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(1. 天津醫(yī)科大學(xué)，天津 300070； 2. 天津市北辰醫(yī)院腦系科，天津 300400； 3. 武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院腦科中心/天津市神經(jīng)創(chuàng)傷修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300162)

隨著社會(huì)交通運(yùn)輸業(yè)的快速發(fā)展，顱腦創(chuàng)傷(traumatic brain injury，TBI)的發(fā)生率逐年增高，其高致殘率和致死率給社會(huì)和家庭造成嚴(yán)重負(fù)擔(dān)，而TBI后繼發(fā)的腦水腫是致殘和致死的重要原因之一，因此有效地控制腦水腫是治療TBI的關(guān)鍵[1]。有研究表明，十二井穴放血療法對(duì)于改善TBI后腦水腫有一定療效，但相關(guān)機(jī)制仍未闡明[2]。端粒(telomere，TEL)是真核細(xì)胞染色體末端的一段非編碼重復(fù)序列(TTAGGG)，其可隨著年齡的增長(zhǎng)及氧化應(yīng)激、炎癥等因素的累積而不斷縮短，當(dāng)縮短到一定程度時(shí)則會(huì)造成細(xì)胞凋亡[3]。另外端粒的縮短還可激活p53蛋白，進(jìn)而造成線粒體功能障礙，使細(xì)胞內(nèi)乳酸堆積并形成水腫[4]。這提示端粒可能是十二井穴放血療法發(fā)揮腦保護(hù)作用的靶點(diǎn)之一。本實(shí)驗(yàn)通過腦皮質(zhì)撞擊致法構(gòu)建不同損傷程度的TBI大鼠模型，以探討十二井穴放血療法對(duì)腦水腫的影響，同時(shí)進(jìn)一步檢測(cè)端粒生物合成的相關(guān)基因表達(dá)，以及端粒拷貝數(shù)的變化，從而為挖掘十二井穴放血療法治療TBI的機(jī)理提供更多的基礎(chǔ)支持。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SD大鼠56只，7～8周齡，體質(zhì)量220～250 g，購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備與試劑

腦皮質(zhì)撞擊儀(美國Custom&Design公司)，real-time PCR儀(StepOne Plus，美國ABI公司)，RNA/DNA共提取試劑盒(北京天根公司)，實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒(北京康為世紀(jì)公司)。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組及TBI模型的構(gòu)建

將大鼠隨機(jī)等分為7組，包括對(duì)照組(Control Group)，輕、中、重度TBI組(L，M，H Group)以及輕度TBI+井穴放血組、中度TBI+井穴放血組、重度TBI+井穴放血組(L+B，M+B，H+B Group)每組各8只。各TBI組經(jīng)5%水合氯醛按6 ml/kg給予麻醉后，暴露右側(cè)大腦皮質(zhì)，開口直徑約4.5 mm，調(diào)整CCI打擊臂至與垂直方向呈約20°夾角，使用直徑3 mm的打擊帽打擊大腦皮質(zhì)，打擊速率為5 m/s，最低點(diǎn)持續(xù)時(shí)間為0.2 s，輕、中、重度TBI組的打擊深度分別為1 mm、3 mm、4 mm[5]。對(duì)照組僅開骨窗后縫合皮膚不進(jìn)行打擊。

2.2 十二井穴放血

參考人體相應(yīng)穴位的解剖標(biāo)志，用1 ml 注射器針頭點(diǎn)刺大鼠雙側(cè)前肢趾尖端的十二井穴，出血量為10 μL/穴，與TBI后立即行放血療法，此后每12 h進(jìn)行1次放血共6次，穴位的定位方法采用比較解剖學(xué)。

2.3 mNSS評(píng)分及標(biāo)本采集

7組大鼠均于術(shù)后第72小時(shí)行mNSS評(píng)分[6]，0分為正常，18分為最嚴(yán)重，分?jǐn)?shù)越高說明癥狀越嚴(yán)重。評(píng)分后采用頸椎離斷法處死大鼠，各組均取損傷部位周邊同一位點(diǎn)的腦皮質(zhì)約10 mg，進(jìn)行后續(xù)DNA/RNA的提取，剩余腦組織進(jìn)行含水量測(cè)量。

2.4 相關(guān)基因表達(dá)及端?？截悢?shù)測(cè)定

表1顯示，提取腦組織基因組DNA和總RNA，并將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以測(cè)定端粒生物合成相關(guān)基因的表達(dá)變化，包括端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(telomerase reverse transcriptase，TERT)、端粒重復(fù)序列結(jié)合因子1(telomeric repeatbinding factor1，TRF1)以及TEL拷貝數(shù)。方法如下：配制25 μL PCR反應(yīng)體系，其中樣本量為cDNA 10ng或基因組DNA50 ng，每個(gè)基因均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。反應(yīng)條件為兩步法：95 ℃ 10 min預(yù)變性，隨后95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min共40個(gè)循環(huán)，以0.3 ℃為升溫梯度行融解曲線分析。應(yīng)用2-ΔΔCt法計(jì)算各目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

2.5 腦組織含水量測(cè)定

取腦后僅留取左右大腦半球，立即稱重，所得質(zhì)量為濕重。將大腦放至烘箱中75 ℃烘烤48 h稱重，所得質(zhì)量為干重。含水量=(濕重-干重)/濕重。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，3組比較采用單因素方差分析，采用LSD法進(jìn)行兩兩比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 神經(jīng)功能損傷評(píng)分

表2顯示，TBI后大鼠mNSS評(píng)分均顯著升高，且隨著TBI的嚴(yán)重程度增加評(píng)分依次增高(P<0.05)，輕度、中度TBI組大鼠在施加井穴放血療法后，mNSS評(píng)分與相應(yīng)的輕度、中度TBI組比較顯著降低(P<0.05)。

