范小麗，侯 倩，戚蕓毓，崔麗萍，趙 軍

(1.濰坊醫(yī)學(xué)院，山東濰坊 261053；2.山東省濰坊市人民醫(yī)院病理科 261000；3.山東省濰坊市人民醫(yī)院腎內(nèi)科 261000)

足細(xì)胞是避免機(jī)體蛋白質(zhì)丟失的最后一道屏障。足細(xì)胞的減少和丟失成為反映腎小球損傷嚴(yán)重程度和硬化進(jìn)展的重要觀察及預(yù)測(cè)指標(biāo)[1]。因此，識(shí)別特異性生物標(biāo)志物評(píng)估早期的足細(xì)胞損傷非常重要。有研究發(fā)現(xiàn)，血管生成素樣蛋白-4(Angptl4)作為一種非免疫性循環(huán)因子介導(dǎo)足細(xì)胞病變中的蛋白尿，并可加重高三酰甘油血癥[2]。本研究通過(guò)對(duì)比不同病理類型腎臟病患者血清及尿液Angptl4水平，并與臨床化驗(yàn)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，探討Angptl4與足細(xì)胞損傷的關(guān)系，促進(jìn)足細(xì)胞病變患者的早期診斷與治療。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年9月至2017年9月濰坊市人民醫(yī)院收治的193例經(jīng)腎穿刺活檢病理確診為微小病變腎病(MCD)、膜性腎病(MN)、IgA腎病(IgA-N)的患者作為研究對(duì)象。其中MCD組男36例、女23例，平均年齡(54.31±22.16)歲；MN組男25例、女21例，平均年齡(46.03±15.95)歲；IgA-N組男26例、女20例，平均年齡(44.80±12.63)歲；微小病變腎病完全緩解(MCD-CR)組男25例、女17例，平均年齡(42.25±15.96)歲。各組間性別、年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。排除標(biāo)準(zhǔn)：代謝綜合征、紫癜性腎炎、狼瘡性腎炎、糖尿病、高血壓病、肝病、甲狀腺疾病、血液病及腫瘤等繼發(fā)因素；Alport綜合征、薄基底膜腎病、Fabry病等遺傳性腎病；近期感染史、重金屬接觸史；慢性腎病患者含透析、腎移植者；采集血液、尿液標(biāo)本24 h內(nèi)未應(yīng)用非甾體類消炎藥、糖皮質(zhì)激素、細(xì)胞毒藥物或免疫抑制劑。研究對(duì)象均同意，并簽署知情同意書(shū)。

1.2方法

1.2.1血清及尿液Angptl4水平檢測(cè) 留取患者治療前(入院時(shí))及患者門(mén)診隨診時(shí)清晨空腹靜脈血3 mL及24 h尿液5 mL，離心后采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法分別檢測(cè)Angptl4水平，人Angptl4試劑盒購(gòu)自上海茁彩生物科技有限公司。操作步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.2生化指標(biāo)檢測(cè) 采用羅氏示差脈沖極譜法全自動(dòng)生化儀檢測(cè)24 h尿蛋白定量(24U-TP)、血清清蛋白(ALB)、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、血肌酐(Scr)等指標(biāo)。

1.2.3腎組織標(biāo)本采集及病理 每位患者均在局部麻醉下行B超引導(dǎo)下經(jīng)皮腎穿刺，并分別留取2～3條長(zhǎng)約10～15 mm腎組織。(1)光鏡部分：新鮮腎活檢標(biāo)本作成5 μm冰凍切片，熒光標(biāo)記后于熒光顯微鏡下觀察，腎組織經(jīng)甲醛固定，石蠟包埋后制成厚度2 μm切片，六胺銀染色(PASM)、Masson染色后光鏡下觀察。(2)電鏡部分：約1 mm3大小腎皮質(zhì)經(jīng)固定、包埋、切片后透射電鏡下觀察。

2 結(jié) 果

2.1各組患者相關(guān)臨床指標(biāo)水平比較 IgA-N組、MCD-CR組的24U-TP、ALB、TG、TC與MCD組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。IgA-N組、MCD-CR組的24U-TP、ALB、TG、TC與MN組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。MCD-CR組的24U-TP、ALB、TG、TC與IgA-N組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組患者相關(guān)臨床指標(biāo)水平比較

