徐麗麗 胥方元 萬永鮮

西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，四川 瀘州 646000

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)主要存在于骨骼系統(tǒng)松質(zhì)骨中，是一種具有多向分化能力的早期前體細(xì)胞，在適當(dāng)條件刺激下可以分化為骨細(xì)胞[1]?；陂g充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化能力，因此來源于各種組織的間充質(zhì)干細(xì)胞被視為骨組織工程的重要種子細(xì)胞來源。由于BMSCs取材簡單，組織來源較為豐富，逐漸成為了骨缺損、骨軟化病、骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)等疾病干細(xì)胞治療的重要種子細(xì)胞[2]。自噬是生物體內(nèi)一種保守的生命現(xiàn)象，基本的生理學(xué)意義在于清除受損的細(xì)胞器或蛋白，將其代謝產(chǎn)物重新供能，從而維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)[3]。近年來，自噬在細(xì)胞和器官分化和發(fā)育過程中的作用備受關(guān)注，例如自噬缺乏導(dǎo)致小腦和大腦皮質(zhì)廣泛的神經(jīng)細(xì)胞凋亡和退行性改變[4]；而對(duì)于心肌細(xì)胞，自噬缺乏容易導(dǎo)致心肌肥厚、心功能不全等[5]；自噬同樣在造血細(xì)胞分化成熟過程中扮演著重要角色，抑制自噬可能導(dǎo)致造血干細(xì)胞分化成熟障礙，表現(xiàn)為貧血和白細(xì)胞減少[6]。在自噬對(duì)成骨分化影響方面，國內(nèi)李軍等[7]利用自噬激動(dòng)劑雷帕霉素促進(jìn)BMSCs自噬活性后，其向成骨分化的潛力減弱。但國外研究報(bào)道葡萄膜球菌脂磷壁酸可以通過激活自噬來促進(jìn)小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化[8]。

綜上所述，自噬對(duì)于間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響并不明確，本實(shí)驗(yàn)研究擬通過比較實(shí)驗(yàn)組骨質(zhì)疏松與正常對(duì)照組BMSCs的成骨分化能力和自噬水平，初步探討自噬對(duì)人BMSCs成骨分化的影響，為下一步選擇成骨分化靶點(diǎn)，促進(jìn)骨形成提供新的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠，中國)，細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo，美國)，離心機(jī)(Beckman-Coulter，美國)，倒置顯微鏡(Nikon，日本)，超聲細(xì)胞破碎儀(Philips，荷蘭)，凝膠成像儀(Bio-Rad，美國)，激光共聚焦熒光顯微鏡(Hitachi，日本)，核酸蛋白測定儀(Thermo Fisher，美國)，熒光定量PCR儀(Bio-Rad，美國)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

α-MEM培養(yǎng)基(Gibco，美國)，胎牛血清(Gibco，美國)，PBS緩沖液(Hyclon，美國)，0.25%胰蛋白酶(索萊寶，中國)，成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(賽業(yè)生物，中國)，RIPA細(xì)胞裂解液(碧云天，中國)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天，中國)，蛋白Marker(碧云天，中國)，SDS-PAGE配膠試劑盒(碧云天，中國)，TBST緩沖液(索萊寶，中國)，PVDF膜(Millipore，美國)，ECL發(fā)光顯影液(Millipore，美國)，LC3小鼠抗人單克隆抗體(Sigma，美國)，P62小鼠抗人單克隆抗體(Abcam，英國)，β-actin兔抗人單克隆抗體(碧云天，中國)，山羊抗小鼠IgG二抗(碧云天，中國)，山羊抗兔Ig二抗(碧云天，中國)，4%多聚甲醛固定液(碧云天，中國)，茜素紅染色試劑盒(Thermo Fisher，美國)，堿性磷酸酶染色試劑盒(碧云天，中國)，LC3-GFP慢病毒(漢恒，中國)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1BMSCs分離培養(yǎng)：10例椎體松質(zhì)骨來源于2015年6月至2016年6月在我院接收椎體次全切減壓植骨內(nèi)固定術(shù)的患者。所有患者在術(shù)前均簽署了知情同意書，該研究經(jīng)過了我院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。根據(jù)年齡分為兩組，A組為老年骨質(zhì)疏松組：共5例，年齡60～75歲，平均(69.4±7.2)歲，術(shù)前骨密度檢測T值<-2.5，診斷為骨質(zhì)疏松癥，未有過抗骨質(zhì)疏松治療史；B組為年輕對(duì)照組，共5例，年齡26～35歲，平均(30.2±5.4)歲，既往體健，非病理性骨折。

