張文韜 陳勛 宋濤 杜曉龍 喻姿瑞

西安市紅會醫(yī)院骨顯微修復(fù)外科,陜西 西安 710054

骨質(zhì)疏松癥是一種骨代謝疾病，其特征為骨量減少，骨微結(jié)構(gòu)惡化和骨折風(fēng)險增加，破骨細(xì)胞的骨吸收超過成骨細(xì)胞的骨形成[1-2]。由于亞洲人口的體重指數(shù)較低，身高較矮，缺乏體力活動和低膳食鈣攝入量，因此東方人出現(xiàn)骨質(zhì)疏松癥更為普遍[3]。隨著抗吸收或合成代謝治療藥物研究的進展，大量的研究探索了骨質(zhì)疏松癥的科學(xué)發(fā)病機制和治療骨質(zhì)疏松癥的治療選擇，但骨質(zhì)疏松癥的潛在機制和治療仍有待闡明[4]。充足的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)對細(xì)胞存活和新陳代謝至關(guān)重要。缺氧在細(xì)胞生長抑制，氧化應(yīng)激和凋亡中起著重要的作用[5]。缺氧可以抑制大鼠成骨細(xì)胞的骨形成能力，生長和分化[6]。低氧誘導(dǎo)因子是細(xì)胞對缺氧反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)劑，許多研究已經(jīng)證明[7]低氧誘導(dǎo)因子水平降低能促進多能人類間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞的募集和分化。此外，較低水平的低氧誘導(dǎo)因子可以通過在軟骨內(nèi)骨化中激活血管內(nèi)皮生長因子來引起增強的骨重建[8]。因此，是否可以通過抑制低氧誘導(dǎo)因子介導(dǎo)的骨形成受限來治療骨質(zhì)疏松癥？本研究將探討缺氧誘導(dǎo)因子抑制劑[3-(5-羥基甲基-2-呋喃基)-1-苯基吲哚，QF-1]對骨質(zhì)疏松大鼠的影響，驗證這種方案的可行性。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

本實驗使用16周齡雌性Sprague-Dawley大鼠(購自上海實驗動物中心)，體重245～278 g。動物喂食商品實驗室食物。測試期間保持溫度恒定為25 ℃，濕度恒定為(50±20)%，允許大鼠自由接近蒸餾水。將大鼠分成3組，每組10只。QF-1 (純度98.00%)購自Sigma(St.Louis，MO)。

1.2 模型建立和治療

適應(yīng)7 d后，對大鼠進行卵巢切除術(shù)(n=20)和假手術(shù)(n=10)。10只大鼠接受假性卵巢切除術(shù)，作為對照組確定是否成功建立骨質(zhì)疏松癥模型。其余20只在戊巴比妥鈉麻醉下行雙側(cè)卵巢切除手術(shù)。去卵巢大鼠隨機分為Sham組，QF-1組，OVX組。測量每組的每日食物攝入量，并且每周稱量這些大鼠。在去卵巢后為QF-1組立即皮下注射QF-1[2.5 mg (kg·d)]，持續(xù)8周。

1.3 標(biāo)本收集和生化評估

治療8周后，在過量的異氟烷下處死大鼠。通過腹主動脈取血，離心獲取血清進行生化指標(biāo)分析，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(北京北方生物技術(shù)公司)測定血清I型前膠原氨基末端前肽(PINP)和Ⅰ型膠原羧基端肽(CTX-I)濃度。

1.4 Micro-CT檢測

采用Micro-CT(SkyScan 1174,Aartselaar，比利時)檢測大鼠右側(cè)脛骨。評估在近側(cè)生長板下方1 mm處選擇的3 mm厚的感興趣的體積(VOI)。 Micro-CT參數(shù)：管電壓50 kV；管電流：0.1mA；切片厚度：15 mm；像素尺寸：15 mm。 檢測骨體積分?jǐn)?shù)(bone volume ratio,BV/TV)，骨密度(bone mineral density,BMD)，骨小梁厚度(trabecular thickness,Tb.Th)、骨小梁數(shù)量(trabecular number,Tb.N)、骨小梁分離度(trabecular separation,Tb.Sp)。

1.5 生物力學(xué)評估

取大鼠右側(cè)股骨，將其置于MTS-858型生物力學(xué)實驗機上，支點跨距17 mm，中點為加壓點，加載速度為 2 mm/min，計算機記錄載荷-位移曲線，從載荷-變形曲線計算極限載荷(N)，能量(J)和剛度(N/mm)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 去卵巢手術(shù)對大鼠骨密度影響

來自Sham和OVX組的大鼠股骨干骺端的BMD為(230.32±29.23)mg/cm2和(184.45±26.95)mg/cm2。在定量分析中，來自Sham組的大鼠股骨干骺端的BMD比OVX大鼠的高27.3%。這些數(shù)據(jù)證實我們實驗中OVX大鼠骨質(zhì)疏松癥的建立是成功的。

2.2 Micro-CT檢測結(jié)果

治療8周大鼠的脛骨Mciro-CT掃描結(jié)果如圖1所示，微觀參數(shù)如圖2所示。與OVX組相比，QF-1組和Sham組的股骨遠(yuǎn)端骨量和小梁厚度顯著增加(P<0.05)；而OVX組的小梁間距增加(P<0.05)。但在QF-1組和Sham組中均降低(P<0.05)。骨組織形態(tài)計量學(xué)參數(shù)顯示，QF-1對去卵巢大鼠脛骨骨量和骨密度起保護作用。

圖1 治療8周后大鼠脛骨Micro-CT掃描結(jié)果Fig.1 Micro-CT scans of tibia in rats after 8 weeks treatment

