咸哲民，王重陽，樸玉華，李俊峰，姜京植，趙雨喆，李良昌，樸紅梅，延光海

(延邊大學(xué)1. 附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科、2. 醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，吉林 延吉 133002)

支氣管哮喘是最常見的呼吸系統(tǒng)疾病之一，其特點(diǎn)是氣道高反應(yīng)性、氣道炎癥和氣道重塑[1]。在哮喘的發(fā)病機(jī)制上，學(xué)者們常把重點(diǎn)放在氣道炎癥上，但氣道重塑在哮喘的發(fā)病過程中也起到非常重要的作用。氣道重塑不僅可以引起不可逆的氣道阻塞、增加氣道阻力、加重氣道高反應(yīng)性，而且可導(dǎo)致肺功能下降，是治療哮喘的重中之重[2]。氣道重塑的病理表現(xiàn)為炎癥細(xì)胞浸潤、氣道平滑肌增厚、膠原纖維沉積、肌成纖維細(xì)胞增生及血管改變[1]。目前，醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)在氣道重塑的管理工作上已經(jīng)做出了不懈的努力，但尚未發(fā)現(xiàn)可有效改善氣道重塑的治療藥物。因此，研究哮喘氣道重塑的發(fā)病機(jī)理具有重要意義。

轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor β1, TGF-β1)信號(hào)通路廣泛存在于胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖、分化、遷移、凋亡和血管生成中[3]。研究發(fā)現(xiàn)，Smad3蛋白是TGF-β家族的直接底物，是配體和受體相互作用的信號(hào)由胞質(zhì)傳導(dǎo)到胞核的中介分子[4]。目前研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1/Smad3信號(hào)通路在支氣管哮喘氣道重塑的形成過程中起到關(guān)鍵作用，是導(dǎo)致哮喘氣道重塑的重要機(jī)制之一[5]。據(jù)研究報(bào)道，PI3K是細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要組成部分，可以活化氣道平滑肌細(xì)胞的增殖，并可能參與氣道重塑的過程中[6]。

歐前胡素(imperatorin, IMP)是一種天然的6,7-呋喃香豆素類化合物，存在于傘形科植物如獨(dú)活、當(dāng)歸、歐前胡等常用中藥中，并具有抗炎、抗腫瘤、抗驚厥等多種藥理作用[7]。研究發(fā)現(xiàn)，IMP通過抑制TGF-β1和基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix matalloproteinases 2，MMP-2)的表達(dá)來改善腎性高血壓誘發(fā)的心臟重塑[8]，并且IMP通過阻斷PI3K/Akt信號(hào)通路，對人類胃腺癌細(xì)胞起到抗腫瘤作用[9]。本文擬進(jìn)一步探討IMP對哮喘氣道重塑的作用，其作用機(jī)制是否與TGF-β1/Smad3和PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 ♀清潔級(jí)BALB/c小鼠40只，體質(zhì)量(18±5)g，購自延邊大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SCXK(吉)2017-0003。本研究已獲得延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，整個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)程中遵守《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。

1.1.2藥物與試劑 IMP(MAYA-CR-6162)購自中國瑪雅試劑有限公司；雙氫羅丹明(DHR)-123試劑盒、卵清蛋白(ovalbumin, OVA)、氫氧化鋁粉，均購自美國Sigma公司；DAB及免疫組化試劑盒，IgE、IFN-γ、IL-5、IL-4、IL-13等ELISA試劑盒，均購自北京中杉金橋公司；α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)(#19245)、MMP-9(#13667)、TGF-β1(#3711)、Smad3(#9523)、phospho-Smad3(#9520)、Akt(#2920)、phospho-Akt(#9611)、β-actin(#4970)抗體，均購自美國Santa Cruz公司。

1.1.3儀器 15K高速冷凍臺(tái)式離心機(jī)(美國Sigma公司)；2135型輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(德國徠卡公司)；霧化器(大連醫(yī)療器械廠U219)；酶聯(lián)免疫檢測儀RT-2100C(美國雷杜公司)；Western blot轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad公司)；TXD3細(xì)胞涂片離心機(jī)(廣州瀘瑞明儀器有限司)。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組 將40只♀BALB/c小鼠隨機(jī)分為5組，分別為正常對照組(Control)、OVA氣道重塑模型組(OVA)、IMP低、高劑量治療組(IMP-L、IMP-H)、地塞米松陽性對照組(Dex)，每組8只。