小心分離術(shù)中摘取的椎體中央松質(zhì)骨，用含1%雙抗的PBS反復(fù)沖洗、離心3次；用眼科剪將松質(zhì)骨剪成泥樣，移植入10 cm培養(yǎng)皿中，每一份松質(zhì)骨的體積約為10 mm×10 mm×10 mm，每塊組織間的距離不超過5 mm，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2 h；沿培養(yǎng)皿壁小心加入5 mL含10%FBS的α-MEM培養(yǎng)基，避免松質(zhì)骨團(tuán)塊漂浮，繼續(xù)置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；3～4 d再添加5 mL完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)觀察；7 d左右通過倒置顯微鏡可以觀察到紡錘樣的單層貼壁細(xì)胞，即為人BMSCs，細(xì)胞集落邊緣細(xì)胞間最先相互融合，當(dāng)細(xì)胞融合至80%以上后行胰酶消化傳代培養(yǎng)；取第1～3代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2Western blot檢測：取A組和B組的原代細(xì)胞，常規(guī)提取細(xì)胞總蛋白，行Western blot檢測自噬相關(guān)蛋白LC3和P62，實(shí)驗(yàn)步驟簡述如下：(1)取A組和B組原代細(xì)胞加入RIPA裂解液，冰上常規(guī)反應(yīng)30 min后，超聲細(xì)胞震碎儀處理1 min，4 ℃，12 000 g高速離心5 min后取上清即為提取的總蛋白；(2)采用BCA法常規(guī)檢測蛋白濃度，短期內(nèi)使用的蛋白以1∶4混合5×SDS蛋白上樣緩沖液，煮沸5 min后放置于-20 ℃保存；(3)采用SDS-PAGE配膠試劑盒，根據(jù)目標(biāo)蛋白分子量大小，配置相應(yīng)的凝膠濃度；(4)上樣，每孔以相同蛋白量50 μg恒壓(100 V)跑膠1～2 h，待溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠底部后電泳結(jié)束；(5)采用濕轉(zhuǎn)法將膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜條件250 mA恒流轉(zhuǎn)30 min～1 h；(6)5%脫脂奶粉37 ℃封閉1 h，加入對(duì)應(yīng)合適濃度的一抗，4 ℃孵育過夜；(7)復(fù)溫半小時(shí)后，TBST緩沖液洗滌 5 min/次×3次，加入對(duì)應(yīng)合適濃度二抗，37 ℃孵育1 h；(8)TBST緩沖液洗滌 5 min/次×3次，加入ECL顯影液曝光，拍照。(9)條帶灰度值采用Quantity one軟件分析。

