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        十二井穴放血對不同程度顱腦創(chuàng)傷大鼠腦水腫及端粒 生物合成的影響?

        2018-12-17 11:57:02,,,
        關(guān)鍵詞:井穴端粒拷貝數(shù)

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        (1. 天津醫(yī)科大學,天津 300070; 2. 天津市北辰醫(yī)院腦系科,天津 300400; 3. 武警后勤學院附屬醫(yī)院腦科中心/天津市神經(jīng)創(chuàng)傷修復重點實驗室,天津 300162)

        隨著社會交通運輸業(yè)的快速發(fā)展,顱腦創(chuàng)傷(traumatic brain injury,TBI)的發(fā)生率逐年增高,其高致殘率和致死率給社會和家庭造成嚴重負擔,而TBI后繼發(fā)的腦水腫是致殘和致死的重要原因之一,因此有效地控制腦水腫是治療TBI的關(guān)鍵[1]。有研究表明,十二井穴放血療法對于改善TBI后腦水腫有一定療效,但相關(guān)機制仍未闡明[2]。端粒(telomere,TEL)是真核細胞染色體末端的一段非編碼重復序列(TTAGGG),其可隨著年齡的增長及氧化應(yīng)激、炎癥等因素的累積而不斷縮短,當縮短到一定程度時則會造成細胞凋亡[3]。另外端粒的縮短還可激活p53蛋白,進而造成線粒體功能障礙,使細胞內(nèi)乳酸堆積并形成水腫[4]。這提示端粒可能是十二井穴放血療法發(fā)揮腦保護作用的靶點之一。本實驗通過腦皮質(zhì)撞擊致法構(gòu)建不同損傷程度的TBI大鼠模型,以探討十二井穴放血療法對腦水腫的影響,同時進一步檢測端粒生物合成的相關(guān)基因表達,以及端??截悢?shù)的變化,從而為挖掘十二井穴放血療法治療TBI的機理提供更多的基礎(chǔ)支持。

        1 材料

        1.1 實驗動物

        雄性SD大鼠56只,7~8周齡,體質(zhì)量220~250 g,購自軍事醫(yī)學科學院動物實驗中心。

        1.2 主要實驗設(shè)備與試劑

        腦皮質(zhì)撞擊儀(美國Custom&Design公司),real-time PCR儀(StepOne Plus,美國ABI公司),RNA/DNA共提取試劑盒(北京天根公司),實時熒光定量試劑盒(北京康為世紀公司)。

        2 方法

        2.1 動物分組及TBI模型的構(gòu)建

        將大鼠隨機等分為7組,包括對照組(Control Group),輕、中、重度TBI組(L,M,H Group)以及輕度TBI+井穴放血組、中度TBI+井穴放血組、重度TBI+井穴放血組(L+B,M+B,H+B Group)每組各8只。各TBI組經(jīng)5%水合氯醛按6 ml/kg給予麻醉后,暴露右側(cè)大腦皮質(zhì),開口直徑約4.5 mm,調(diào)整CCI打擊臂至與垂直方向呈約20°夾角,使用直徑3 mm的打擊帽打擊大腦皮質(zhì),打擊速率為5 m/s,最低點持續(xù)時間為0.2 s,輕、中、重度TBI組的打擊深度分別為1 mm、3 mm、4 mm[5]。對照組僅開骨窗后縫合皮膚不進行打擊。

        2.2 十二井穴放血

        參考人體相應(yīng)穴位的解剖標志,用1 ml 注射器針頭點刺大鼠雙側(cè)前肢趾尖端的十二井穴,出血量為10 μL/穴,與TBI后立即行放血療法,此后每12 h進行1次放血共6次,穴位的定位方法采用比較解剖學。

        2.3 mNSS評分及標本采集

        7組大鼠均于術(shù)后第72小時行mNSS評分[6],0分為正常,18分為最嚴重,分數(shù)越高說明癥狀越嚴重。評分后采用頸椎離斷法處死大鼠,各組均取損傷部位周邊同一位點的腦皮質(zhì)約10 mg,進行后續(xù)DNA/RNA的提取,剩余腦組織進行含水量測量。

        2.4 相關(guān)基因表達及端粒拷貝數(shù)測定

        表1顯示,提取腦組織基因組DNA和總RNA,并將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,以測定端粒生物合成相關(guān)基因的表達變化,包括端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(telomerase reverse transcriptase,TERT)、端粒重復序列結(jié)合因子1(telomeric repeatbinding factor1,TRF1)以及TEL拷貝數(shù)。方法如下:配制25 μL PCR反應(yīng)體系,其中樣本量為cDNA 10ng或基因組DNA50 ng,每個基因均設(shè)置3個復孔。反應(yīng)條件為兩步法:95 ℃ 10 min預變性,隨后95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min共40個循環(huán),以0.3 ℃為升溫梯度行融解曲線分析。應(yīng)用2-ΔΔCt法計算各目的基因的相對表達量。

        2.5 腦組織含水量測定

        取腦后僅留取左右大腦半球,立即稱重,所得質(zhì)量為濕重。將大腦放至烘箱中75 ℃烘烤48 h稱重,所得質(zhì)量為干重。含水量=(濕重-干重)/濕重。

        2.6 統(tǒng)計學方法

        采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析,3組比較采用單因素方差分析,采用LSD法進行兩兩比較,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