1.2.2模型的制備[1]每組小鼠飼養(yǎng)1周適應(yīng)環(huán)境。隨后d 1、7、14，對照組小鼠每只腹腔注射200 μL生理鹽水，而OVA組、IMP-L組、IMP-H組及Dex組均腹腔注射致敏混懸液(OVA 10 μg+氫氧化鋁1 mg+200 μL生理鹽水)；從d 17開始，OVA組、IMP-L組、IMP-H組及Dex組均霧化吸入激發(fā)液(OVA 0.1 g+生理鹽水10 mL，1% OVA生理鹽水溶液)，每次霧化吸入30 min，每周激發(fā)3次，共激發(fā)8周，而對照組用等量生理鹽水10 mL霧化吸入。從d 17開始給予對照組和OVA組ip二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)200 μL，IMP-L、IMP-H組分別腹腔注射稀釋于200 μL DMSO中的30、60 mg·kg-1IMP，地塞米松1 mg·kg-1，每天注射1次(激發(fā)時(shí)提前1 h給藥)。

1.2.3標(biāo)本收集 最后一次激發(fā)后24 h，將小鼠用無水乙醚處死，并固定到手術(shù)板，縱切頸部皮膚并充分暴露氣管，在氣管上剪一小切口插入軟管，緩慢注射4℃生理鹽水1 mL后緩慢回抽，連續(xù)反復(fù)3次，保證回抽量在80%以上。將已收集的支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)3 000 r·min-1離心5 min，并取上清液，置于-80℃凍存，剩余的沉淀物用于細(xì)胞涂片。之后取出右肺置于-80℃凍存，左肺置于4%甲醛中固定。心臟采血1 mL，3 000 r·min-1離心10 min后，取上清液，-20℃保存，用于ELISA檢測TGF-β1。

1.2.4BALF中EOS和總細(xì)胞數(shù)的檢測 BALF經(jīng)離心后的細(xì)胞沉渣中，加入生理鹽水定容至600 μL，混勻后，取200 μL置入細(xì)胞涂片離心機(jī)制備細(xì)胞涂片。經(jīng)Diff-Quick染色法，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.2.5BALF中IL-4、IL-5、IL-13、IgE、TGF-β1及血清中TGF-β1的檢測 根據(jù)ELISA試劑盒說明書的步驟，依次檢測BALF和血清中TGF-β1的濃度，BALF中IgE、IL-4、IL-5、IL-13的濃度。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其濃度。

1.2.6肺組織學(xué)檢查 將固定后的左肺依次進(jìn)行脫水、浸蠟、包埋，將蠟塊切成厚度為4 μm的薄片，分別進(jìn)行HE、Masson染色。

1.2.7免疫組織化學(xué)檢測 將切片置于60℃烤箱內(nèi)熔蠟，然后進(jìn)行脫蠟、脫水，并置于100℃的抗體修復(fù)液中修復(fù)30 min，然后分別用α-SMA一抗和相對應(yīng)的二抗進(jìn)行孵育。用DAB染色、蘇木精復(fù)染后，常規(guī)脫水、中性樹脂封片并觀察。

1.2.8Western blot檢測 提取小鼠右肺組織蛋白，根據(jù)BCA試劑盒要求測定蛋白濃度。取20 μg蛋白，在10%的SDS-PAGE中以80 V電壓電泳。電泳結(jié)束后以300 mA、4℃條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。5%的脫脂奶粉封閉液中常溫封閉1 h。然后分別孵育小鼠 α-SMA、MMP-9、TGF-β1、Smad3、phospho-Smad3、Akt、phospho-Akt、β-actin抗體4℃過夜。常規(guī)洗膜后加入相應(yīng)的二抗，常溫?fù)u床孵育2 h。將膜取出后用ECL試劑曝光。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法資料的統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 17.0，統(tǒng)計(jì)圖的繪制采用GraphPad Prism 6.0。資料的正態(tài)性檢驗(yàn)采用D′Agostino-Pearson omnibus normality test以及Komogorov-Smirnov test(with Dallal-Wilkinson-Lilliev for p value)，計(jì)量資料的比較采用Kruskal-Wallis test(組間比較采用Dunn′s multiple comparison test)以及One-way ANOVA(組間比較采用Holm-Sidak′s multiple comparisons test)。