1.3.3LC3-GPF腺病毒轉(zhuǎn)染：自噬檢測的金標(biāo)準(zhǔn)為電鏡觀察，但由于電鏡觀察耗時(shí)較久，且只能捕捉一個(gè)時(shí)間橫斷面的細(xì)胞狀態(tài)，不利于監(jiān)測細(xì)胞自噬狀態(tài)。因此，本實(shí)驗(yàn)采用攜帶LC3-GFP綠色熒光基團(tuán)的腺病毒轉(zhuǎn)染BMSCs，觀察自噬的動(dòng)態(tài)過程，實(shí)驗(yàn)原理如下：自噬沒有被激活時(shí)，LC3-GFP融合蛋白彌散在胞漿中；自噬形成時(shí)，其轉(zhuǎn)位聚集至自噬體膜上，在激光共聚焦熒光顯微鏡下即可觀察到一個(gè)個(gè)明亮的綠色熒光蛋白，理論上一個(gè)綠色熒光斑點(diǎn)即代表一個(gè)自噬體，可以通過計(jì)數(shù)斑點(diǎn)的數(shù)量來評(píng)價(jià)自噬活性的高低。腺病毒轉(zhuǎn)染步驟簡述如下：(1)以1×105/孔細(xì)胞密度將原代BMSCs種植于共聚焦培養(yǎng)皿中，加入完全培養(yǎng)基，細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育過夜；(2)加入1/2體積含有病毒的培養(yǎng)基，以感染復(fù)數(shù)30轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞，每孔加入病毒懸液2 h后換液；(3)轉(zhuǎn)染24 h后，現(xiàn)在普通熒光顯微鏡下初步觀察轉(zhuǎn)染效率，是否可以看到綠色熒光。一般在轉(zhuǎn)染后36～48 h可以觀察到明顯的熒光顆粒，這時(shí)用Dapi染核后在激光共聚焦顯微鏡下觀察、計(jì)數(shù)綠色熒光斑點(diǎn)；(4)隨機(jī)選取3個(gè)不同視野，計(jì)數(shù)綠色斑點(diǎn)，然后行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3.4成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)：(1)成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基配置。①使用前將血清置于2 ℃～8℃環(huán)境中解凍過夜至血清完全溶解，輕晃試劑瓶以確保血清充分混均；②配置前30 min，室溫靜置溶解抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉、雙抗和谷氨酰胺，輕輕上下顛倒充分混勻；③使用前10 min，室溫靜置溶劑地塞米松；④用70%乙醇擦拭各個(gè)試劑瓶開口外壁消毒，靜置待酒精充分揮發(fā)。將抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉、成人BMSC專用胎牛血清、雙抗和谷氨酰胺全部加入成人BMSC成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中，最后加入地塞米松；⑤輕晃配置好的完全培養(yǎng)基，充分混勻。(2)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)步驟。①取1～3代BMSCs按照5×104/孔細(xì)胞密度種植于事先包被0.1%明膠的六孔板，每孔加入2 mL完全培養(yǎng)基；②將細(xì)胞置于37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)；③當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到60%～70%時(shí)，小心將孔內(nèi)的完全培養(yǎng)基移棄，向六孔板中加入2 mL OriCellTM成人BMSC成骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基；④每隔3 d換液一次，誘導(dǎo)3周后進(jìn)行后續(xù)檢測。