注:與MCD組比較，*P<0.05；與MN組比較，#P<0.05；與IgA-N組比較，&P<0.05

表2 各組患者血清、尿液Angptl4水平比較

注:與MCD組比較，*P<0.05；與MN組比較，#P<0.05；與IgA-N組比較，&P<0.05

2.2各組患者血清、尿液Angptl4水平比較 血清Angptl4水平比較，MCD組、MCD-CR組高于MN組、IgA-N組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。尿液Angptl4水平比較，MCD-CR組低于MCD組、MN組及IgA-N組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表2。

2.3各組血清Angptl4水平與其他臨床指標(biāo)相關(guān)分析 MCD組血清Angptl4水平與24U-TP、TG呈正相關(guān)(P<0.05),與ALB呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表3。

2.4各組尿液Angptl4水平與其他臨床指標(biāo)相關(guān)分析 MCD組、MN組尿液Angptl4水平與24U-TP、TG呈正相關(guān)(P<0.05)，與ALB呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)；IgA-N組尿液Angptl4與24U-TP呈正相關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表3 各組患者血清Angptl4與相關(guān)臨床指標(biāo)相關(guān)性分析

表4 各組患者尿液Angptl4與相關(guān)臨床指標(biāo)相關(guān)性分析

2.5PASM染色結(jié)果 IgA-N組腎小球基底膜空泡變性，系膜細(xì)胞和基質(zhì)輕度增生，足細(xì)胞未見(jiàn)明顯異常。與IgA-N相比，MN組、MCD組腎小球存在顯著的足細(xì)胞增生、腫脹伴空泡變性。見(jiàn)圖1。

注：A為IgA-N組；B為MN組；C為MCD組

圖1各組腎組織PASM染色(×400)

2.6腎小球足細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變結(jié)果 IgA-N組系膜細(xì)胞和基質(zhì)增生，足突節(jié)段性融合；MN組基底膜不規(guī)則增厚，上皮下可見(jiàn)電子致密物沉積，足突融合；MCD組腎小球上皮細(xì)胞足突彌漫融合、脫落。見(jiàn)圖2。

注：A為IgA-N組；B為MN組；C為MCD組

圖2各組足細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變(投射電鏡，×5 000)

3 討 論

Angptl4主要在人體肝臟、脂肪組織中表達(dá)，腎臟、骨骼肌、心肌、胎盤(pán)中也有少量表達(dá)。該種標(biāo)志物參與了血管生成、糖脂代謝、腫瘤轉(zhuǎn)移等病理生理過(guò)程[3-4]。機(jī)體存在兩種形式的Angptl4，正常唾液酸化(中性等電點(diǎn))的Angptl4來(lái)源于肝臟、脂肪組織和正常腎小球，低唾液酸化(高等電點(diǎn))的Angptl4由腎小球受損足細(xì)胞過(guò)度分泌。有研究發(fā)現(xiàn)腎小球足細(xì)胞分泌的低唾液酸化形式的Angptl4可與腎小球基底膜硫酸類肝素蛋白聚糖相互作用引起電荷屏障改變，導(dǎo)致足突融合，推測(cè)此為蛋白尿產(chǎn)生的主要原因[5]。

