李 瀟，周艷艷，宋曉婕，李 巖，邵艷社

(河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院, 鄭州 450002)

宮頸癌在所有女性腫瘤發(fā)病病例數(shù)中排名第三位，死亡率位居女性腫瘤的第四位，約有超過85%的患者在發(fā)展中國家[1]。大量臨床資料表明，早婚早育、性生活紊亂、宮頸創(chuàng)傷以及激素失調(diào)等均可增加宮頸癌的患病率[2]。近年來，宮頸癌患者具有年輕化趨勢(shì)。放射治療是宮頸癌臨床治療的主要手段之一，NCCN指南2012版推薦首選同步放化療[3]。由于放療的副反應(yīng)會(huì)使患者承受較大痛苦，甚至?xí)鹫＝M織并發(fā)癥，為避免此等損傷需降低腫瘤照射劑量，降低腫瘤的有效治療劑量。

黃芪甲苷(Astragaloside IV)是天然藥物黃芪的主要活性成分。已有多項(xiàng)研究表明，黃芪甲苷具有多種藥理活性、免疫調(diào)節(jié)作用、器官保護(hù)作用、降糖作用、抗細(xì)胞凋亡作用以及抗炎抗病毒作用等[4]。尚未有文獻(xiàn)關(guān)于黃芪甲苷對(duì)宮頸癌細(xì)胞的放射敏感性作用的研究。本文采用體外實(shí)驗(yàn)，觀察黃芪甲苷對(duì)Hela細(xì)胞株放射敏感性的影響，并探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

宮頸癌細(xì)胞株Hela購自上?？茖W(xué)院細(xì)胞中心；胎牛血清、胰蛋白酶和DMEM培養(yǎng)基購自Hyclone公司；MTT試劑購自美國Amresco公司；黃芪甲苷(Astragaloside IV)購自中國藥品生物制品鑒定所；青霉素、鏈霉素購自華北制藥股份有限公司；MTT試劑、碘化丙啶(PI)購自上海生工生物工程有限公司；p-EGFR、EGFR與p-Akt、Akt抗體購自美國Santa Cruz公司；其他試劑購自國產(chǎn)分析純。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與照射方法

將Hela細(xì)胞株培養(yǎng)于含10%胎牛血清中，青霉素與鏈霉素各100 U/ml的DMEM完全培養(yǎng)基中，置于37 ℃ 5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞0.25%胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞密度為5×106個(gè)/mL，置于96孔培養(yǎng)板中。

1.3 MTT法檢測(cè)黃芪甲苷對(duì)Hela細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用

收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hela細(xì)胞，計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/mL，接種于96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)貼壁后更換為加入含以下濃度的黃芪甲苷培養(yǎng)液：5、10、20、40、60、80和100 μg/mL，置于37 ℃5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，加入50 μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔加入DMSO 150 μL，溶解結(jié)晶物，于570 nm處檢測(cè)吸收值(OD值)，并計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，每個(gè)濃度設(shè)3復(fù)孔，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=1-(藥物組OD值-空白對(duì)照組OD值)/(對(duì)照組OD值-空白對(duì)照組OD值)×100%。

1.4 克隆形成實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)分為2組，放射組(6 Gy)僅給予照射處理，聯(lián)合組(Ast-IV+ 6 Gy)給予60 μg/mL黃芪甲苷和不同照射處理，用劑量為0、2、4、6、8 Gy射線照射細(xì)胞，收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hela細(xì)胞，并制成單細(xì)胞懸液。照射方法：將培養(yǎng)板置于照射野(20 cm×20 cm)內(nèi)，距射野邊緣2.5 cm，用直線加速器6MV-X線照射，源皮距(SSD)100 cm，劑量率300 cGy/min。聯(lián)合組在照射前先給予黃芪甲苷培養(yǎng)24 h后再接受X射線照射，24 h后更換10%胎牛血清的PRMI-1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)14 d。PBS液洗滌，用甲醛固定、吉姆薩液染色，自然晾干后克隆計(jì)數(shù)。多靶單擊型模型公式：SF=l-(l-e-D/D0)N勾畫細(xì)胞存活曲線，其中SF為細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)，D為放射劑量(Gy)，D0代表平均致死劑量，Dq代表準(zhǔn)域劑量，N為外推數(shù)，lnN=Dq/D0。并計(jì)算黃芪甲苷的放射增敏比(SER)：SER=D0放射/D0放射+藥物。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期

收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hela細(xì)胞，并制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×104個(gè)/mL。實(shí)驗(yàn)分空白對(duì)照組(control組)、單藥組(Ast-IV組)、放射組(6Gy)和聯(lián)合組(Ast-IV+ 6Gy)(給予黃芪甲苷培養(yǎng)24 h后再進(jìn)行照射處理)，單藥組給予60 μg/ml 黃芪甲苷，照射組與聯(lián)合組的照射劑量為6 Gy。置于37 ℃5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞并調(diào)整濃度為1×106個(gè)/mL。離心1000 r/pm，10 min，PBS洗滌、重懸，加入4 μL碘化丙啶(40 μg/mL)，流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞周期變化。