        3 結(jié)果

        3.1 神經(jīng)功能損傷評分

        表2顯示,TBI后大鼠mNSS評分均顯著升高,且隨著TBI的嚴重程度增加評分依次增高(P<0.05),輕度、中度TBI組大鼠在施加井穴放血療法后,mNSS評分與相應(yīng)的輕度、中度TBI組比較顯著降低(P<0.05)。

        3.2 各基因表達及mtDNA拷貝數(shù)變化

        表2顯示,TBI后各組大鼠與對照組比較,TEL拷貝數(shù)顯著降低,TRET和TRF1基因表達顯著升高,且TBI越嚴重TEL拷貝數(shù)越低(P<0.05);施加井穴放血后,與相應(yīng)單純損傷組比較,輕、中度TBI組大鼠TEL拷貝數(shù)、TRET和TRF1基因表達均顯著升高(P<0.05)。

        3.3 腦組織含水量

        表2顯示,TBI后各組大鼠腦組織含水量與對照組比較均顯著增高,且輕、中度TBI組大鼠在應(yīng)用井穴放血療法后腦組織含水量與相應(yīng)的單純損傷組比較顯著降低(P<0.05)。

        4 討論

        腦水腫是TBI后常見的并發(fā)癥,一般于發(fā)病后第2~4天達到高峰,主要由創(chuàng)傷造成的氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)以及細胞缺血缺氧引起,導致顱內(nèi)壓急劇增高,進一步加重病情甚至造成腦疝威脅生命[7]。井穴位于四肢末端,是十二經(jīng)脈氣血的起始之處,針刺可促使氣血流行,有起死回生救急之妙用[8]。本實驗中,應(yīng)用井穴放血療法后有效減輕輕度和中度TBI組大鼠神經(jīng)功能損傷癥狀,并減輕TBI后腦水腫,表明對于輕中度顱腦創(chuàng)傷應(yīng)用井穴放血療法可發(fā)揮腦保護作用。這與部分學者得出的結(jié)論一致。苗笑梅等[9]發(fā)現(xiàn),十二井穴放血療法可以減輕創(chuàng)傷大鼠神經(jīng)功能缺陷,改善腦水腫,對腦組織有保護作用。張靜莎等[10]也發(fā)現(xiàn),手十二井穴放血療法有改善顱腦創(chuàng)傷患者意識狀態(tài)的作用,但上述研究均未深入探討其潛在機制。端粒是機體內(nèi)調(diào)控細胞凋亡的重要基因序列,當TEL拷貝數(shù)減少至一定程度時,可抑制線粒體氧化呼吸鏈相關(guān)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄與表達,導致線粒體功能障礙,進而通過端粒-線粒體途徑造成細胞凋亡,引起腦水腫[11]。為此該實驗檢測了損傷后腦組織中端粒生物合成相關(guān)基因表達及TEL拷貝數(shù)的變化,以期探索十二井穴放血療法發(fā)揮腦保護作用的靶點。

        表2 各組大鼠mNSS評分及基因表達變化

        注:與對照組比較:*P<0.05;與相應(yīng)單純損傷組比較:#P<0.05

        本實驗發(fā)現(xiàn),TBI后腦組織中TEL拷貝數(shù)顯著降低,腦水腫明顯,表明創(chuàng)傷或可通過造成端粒損傷而加重腦水腫。一方面,當機體因創(chuàng)傷進入應(yīng)激狀態(tài)時,過多的活性氧族及炎癥因子可直接造成端粒的縮短,受損的端粒誘導P53基因表達,啟動線粒體凋亡信號通路,促使細胞毒性腦水腫的發(fā)生[12]。另一方面,這些因子還可以通過抑制端粒酶表達,抑制端粒酶及端粒結(jié)合蛋白TRF1的活性,降低端粒-端粒酶修復系統(tǒng)的功能,促進端粒加速縮短[13]。同時本實驗結(jié)果可見,TERT及TRF1基因表達顯著升高,這可能是當端粒修復系統(tǒng)受到抑制時,端粒生物合成基因發(fā)生代償性升高的結(jié)果。當應(yīng)用井穴放血療法后,可見大鼠的TERT及TRF1基因表達進一步升高,且TEL拷貝數(shù)明顯提高,表明十二井穴放血可能是通過激活端粒生物合成相關(guān)基因的表達,促進損傷端粒的修復,從而減少線粒體功能障礙及細胞凋亡,增加細胞能量供應(yīng),減輕腦水腫嚴重程度,發(fā)揮腦保護作用。但是對于重度TBI組大鼠,單獨應(yīng)用井穴放血療法雖可使TEL拷貝數(shù)在一定程度上有所增加,但未能顯著改善神經(jīng)功能障礙及腦水腫嚴重程度,這可能源于重型TBI因損傷嚴重,可同時累及多條信號通路、多因素綜合作用加重腦水腫的形成,單獨應(yīng)用井穴放血不足以展現(xiàn)出改善腦水腫的效果,提示在應(yīng)對重型TBI時需多種治療策略綜合施治,輔以十二井穴放血療法,或可有更好的治療效果。

        綜上所述,本實驗通過構(gòu)建不同程度TBI大鼠模型,探討了井穴放血療法對腦水腫及端粒生物合成基因表達的影響,為闡明井穴放血療法發(fā)揮腦保護作用的機制提供了基礎(chǔ)研究。但TBI的發(fā)生發(fā)展還涉及多條通路及靶基因,這仍有待挖掘。若能進一步研究井穴放血療法對其他通路的影響,或許可為TBI的臨床治療乃至開發(fā)井穴放血療法的新用途提供幫助。

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