1.3.5茜素紅染色：(1)成骨誘導(dǎo)分化3周后，摒棄成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，用PBS緩沖液漂洗2次后，每孔加入1 mL 4%多聚甲醛固定液，室溫靜置30 min；(2)摒棄多聚甲醛溶液，用PBS漂洗3 min/次×3次后，每孔加入茜素紅染色液，室溫靜置3～5 min；(3)摒棄茜素紅染液，用PBS漂洗3 min/次×3次后，置于倒置光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.3.6堿性磷酸酯酶染色：(1)配置堿性磷酸酶染色工作液：參照試劑盒說明，將sodium nitrite soulution、frv-alkaline solution按照1∶1混合，輕輕顛倒混勻，靜置2 min。加入45份比例的雙蒸水，再加入1份比例的naphthol as-bi alkaline solution，充分混勻；(2)成骨誘導(dǎo)分化3周后，摒棄成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，用PBS緩沖液漂洗2次后，每孔加入1 ml 4%多聚甲醛固定液，室溫靜置30 min；⑶摒棄多聚甲醛溶液，用PBS漂洗3 min/次×3次后，每孔加入堿性磷酸染色液，室溫靜置3～5 min；⑷摒棄堿性磷酸酶染液，用PBS漂洗3 min/次×3次后，置于倒置光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.3.7熒光定量PCR檢測：成骨誘導(dǎo)分化3周后，提取細(xì)胞總RNA，采用熒光定量PCR檢測主要的成骨指標(biāo)I型膠原(collagen type I，Col I)、骨鈣素(osteocalcin，OCN)、骨橋蛋白(osteopontin，OPN)、發(fā)育不全相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(runt related transcription factor 2，RUNX2)的mRNA表達(dá)差異。實(shí)驗(yàn)步驟簡述如下：(1)預(yù)冷PBS緩沖液于冰上30 min，棄去培養(yǎng)基，PBS漂洗5 min/次×3次，每孔加入1 mLRNA提取裂解液(Trizol)，冰上靜置15 min后反復(fù)吹打細(xì)胞，使其充分裂解；(2)將細(xì)胞裂解液移入1.5 mL EP管中，加入200 μL氯仿，劇烈振蕩，冰上靜置5 min后高速離心，12 000 g，4℃，離心5 min；(3)取200～400 μL上層水相，移到另一個(gè)EP管中，以1∶1加入相同體積異丙醇，輕柔混勻，冰上靜置15 min后高速離心，12 000 g，4℃，離心15 min；(4)移棄上清，可以看到小塊羽絮狀沉淀，即所提取的RNA，用500 μL75%乙醇洗滌RNA沉淀；(5)高速離心12 000 g，4℃，離心5 min，自然風(fēng)干RNA后加入20 μL DEPC水溶解；(6)用核酸蛋白測定儀測定RNA的濃度和純度，可放置于-20 ℃短期保存；(7)采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA；反應(yīng)液配置完成后，加入200 μL PCR反應(yīng)管匯總，置于PCR儀中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，條件如下：37 ℃ 逆轉(zhuǎn)錄 15 min；85 ℃ 終止滅活逆轉(zhuǎn)錄酶 5 s；4 ℃ 終止逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；得到的cDNA樣本可以置于-20 ℃短期保存。(8)SYBR Green熒光定量PCR檢測目的基因表達(dá)。(9)熒光定量PCR結(jié)果采用2- ΔΔCT法統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行分析處理。兩兩比較采用t檢驗(yàn)，兩組以上比較采用單因素方差分析，其中兩兩比較采用post hoc檢測。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 老年骨質(zhì)疏松BMSCs自噬水平降低

為了比較來源于老年骨質(zhì)疏松患者和正常年輕患者BMSCs的基礎(chǔ)自噬水平，分別取A組和B組的原代細(xì)胞，首先通過Western blot檢測比較自噬相關(guān)蛋白LC3和P62的表達(dá)。自噬形成時(shí)，胞漿型LC3(即LC3-I)會(huì)酶解一小段多肽，轉(zhuǎn)變?yōu)樽允审w膜型(即LC3-II)，因此可以通過LC3-II/I比值來判斷自噬的激活程度。而P62是自噬的降解底物，在自噬形成時(shí)與自噬體膜上的LC3相結(jié)合，繼而被自噬體所降解，因此P62表達(dá)高低與自噬活躍程度呈反比。結(jié)果表明，A組BMSCs的LC3-II/I表達(dá)比率比B組明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而P62的蛋白表達(dá)在A組BMSCs中卻明顯升高，與B組相比差異同樣具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

圖1 Western blot檢測自噬相關(guān)蛋白LC3和P62Fig.1 Western blot detection of autophagy related proteins LC3 and P62

由于LC3抗體對(duì)LC3-II有更高的親和力，容易造成假陽性，因此為了更加客觀地評(píng)判自噬水平的高低，本實(shí)驗(yàn)采用LC3-GFP融合蛋白轉(zhuǎn)染來示蹤自噬體形成。激光共聚焦顯微鏡下顯示A組平均每個(gè)細(xì)胞中綠色熒光斑點(diǎn)數(shù)目明顯小于B組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

綜上，初步判斷老年骨質(zhì)疏松BMSCs中的基礎(chǔ)自噬水平較年輕正常BMSCs中明顯降低。

2.2 老年骨質(zhì)疏松BMSCs成骨分化能力減弱

為了探究BMSCs的自噬水平是否與成骨能力相關(guān)，探討比較老年骨質(zhì)疏松患者和正常年輕患者BMSCs的成骨分化能力。圖3顯示在成骨誘導(dǎo)分化3周后，A、B兩組茜素紅染色均顯示紅染鈣結(jié)節(jié)，但鈣化結(jié)節(jié)數(shù)A組明顯少于B組；堿性磷酸酶染色結(jié)果相似，兩組均有堿性磷酸酶染色陽性細(xì)胞，但A組陽性細(xì)胞數(shù)及染色陽性程度均弱于B組。