1.6 Tunel檢測(cè)細(xì)胞凋亡

將細(xì)胞接種于已滅菌的培養(yǎng)皿中，1×105個(gè)/孔，待細(xì)胞貼壁后加入黃芪甲苷使最終濃度為60 μg/mL，培養(yǎng)24 h。4%多聚甲醛 4 ℃固定 30 min，0.1%Triton X-100冰浴2 min，分別加入50 μL TUNEL檢測(cè)液，繼續(xù)置于37 ℃避光孵育 60 min，PBS洗滌，加入DAPI染液(10 mg/L)孵育15 min，抗熒光淬滅劑封片，采用共聚焦激光掃描顯微鏡觀察細(xì)胞的凋亡情況，并統(tǒng)計(jì)細(xì)胞凋亡率。

1.7 免疫印跡法

收集經(jīng)相應(yīng)處理的細(xì)胞，提取總蛋白并測(cè)定蛋白濃度，每道加入50 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入脫脂牛奶封閉1 h，加入一抗孵育1 h或者過夜，4 ℃，TBST液洗滌3次，加入相對(duì)應(yīng)的二抗室溫孵育1 h，TBST液洗滌3次，化學(xué)發(fā)光法顯色，成像掃描分析系統(tǒng)保存圖像。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 黃芪甲苷抑制Hela細(xì)胞的生長(zhǎng)作用

表1顯示，采用MTT法檢測(cè)Hela細(xì)胞在不同濃度黃芪甲苷處理下存活率的變化。 Hela細(xì)胞的存活率隨著黃芪甲苷濃度增加而下降(P<0.05)，當(dāng)黃芪甲苷濃度為60 μg/ml時(shí)，隨之黃芪甲苷的濃度增大，Hela細(xì)胞的存活率變化不明顯(P>0.05)，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用黃芪甲苷濃度為60 μg/ml進(jìn)行試驗(yàn)。

表1 不同濃度黃芪甲苷對(duì)Hela細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用

注：隨著黃芪甲苷濃度增加，細(xì)胞存活率逐漸下降，當(dāng)黃芪甲苷濃度為60 μg/ml時(shí)，繼續(xù)增加黃芪甲苷濃度，細(xì)胞存活率無顯著變化，與60 μg/mL組比較:#P>0.05；與0 μg/mL組比較：*P<0.05

注：黃芪甲苷聯(lián)合放射處理后，細(xì)胞的存活曲線左移； 與6Gy放射組比較:#P<0.05圖1 黃芪甲苷對(duì)Hela細(xì)胞的放射增敏作用

2.2 黃芪甲苷對(duì)Hela細(xì)胞的放射增敏作用

表2圖1顯示，Hela細(xì)胞經(jīng)過60 μg/mL黃芪甲苷處理后，采用不同劑量的γ射線照射，計(jì)算放射生物學(xué)參數(shù)和存活分?jǐn)?shù)，擬合細(xì)胞存活曲線，在各照射劑量下，聯(lián)合組的存活分?jǐn)?shù)低于放射組(P<0.05)；與放射組比較，聯(lián)合組的整體生存曲線左移。

表2 黃芪甲苷對(duì)Hela細(xì)胞的放射生物學(xué)參數(shù)

注：與照射組的相同放射生物學(xué)參數(shù)比較：#P<0.05

2.3 黃芪甲苷對(duì)Hela細(xì)胞周期的影響

圖2表3顯示，與空白對(duì)照組比較，其余各組的細(xì)胞均出現(xiàn)不同程度的G2/M期阻滯。其中，聯(lián)合組細(xì)胞的G2/M期所占比例顯著低于單藥組和照射組(P<0.05)，提示黃芪甲苷可降低Hela細(xì)胞放射誘導(dǎo)的G2/M期阻滯。

表3 黃芪甲苷對(duì)Hela細(xì)胞周期G2/M期的影響

注：與control組比較:*P<0.05；與6Gy組比較:#P<0.05

2.4 黃芪甲苷對(duì)Hela細(xì)胞凋亡的影響

圖3表4顯示，Tunel實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，采用60 μg/mL黃芪甲苷培養(yǎng)細(xì)胞24 h后，聯(lián)合組細(xì)胞凋亡數(shù)顯著高于空白對(duì)照組與單藥組(P<0.05)，其中正常對(duì)照組和溶劑對(duì)照組之間的細(xì)胞凋亡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖2 黃芪甲苷對(duì)Hela細(xì)胞周期G2/M期的影響

注：圖中箭頭指向?yàn)榈蛲黾?xì)胞圖3 黃芪甲苷對(duì)Hela細(xì)胞凋亡的影響(×200)