2 結(jié)果

2.1IMP抑制炎癥細(xì)胞的滲出和杯狀細(xì)胞的增生Fig 1的HE染色結(jié)果顯示，OVA組較對照組炎癥細(xì)胞浸潤明顯增多，且發(fā)現(xiàn)在血管及細(xì)支氣管周圍浸潤明顯，而IMP組中炎癥細(xì)胞的浸潤明顯減少，呈劑量依賴性，且Dex組減少最明顯。Masson染色結(jié)果中，與對照組相比，OVA組中膠原沉積明顯增多，IMP-L組中的膠原沉積較OVA組減少，且IMP-H組減少明顯，Dex組減少最明顯。提示IMP可明顯減少炎癥細(xì)胞滲出和膠原沉積。

2.2IMP抑制IL-4、IL-5、IL-13、EOS、IgE和TGF-β1的生成如Fig 2A所示，BALF中OVA組的IL-4、IL-5及IL-13的含量較對照組明顯增多(P<0.05)，且IMP-L組中IL-4、IL-5及IL-13含量較OVA組減少(P<0.05)，IMP-H組明顯減少(P<0.05)，Dex組減少最明顯。如Fig 2B所示，OVA組BALF中總細(xì)胞數(shù)與EOS的細(xì)胞數(shù)較對照組明顯升高(P<0.01)。與OVA組相比，IMP-L組BALF中總細(xì)胞數(shù)與EOS的細(xì)胞數(shù)均減少(P<0.05)，且IMP-H組的細(xì)胞數(shù)減少的更明顯(P<0.05)，Dex組減少最明顯(P<0.05)。如Fig 2C所示，與對照組相比，OVA組明顯增加 BALF中總IgE和OVA特異性IgE表達(dá)(P<0.05)，而IMP-L組較OVA組總IgE和OVA特異性IgE表達(dá)減少(P<0.05)，且IMP-H組明顯減少(P<0.05)，Dex組減少最明顯(P<0.05)。如Fig 2D所示，BALF中OVA組的TGF-β1濃度較對照組明顯增多(P<0.01)。與OVA組相比，IMP組中TGF-β1濃度明顯減少(P<0.05)，呈劑量依賴性，Dex組減少最明顯。提示IMP可有效減少IL-4、IL-5、IL-13、EOS、IgE和TGF-β1的生成。

Fig 1 Exudation of inflammatory cells and collagen deposition reduced by IMP(×200)

Fig 2 Generation of IL-4, IL-5, IL-13, EOS, IgE and TGF-β1 inhibited by

2.3IMP減少肺組織中α-SMA和MMP-9的表達(dá)量Fig 3A的免疫組化結(jié)果顯示，與對照組相比，OVA組中α-SMA陽性面積明顯增加，而IMP組較OVA組α-SMA陽性面積明顯減少，呈劑量依賴性，Dex組中α-SMA陽性面積減少最明顯。Fig 3B的Western blot結(jié)果示，OVA組中α-SMA和MMP-9的蛋白表達(dá)較對照組明顯升高(P<0.01)，但I(xiàn)MP組較OVA組α-SMA、MMP-9的蛋白表達(dá)明顯下降，呈劑量依賴性(P<0.01)，Dex組下降最明顯(P<0.01)。提示IMP可明顯減少肺組織中α-SMA和MMP-9的表達(dá)量。

2.4IMP可抑制TGF-β1和Smad3的蛋白表達(dá)Fig 4結(jié)果顯示，OVA組中TGF-β1蛋白表達(dá)較對照組明顯增加(P<0.01)，IMP-H組中的TGF-β1蛋白表達(dá)較OVA組減少(P<0.05)，Dex組減少最明顯(P<0.01)。與對照組相比，OVA組中p-Smad3和Smad3的蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.01)，且IMP組中p-Smad3和Smad3蛋白的表達(dá)較OVA組明顯減少(P<0.05)，呈劑量依賴性，Dex組減少最明顯(P<0.05)。以上結(jié)果表明，IMP的作用機(jī)制可能是通過抑制TGF-β1/Smad3通路來改善哮喘小鼠氣道重塑。

2.5IMP抑制Akt的蛋白表達(dá)如Fig 5所示，OVA組中Akt蛋白表達(dá)較對照組明顯增加(P<0.01)，且IMP組中的Akt蛋白表達(dá)較OVA組明顯減少，IMP-H組減少明顯(P<0.05)，Dex組減少最明顯(P<0.05)。提示IMP的作用機(jī)制可能與抑制PI3K/Akt通路有關(guān)。

