<0.01)，且與r-tPA單獨使用組相比，腦梗死面積有進一步減少的趨勢(P=0.073)。

Tab 1 Protective effect of PNS on neurological defects and infarct volume in the ischemia-reperfusion

*P<0.05，**P<0.01vsmodel group

Tab 2 Protective effect of PNS combined with r-tPA on neurological defects and infarct volume in the ischemia-reperfusion

##P<0.01vssham group;*P<0.05,**P<0.01vsmodel group

2.3PNS對小鼠局灶性腦缺血梗死側大腦巨噬細胞聚集的影響在小鼠腦梗模型中，流式細胞術檢測發(fā)現，與假手術組相比，模型鼠梗死側大腦巨噬細胞的數量明顯增加，而給予70 mg·kg-1PNS后，巨噬細胞數量呈下降趨勢(Fig 3)。表明PNS有降低巨噬細胞向受損腦組織浸潤的抗炎作用。

Fig 3 Assessment of macrophage infiltrationin mice ischemic A:The result of flow cytometry; B:Bar graph of flow cytometry results. ##P<0.01 vs sham group; **P<0.01 vs model group.

2.4PNS對巨噬細胞和小膠質細胞分泌炎性因子的調節(jié)作用大量研究表明，體內巨噬細胞和小膠質細胞激活，是引發(fā)卒中性腦部炎癥反應的第一步，因此，研究巨噬細胞和小膠質細胞體外的激活與抑制，成為探索炎癥反應體內機制的基本手段。本研究采用PNS預處理與LPS誘導巨噬細胞(RAW264.7)和小膠質細胞(BV-)分泌炎性因子的方法，探索PNS對兩種細胞的調節(jié)作用。Fig 4結果表明，PNS對巨噬細胞和小膠質細胞表達TNF-α和IL-6能力有明顯的抑制作用。

3 討論

神經血管單元(neurovascular unit，NVU)是一個近期提出的描述大腦組織與周邊微環(huán)境的概念[8]。NVU由微血管、神經膠質細胞、神經元、神經元軸突及胞外基質構成。這一理論為解讀卒中過程中的病理過程，以及研究參與這一病理過程中各種組織變化，提供了理論基礎，同時也逐漸成為卒中急救過程中的臨床指導?；谶@一理論，中風的干預性治療主要涉及兩個過程，即血管和神經兩部分。前者是盡快實現再灌注，即溶栓或介入取栓治療；而后者則是阻斷缺血/再灌引發(fā)的級聯(lián)反應以降低腦損傷，即神經保護治療。在臨床上，為了獲得對卒中患者最大的治療效益，在使用溶栓法實現再灌基礎上，盡早實施神經保護將是一種理性的治療方案。

江西在茶葉出口上還是有一定的產品優(yōu)勢的，但光有這些優(yōu)勢還遠遠不夠。通過本文的數據分析可以看出江西茶葉雖然在出口數量和出口額方面都在增加，但在發(fā)展過程中還是存在一些問題的，如生產規(guī)模小、機器化程度低、產品結構單一等。因此，本文依據江西省茶葉出口的現狀，同時借鑒其他學者的研究分析成果，得到出幾點應對這些問題的措施，如擴大企業(yè)規(guī)模、提高機械化水平、優(yōu)化產品結構等。希望本文的研究可以在一定程度上助力江西茶葉利用自己的優(yōu)勢將江西的茶文化以及茶葉推向世界，同時提高出口茶葉的質量，促進江西經濟的發(fā)展。