圖2 治療8周后大鼠脛骨微觀參數(shù)Fig.2 Microscopic parameters of tibia in rats after 8 weeks treatment

注：與OVX比較，*P<0.05；與QF-1比較，#P<0.05。

2.3 生物力學(xué)性能

生物力學(xué)測試獲得的數(shù)據(jù)見圖3，Sham組具有最高的極限載荷，能量和剛度；與OVX組比較，QF-1組極限載荷，能量和剛度明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖3 治療對大鼠股骨生物力學(xué)的影響Fig.3 Effects of treatment on femur biomechanics

注：與OVX比較，*P<0.05；與QF-1比較，#P<0.05。

2.4 治療后大鼠血清CTX-I和PINP的影響

治療后大鼠血清CTX-I和PINP如圖4所示，與Sham組比較，OVX和QF-1組的CTX-I和PINP顯著增加(P<0.05)。 QF-1組的CTX-I和PINP較OVX組明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖4 治療對大鼠血清CTX-I和PINP的影響Fig.4 Effects of treatment on serum CTX-I and PINP

注：與Sham比較，*P<0.05；與OVX比較，#P<0.05。

3 討論

骨質(zhì)疏松癥是一種全身代謝性疾病，其特征為骨質(zhì)疏松，骨結(jié)構(gòu)細(xì)微破壞，骨強度降低和骨折風(fēng)險增加。骨質(zhì)疏松癥可分為兩類：原發(fā)性和繼發(fā)性。在臨床上，原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥可能是絕經(jīng)后婦女體內(nèi)激素缺乏的結(jié)果，它可以表現(xiàn)為老年性骨質(zhì)疏松癥本身，由許多因素引起，或者可以將其歸類為特發(fā)性。繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥主要是由以下一種或多種原因造成的：內(nèi)分泌因素，過量使用激素藥物，營養(yǎng)不足，疾病或其他原因，如日光照射，吸煙，飲酒或維生素D合成問題?？紤]到病情發(fā)展和當(dāng)前狀況，骨質(zhì)疏松癥已經(jīng)成為重要的公共衛(wèi)生問題之一。本研究中，在雌激素缺乏誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥的大鼠模型中測試QF-1的功效，并檢查骨重建中的調(diào)節(jié)功能。在OVX動物中，QF-1改善了小梁骨微結(jié)構(gòu)并減少了骨吸收。這些結(jié)果提供了QF-1作為新型抗吸收治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的有力證據(jù)。

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的骨丟失主要是由于骨形成反應(yīng)不足導(dǎo)致的骨吸收相對過多[9]。雌激素主要通過對破骨細(xì)胞施加直接作用來抑制骨吸收，盡管雌激素對成骨細(xì)胞/骨細(xì)胞的作用和T細(xì)胞介導(dǎo)的破骨細(xì)胞調(diào)節(jié)也可能起作用。生理條件下的活性基礎(chǔ)多細(xì)胞單位內(nèi)，在重塑周期的再吸收階段，骨被破骨細(xì)胞不斷移除。逆轉(zhuǎn)階段后，在形成期間，發(fā)生骨吸收的部位處由成骨細(xì)胞產(chǎn)生新的骨基質(zhì)，其中形成的骨量等于骨再吸收的量，從而維持骨量[10-11]。正常骨形成和維持需要成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞活性之間的平衡。已經(jīng)描述了一種偶聯(lián)機制，其中再吸收產(chǎn)物和破骨細(xì)胞衍生因子刺激成骨細(xì)胞譜系細(xì)胞的骨形成[10]。類似地，成骨細(xì)胞譜系中的細(xì)胞調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞形成和活性。由于重塑的耦合性質(zhì)，大多數(shù)可用的抗吸收劑也直接或間接減少骨形成，限制其對骨量的作用。在本研究中，我們觀察到QF-1治療組與OVX組相比，骨量明顯增加。

此外，我們僅觀察到QF-1對成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成作用較小，且無顯著影響。 QF-1對骨骼的合成代謝作用是否需要進一步研究及QF-1處理的破骨細(xì)胞在骨骼重塑的逆轉(zhuǎn)階段中的作用尚待確定。各種抗吸收劑靶向破骨細(xì)胞中不同的信號通路，可能為復(fù)雜病理性骨重建階段的骨質(zhì)量和質(zhì)量改善提供有用的工具[10]。應(yīng)特別注意用于治療絕經(jīng)后或老年性骨質(zhì)疏松癥藥物的禁忌癥。QF-1通過引起破骨細(xì)胞凋亡而發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用[12]，因此是骨吸收的強有力抑制劑。然而，雙膦酸鹽如阿侖膦酸鈉在骨組織中的作用會持續(xù)數(shù)年，這可能導(dǎo)致不期望的臨床副作用，包括骨壞死和非典型骨折。

聯(lián)合治療仍然是提高骨質(zhì)疏松癥患者抗骨折療效的有效方法[13]。當(dāng)考慮與其他抗吸收劑和合成代謝劑的組合療法累加效應(yīng)時，QF-1可能是更好的抗吸收性候選者。當(dāng)然，本研究也有不足之處。首先，在本研究中，我們僅分析了QF-1在OVX誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松大鼠的治療中的一個劑量和給藥途徑。盡管觀察到該劑量下QF-1的骨骼效應(yīng)很明顯，但是可以通過改變藥代動力學(xué)、給藥方式或治療持續(xù)時間來進一步改善。通過Micro-CT測量，QF-1緩解并減少了OVX大鼠的骨吸收參數(shù)。通過顯微CT測量以及血清骨吸收參數(shù)顯示，QF-1可以改善OVX大鼠骨小梁的骨丟失。QF-1的抗吸收作用提示了絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥新的治療嘗試。