為了更加定量比較兩者成骨分化差異，采用熒光定量PCR檢測主要成骨相關(guān)蛋白的mRNA表達(dá)。結(jié)果顯示I型膠原、骨鈣素、骨橋蛋白、RUNX2等4個(gè)主要指標(biāo)的mRNA在A組均明顯少于B組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

圖3 不同組別成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基刺激3周后的染色結(jié)果。A：茜素紅染色，B：堿性磷酸酶染色Fig.3 Results of staining after 3 weeks of osteogenic induction medium stimulation in different groups. A: Alizarin red staining, B: Alkaline phosphatase staining.

圖4 熒光定量PCR檢測成骨相關(guān)基因I型膠原、骨鈣素、骨橋蛋白、RUNX2等Mrna表達(dá)Fig.4 Detection of Mrna expression of osteogenic related genes including collagen type I, osteocalcin, osteopontin and RUNX2 by fluorescence quantitative PCR

上述研究結(jié)果表明老年骨質(zhì)疏松BMSCs成骨誘導(dǎo)分化能力較弱，顯示了在BMSCs中較低的自噬水平表現(xiàn)出較弱的成骨分化能力。

3 討論

成骨能力降低是導(dǎo)致老年性O(shè)P的主要病因，但如何提高老年患者的成骨分化能力目前仍是一個(gè)研究熱點(diǎn)[9]。BMSCs作為一種具有多向分化潛能的前體細(xì)胞，相對(duì)其他組織干細(xì)胞而言，具有取材豐富，提取簡便的優(yōu)勢。

自噬是細(xì)胞適應(yīng)外界應(yīng)激的主動(dòng)生理調(diào)控機(jī)制，近年來自噬在骨形成中的作用才逐漸被發(fā)現(xiàn)[10]。Nuschke等[11]研究表明在成骨分化的早期，人間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)的自噬水平會(huì)明顯提高，而當(dāng)分化為成熟骨細(xì)胞后自噬又會(huì)明顯下降，提示自噬在成骨分中扮演了重要作用。更進(jìn)一步的研究表明，自噬可以通過調(diào)控NF-κB[12]和TNFSF11/RANKL[13]兩條信號(hào)通路，促進(jìn)成骨分化、提高礦化能力，從而有利于骨形成。而在體內(nèi)研究中同樣發(fā)現(xiàn)橈骨遠(yuǎn)端的骨密度與自噬水平密切相關(guān)[14]。但國內(nèi)有研究表明當(dāng)上調(diào)BMSCs自噬活性后，其向成骨分化的潛力減弱[7]。由此可見，當(dāng)前自噬與成骨分化的關(guān)系并不明確，分析其原因可能與所選用種子細(xì)胞的差異，以及成骨分化的同階段有關(guān)，所以本實(shí)驗(yàn)的目的是通過比較骨質(zhì)疏松和正常對(duì)照的原代BMSCs自噬和成骨分化能力，初步判斷在BMSCs中自噬與成骨能力間的關(guān)系。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果無論是Western blot還是激光共聚焦觀察均顯示OP組中的BMSCs自噬水平顯著低于正常對(duì)照組，而通過組織學(xué)染色比較以及熒光定量PCR結(jié)果則提示OP組的成骨分化能力同樣較弱。這些結(jié)果均提示在BMSCs自噬水平似乎與成骨分化能力呈正相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)研究同樣存在一些局限性，首先該研究只是一個(gè)觀察性研究，自噬對(duì)成骨分化的影響需要進(jìn)一步驗(yàn)證；其次在所檢測的幾個(gè)成骨指標(biāo)中，I型膠原屬于早期成骨指標(biāo)，骨鈣素屬于中期成骨指標(biāo)，而骨橋蛋白屬于晚期成骨指標(biāo)[15]，在以后的實(shí)驗(yàn)中可以通過不同時(shí)間的成骨誘導(dǎo)，比較不同的成骨指標(biāo)，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更為客觀、可靠。