PNS的神經保護機制已有大量的闡述，其中主要集中在抗氧化、抗血管損傷、抗血小板聚集等方面的研究。近期人們把研究的目光聚焦在PNS的免疫調節(jié)與抗炎機制方面。有研究提示，PNS可能通過抑制NF-κB激活，降低細胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule 1，ICAM-1)在中性粒細胞表達，以減少中性粒細胞浸潤反應，從而保護由心肌缺血/再灌注引起的損傷[9-10]。Wang等[11]發(fā)現，PNS的神經保護作用可能是基于對巨噬細胞Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)通路的直接抑制。PNS主要由5種皂苷單體構成(R1、Rb1、Rg1、Re、Rd)，其中的Rb1在體內可以轉化成稀有型皂苷CK，是人參皂苷二醇組代謝產物的代表。研究發(fā)現，稀有型皂苷CK有明顯的抗缺血性腦損傷作用，這一活性源于其對腦膠質細胞活化的調節(jié)功能[12]。越來越多的研究表明，缺血/再灌觸發(fā)的腦部“非感染性”炎癥反應是主導卒中中后期腦損傷的主要病理機制，干預腦部炎癥反應是最佳的卒中后腦保護措施之一。

本研究的目的在于通過體內、體外實驗，對李春生等[3]在臨床上觀察到的PNS與r-tPA聯(lián)用的有效性做初步的藥效學機制探討。為了更好模擬卒中患者搶救中臨床上實施的溶栓過程，我們建立了凝血酶誘導缺血性卒中聯(lián)合r-tPA溶栓大鼠模型，并發(fā)現r-tPA與PNS聯(lián)用組的腦保護作用(梗死面積與神經功能評分)優(yōu)于單用r-tPA。大鼠線栓法模型是目前使用最多的卒中動物模型之一，使用該模型我們發(fā)現，無論是預防性給藥(再灌前10 min)或是治療性給藥(再灌時同時給藥)均可以明顯降低模型動物腦損傷，而且與預防性給藥組相比，再灌時同時給藥(治療性給藥組)PNS的腦保護作用更強。有研究資料提示，缺血后缺血核心區(qū)的血流量將降低至正常狀態(tài)的5%～10%，而半陰影區(qū)的血流量也將下降30%～40%，形成低灌注帶[13]，這顯然直接影響到藥物分子進入靶器官的濃度。此外，由缺血造成的顱內高壓也會影響藥物的傳遞。因此，提示在卒中治療過程中，神經保護劑PNS的最佳給藥時間應該是在溶栓或取栓的同時。

為了探索PNS在大鼠卒中模型中觀察到的神經保護作用機制，我們使用流式細胞術分別對模型組和PNS藥物組小鼠腦組織巨噬細胞浸潤狀態(tài)進行了分析，發(fā)現給予PNS藥物組的模型鼠梗死側大腦巨噬細胞的浸潤明顯低于模型組，提示PNS可能通過其固有的機制，調低了巨噬細胞對缺血腦組織部位的浸潤，從而降低了腦部的炎癥反應程度。為了進一步驗證PNS對卒中炎癥反應直接關聯(lián)細胞的調節(jié)作用，我們利用巨噬細胞和小膠質細胞進行LPS刺激培養(yǎng)，發(fā)現PNS能明顯降低LPS誘導的巨噬細胞/小膠質細胞TNF-α、IL-6的分泌。這一結果與之前其他研究者報道的結論完全相同[14]。

炎癥反應是主宰缺血中后期腦損傷的關鍵因素。PNS是一種擁有多效性的神經保護劑，其中抗炎癥反應可能是其在抗缺血/再灌腦損傷中發(fā)揮作用的關鍵藥理學機制。隨著血管內介入取栓療法的日趨成熟和普及，如何防止介入取栓過程中誘發(fā)的再灌注損傷，也已經成為目前臨床上亟待解決的難題。進一步探索PNS與溶栓法聯(lián)用的合適配比與使用時間，也為未來PNS作為配合治療介入取栓手術打下基礎，使更多卒中患者在接受溶栓或介入取栓治療時，獲得更大的治療效益。

(致謝：本研究中凝血酶誘導大鼠腦血栓模型構建得到上海醫(yī)學工程院劉麗、王志勇博士的指導和支持，特此鳴謝！)