Fig 4 Protein expression of TGF-β1and Smad3 inhibited by n=5)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsOVA

3 討論

支氣管哮喘是一種普遍存在的全球健康問題，是由多種炎癥細(xì)胞及炎癥介質(zhì)導(dǎo)致的慢性氣道炎癥，其中氣道重塑是哮喘的重要特征，且氣道重塑是以膠原沉積和氣道炎癥為主要特征[10]。IL-4、IL-5、IL-13等炎癥因子是Th2 細(xì)胞亞群中的主要細(xì)胞因子，其通過誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞的產(chǎn)生、聚集、活化、脫顆粒，且輔助B細(xì)胞產(chǎn)生IgE來介導(dǎo)I型變態(tài)反應(yīng)[11]。研究發(fā)現(xiàn)，EOS會(huì)大量浸潤在哮喘氣道中，且分泌嗜酸性粒細(xì)胞陽離子蛋白(eosinophil cation protein, ECP)，進(jìn)而誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞分泌TGF-β1，促使成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化成為肌成纖維細(xì)胞，并分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)，引起氣道壁增厚，最終導(dǎo)致氣道重塑，而且EOS與PI3K/Akt信號(hào)通路也密切相關(guān)[12]。本文HE染色、Masson染色結(jié)果顯示，IMP明顯減少膠原纖維的沉積，以及血管和支氣管周圍的炎癥細(xì)胞的浸潤。IMP組可明顯減少BALF中EOS細(xì)胞數(shù)和IL-4、IL-5、IL-13、IgE的含量，并且減少BALF及血清中TGF-β1的含量，呈劑量依賴性。以上結(jié)果表明，IMP可能對小鼠哮喘氣道重塑有明顯的抑制作用。

Fig 5 Expression of Akt in lung

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05vsOVA

α-SMA在氣道平滑肌收縮過程中起關(guān)鍵作用，且與氣道重塑密切相關(guān)。提高α-SMA的水平可促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，這對氣道重塑起到至關(guān)重要的影響[13]。研究發(fā)現(xiàn)，MMP-9與氣道壁的膠原沉積相關(guān)，這可能會(huì)引起氣道狹窄。本文免疫組化結(jié)果顯示，IMP組可抑制α-SMA的陽性面積，且IMP劑量越大，抑制越明顯。而且Western blot結(jié)果顯示，IMP組較OVA組明顯抑制α-SMA、MMP-9的蛋白表達(dá)量，呈劑量依賴性。以上結(jié)果說明IMP可能通過抑制α-SMA與 MMP-9的表達(dá)，來改善氣道重塑。

本文進(jìn)一步探討IMP改善氣道重塑的分子機(jī)制是否與TGF-β1/Smad3通路和PI3K/Akt通路有關(guān)。TGF-β1是氣道重塑中的一個(gè)關(guān)鍵因素，它主要通過平滑肌細(xì)胞增生及肥大來導(dǎo)致氣道平滑肌功能異常，進(jìn)而導(dǎo)致氣道重塑。Smad3蛋白家族已被證實(shí)為TGF-β1受體的關(guān)鍵底物之一，是TGF-β1受體復(fù)合物的下游信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白，在誘導(dǎo)TGF-β1信號(hào)從細(xì)胞表面轉(zhuǎn)入到細(xì)胞核的過程中起到重要作用[14]。目前研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt的酶活性在OVA誘導(dǎo)的小鼠哮喘模型中明顯增加，在PI3K缺失的小鼠哮喘氣道重塑模型中發(fā)現(xiàn)氣道炎癥和氣道重塑明顯減少[15]，表明PI3K/Akt信號(hào)通路在氣道重塑的形成中起到重要的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，IMP組與模型組比較，可有效抑制TGF-β1、p-Smad3、p-Akt蛋白表達(dá)。以上結(jié)果說明IMP可能通過TGF-β1/Smad3和PI3K/Akt雙通路來改善氣道重塑。

綜上所述，IMP通過減少肺組織中膠原沉積、炎癥細(xì)胞浸潤和抑制EOS、IL-4、IL-5、IL-13、IgE、TGF-β1的生成，來改善氣道重塑，并進(jìn)一步證實(shí)其作用機(jī)制可能部分與TGF-β1/Smad3和PI3K/Akt雙通路相關(guān)。