3.2 各基因表達(dá)及mtDNA拷貝數(shù)變化

表2顯示，TBI后各組大鼠與對(duì)照組比較，TEL拷貝數(shù)顯著降低，TRET和TRF1基因表達(dá)顯著升高，且TBI越嚴(yán)重TEL拷貝數(shù)越低(P<0.05)；施加井穴放血后，與相應(yīng)單純損傷組比較，輕、中度TBI組大鼠TEL拷貝數(shù)、TRET和TRF1基因表達(dá)均顯著升高(P<0.05)。

3.3 腦組織含水量

表2顯示，TBI后各組大鼠腦組織含水量與對(duì)照組比較均顯著增高，且輕、中度TBI組大鼠在應(yīng)用井穴放血療法后腦組織含水量與相應(yīng)的單純損傷組比較顯著降低(P<0.05)。

4 討論

腦水腫是TBI后常見的并發(fā)癥，一般于發(fā)病后第2～4天達(dá)到高峰，主要由創(chuàng)傷造成的氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)以及細(xì)胞缺血缺氧引起，導(dǎo)致顱內(nèi)壓急劇增高，進(jìn)一步加重病情甚至造成腦疝威脅生命[7]。井穴位于四肢末端，是十二經(jīng)脈氣血的起始之處，針刺可促使氣血流行，有起死回生救急之妙用[8]。本實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用井穴放血療法后有效減輕輕度和中度TBI組大鼠神經(jīng)功能損傷癥狀，并減輕TBI后腦水腫，表明對(duì)于輕中度顱腦創(chuàng)傷應(yīng)用井穴放血療法可發(fā)揮腦保護(hù)作用。這與部分學(xué)者得出的結(jié)論一致。苗笑梅等[9]發(fā)現(xiàn)，十二井穴放血療法可以減輕創(chuàng)傷大鼠神經(jīng)功能缺陷，改善腦水腫，對(duì)腦組織有保護(hù)作用。張靜莎等[10]也發(fā)現(xiàn)，手十二井穴放血療法有改善顱腦創(chuàng)傷患者意識(shí)狀態(tài)的作用，但上述研究均未深入探討其潛在機(jī)制。端粒是機(jī)體內(nèi)調(diào)控細(xì)胞凋亡的重要基因序列，當(dāng)TEL拷貝數(shù)減少至一定程度時(shí)，可抑制線粒體氧化呼吸鏈相關(guān)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，導(dǎo)致線粒體功能障礙，進(jìn)而通過端粒-線粒體途徑造成細(xì)胞凋亡，引起腦水腫[11]。為此該實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了損傷后腦組織中端粒生物合成相關(guān)基因表達(dá)及TEL拷貝數(shù)的變化，以期探索十二井穴放血療法發(fā)揮腦保護(hù)作用的靶點(diǎn)。

表2 各組大鼠mNSS評(píng)分及基因表達(dá)變化

注：與對(duì)照組比較:*P<0.05；與相應(yīng)單純損傷組比較:#P<0.05

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TBI后腦組織中TEL拷貝數(shù)顯著降低，腦水腫明顯，表明創(chuàng)傷或可通過造成端粒損傷而加重腦水腫。一方面，當(dāng)機(jī)體因創(chuàng)傷進(jìn)入應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，過多的活性氧族及炎癥因子可直接造成端粒的縮短，受損的端粒誘導(dǎo)P53基因表達(dá)，啟動(dòng)線粒體凋亡信號(hào)通路，促使細(xì)胞毒性腦水腫的發(fā)生[12]。另一方面，這些因子還可以通過抑制端粒酶表達(dá)，抑制端粒酶及端粒結(jié)合蛋白TRF1的活性，降低端粒-端粒酶修復(fù)系統(tǒng)的功能，促進(jìn)端粒加速縮短[13]。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，TERT及TRF1基因表達(dá)顯著升高，這可能是當(dāng)端粒修復(fù)系統(tǒng)受到抑制時(shí)，端粒生物合成基因發(fā)生代償性升高的結(jié)果。當(dāng)應(yīng)用井穴放血療法后，可見大鼠的TERT及TRF1基因表達(dá)進(jìn)一步升高，且TEL拷貝數(shù)明顯提高，表明十二井穴放血可能是通過激活端粒生物合成相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)損傷端粒的修復(fù)，從而減少線粒體功能障礙及細(xì)胞凋亡，增加細(xì)胞能量供應(yīng)，減輕腦水腫嚴(yán)重程度，發(fā)揮腦保護(hù)作用。但是對(duì)于重度TBI組大鼠，單獨(dú)應(yīng)用井穴放血療法雖可使TEL拷貝數(shù)在一定程度上有所增加，但未能顯著改善神經(jīng)功能障礙及腦水腫嚴(yán)重程度，這可能源于重型TBI因損傷嚴(yán)重，可同時(shí)累及多條信號(hào)通路、多因素綜合作用加重腦水腫的形成，單獨(dú)應(yīng)用井穴放血不足以展現(xiàn)出改善腦水腫的效果，提示在應(yīng)對(duì)重型TBI時(shí)需多種治療策略綜合施治，輔以十二井穴放血療法，或可有更好的治療效果。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建不同程度TBI大鼠模型，探討了井穴放血療法對(duì)腦水腫及端粒生物合成基因表達(dá)的影響，為闡明井穴放血療法發(fā)揮腦保護(hù)作用的機(jī)制提供了基礎(chǔ)研究。但TBI的發(fā)生發(fā)展還涉及多條通路及靶基因，這仍有待挖掘。若能進(jìn)一步研究井穴放血療法對(duì)其他通路的影響，或許可為TBI的臨床治療乃至開發(fā)井穴放血療法的新用途提供幫助。