2.5 黃芪甲苷對(duì)Hela細(xì)胞中p-EGFR、EGFR與p-Akt、Akt的蛋白表達(dá)影響

圖4 黃芪甲苷對(duì)Hela細(xì)胞中p-EGFR、EGFR與 p-Akt、Akt蛋白表達(dá)的影響

圖4表5顯示，照射組細(xì)胞中p-EGFR與p-Akt的蛋白表達(dá)明顯高于空白對(duì)照組和單藥組，聯(lián)合組細(xì)胞中p-EGFR與p-Akt的蛋白表達(dá)顯著低于照射組和單藥組(P<0.05)，各組細(xì)胞中EGFR與Akt比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表4 黃芪甲苷對(duì)Hela細(xì)胞凋亡的影響

注：與control組比較：*P<0.05

表5 黃芪甲苷對(duì)Hela細(xì)胞中p-EGFR，EGFR與p-Akt、Akt的蛋白表達(dá)影響

注：與control組比較：*P<0.05；與6Gy組比較:#P<0.05

3 討論

從MTT試驗(yàn)結(jié)果可知，當(dāng)黃芪甲苷濃度達(dá)到60 μg/ml后，隨著藥物濃度增大，Hela細(xì)胞的存活率變化不明顯，因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中黃芪甲苷的濃度采用60 μg/ml，提示黃芪甲苷具有抑制宮頸癌細(xì)胞Hela增殖的作用。通過多靶單擊模型繪制放射存活曲線可見，在各個(gè)照射劑量下，Ast-IV+ 6 Gy組的存活分?jǐn)?shù)均低于6 Gy組，提示黃芪甲苷具有增強(qiáng)X射線對(duì)Hela細(xì)胞的殺傷作用；與6 Gy組比較，Ast-IV+ 6 Gy組的曲線向左下方移，Dq值減小，肩區(qū)減少，提示黃芪甲苷對(duì)Hela細(xì)胞的亞致死性損傷修復(fù)能力減弱，D0值減少，提示黃芪甲苷具有增加Hela細(xì)胞X射線敏感性的作用。

多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)顯示，細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)能力是細(xì)胞照射敏感性的主要決定因素之一[5]，當(dāng)輻射產(chǎn)生的高活性化學(xué)自由基造成細(xì)胞內(nèi)DNA損傷，雙鏈斷裂。另一個(gè)重要決定因素是細(xì)胞周期調(diào)控，大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，細(xì)胞的放射敏感性隨細(xì)胞周期時(shí)相的變化而改變。腫瘤細(xì)胞受到放射引起DNA損傷后，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯與G1/S期或G2/M期，進(jìn)行DNA損傷的修復(fù)[6]，未能成功修復(fù)則啟動(dòng)凋亡信號(hào)使細(xì)胞產(chǎn)生凋亡[7]。細(xì)胞周期不同階段對(duì)放射敏感性不同，其中以G2/M期最為敏感，出現(xiàn)G2/M期阻滯，一方面細(xì)胞無法增殖分化，另一方面DNA損傷修復(fù)也會(huì)被阻止[8]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)射線照射誘導(dǎo)Hela細(xì)胞的G2/M期阻滯，采用黃芪甲苷干預(yù)后顯著縮短放射誘導(dǎo)Hela細(xì)胞的G2/M期所占比例，降低阻滯程度，從而增加Hela細(xì)胞的放射敏感性。

表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)具有酪氨酸激酶活性，是調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞分化和生長(zhǎng)的重要信號(hào)傳導(dǎo)通路之一。當(dāng)其過表達(dá)或異?；罨瘯r(shí)，與促進(jìn)腫瘤形成且參與放射誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞損傷修復(fù)機(jī)制密切相關(guān)[9]。研究表明，放射線直接或間接作用于DNA，導(dǎo)致DNA損傷，通過DNA雙鍵斷裂誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。EGFR活化后從胞漿進(jìn)入胞核，與DNA-PK結(jié)合，催化DNA-PKcs磷酸化，直接調(diào)節(jié)放射誘導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)。研究發(fā)現(xiàn)，X射線照射顯著引起肝癌細(xì)胞中的PI3K磷酸化，進(jìn)一步引起Akt發(fā)生磷酸化；黃芪甲苷聯(lián)合照射處理后，Hela細(xì)胞的EGFR與Akt磷酸化水平低于單純照射的細(xì)胞，提示黃芪甲苷能夠抑制X射線照射引起的Akt磷酸化，抑制PI3K/Akt信號(hào)通路的活化，從而提高Hela細(xì)胞的放射敏感性。進(jìn)一步推測(cè)黃芪甲苷可能通過抑制內(nèi)源化配體與EGFR結(jié)合，進(jìn)一步阻斷EGFR介導(dǎo)的PI3K/Akt信號(hào)通路，干擾DNA損傷修復(fù)，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，降低放射抗拒性，增加對(duì)Hela細(xì)胞放射增敏的作用。更具體的黃芪甲苷增加Hela細(xì)胞放射敏感性的深入機(jī)制，正在進(jìn)行更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)中。本實(shí)驗(yàn)對(duì)黃芪甲苷用于宮頸癌的臨床研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。黃芪是常用的傳統(tǒng)中草藥，容易獲得且可以廣泛推廣使用。