本研究發(fā)現(xiàn)，患者血清Angptl4水平比較，MCD組和MN組高于IgA-N組(P<0.05)，MCD組血清Angptl4與24U-TP、TG水平呈正相關(guān)，與ALB呈負(fù)相關(guān)，這與以往研究結(jié)果顯示的隨足細(xì)胞損傷程度加重，循環(huán)中Angptl4增多并加重高TG血癥一致[6-9]。足細(xì)胞損傷患者蛋白尿達(dá)腎病范圍時(shí)，尿液丟失清蛋白增多，循環(huán)中游離脂肪酸與清蛋白比例升高，使骨骼肌、心臟和脂肪組織中游離脂肪酸攝取增加，循環(huán)中Angptl4水平反應(yīng)性升高，一方面通過(guò)系統(tǒng)反饋環(huán)路調(diào)節(jié)Angptl4與腎小球內(nèi)皮細(xì)胞 v 5整聯(lián)蛋白結(jié)合來(lái)減少蛋白尿，另一方面在局部反饋環(huán)路中，Angptl4通過(guò)抑制脂蛋白脂酶的活性減少TG水解為脂肪酸，導(dǎo)致高TG血癥[7]。MCD-CR組患者血清Angptl4水平高于MCD組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，可能的原因之一為血清Angptl4不能透過(guò)腎小球?yàn)V過(guò)膜，MCD患者多為激素敏感性，可在短時(shí)間內(nèi)迅速緩解，緩解后的MCD患者已經(jīng)升高的血清Angptl4水平的恢復(fù)存在延遲；其次，MCD患者在足細(xì)胞損傷早期，僅受損足細(xì)胞分泌的Angptl4上調(diào)，而腎外組織中尚未上調(diào)；同時(shí)，足細(xì)胞分泌的Angptl4是否會(huì)進(jìn)入循環(huán)還待進(jìn)一步證實(shí)；最后可能的原因是循環(huán)中的一部分Angptl4隨大量蛋白尿的產(chǎn)生從尿液中丟失。

本研究中，患者尿液Angptl4水平比較，MCD組、MN組明顯高于IgA-N組、MCD-CR組，經(jīng)治療后MCD-CR組的Angptl4水平明顯降低，并低于其他3組，這與研究發(fā)現(xiàn)的MCD、MN患者及模型大鼠中Angptl4的腎小球表達(dá)和尿液排泄明顯增加一致[10-11]。與IgA-N組相比，MN組、MCD組存在顯著的足細(xì)胞足突增寬、融合甚至脫落，MCD組、MN組尿液Angptl4水平與24U-TP、TG呈正相關(guān)，與ALB水平呈負(fù)相關(guān)，雖然IgA-N組尿液Angptl4水平與24U-TP呈正相關(guān)，但其水平低于MCD組及MN組，說(shuō)明尿液Angptl4水平隨著尿蛋白的增加而增加，考慮與腎小球受損足細(xì)胞過(guò)度分泌Angptl4導(dǎo)致基底膜電荷屏障受損的程度有關(guān)，這與CLéMENT等[12]研究亦相符，他們發(fā)現(xiàn)足細(xì)胞特異性過(guò)表達(dá)Angptl4的轉(zhuǎn)基因大鼠再現(xiàn)了MCD的主要特征(大量蛋白尿、廣泛足突融合及腎小球基底膜電荷屏障受損)，而脂肪組織特異性過(guò)表達(dá)Angptl4的轉(zhuǎn)基因大鼠僅存在高循環(huán)水平的Angptl4導(dǎo)致的高TG血癥，卻不會(huì)產(chǎn)生蛋白尿。同時(shí)尚不能排除大量蛋白尿患者從尿液中丟失有活性的脂蛋白脂酶，進(jìn)一步加重高TG血癥。補(bǔ)充N-乙酰-D-氨基甘露糖胺(ManNAc)唾液酸化Angptl4可以顯著降低MCD模型大鼠的蛋白尿程度，這可能成為一種新的非免疫方式治療足細(xì)胞病變[12-14]。LI等[10]研究發(fā)現(xiàn)在MCD模型大鼠中腎小球受損足細(xì)胞中Angptl4表達(dá)的上調(diào)比足細(xì)胞損傷標(biāo)志物desmin更早達(dá)峰。以上研究結(jié)果均提示，尿液Angptl4水平的變化可能有助于預(yù)測(cè)早期足細(xì)胞損傷的程度。

綜上所述，足細(xì)胞損傷患者尿液Angptl4水平顯著升高，與24U-TP、TG水平呈正相關(guān)，與ALB水平呈負(fù)相關(guān)。MCD患者的血清Angptl4水平隨24U-TP的增多而升高，并能加重高TG血癥。因此，尿液Angptl4水平反映了足細(xì)胞病變患者蛋白尿的嚴(yán)重程度，并可能成為預(yù)測(cè)足細(xì)胞早期損傷的新型生物標(biāo)志物。