度 蔚，陳昭穎

(武漢市精神衛(wèi)生中心檢驗科 430012)

肺癌的發(fā)病率和病死率居我國惡性腫瘤首位，有80%的患者為非小細胞肺癌(NSCLC)，在診斷時，70%的NSCLC患者都已經(jīng)達到晚期，5年生存率較低[1]。肺癌的復發(fā)和轉移成為患者長期生存的重要因素[2]。有研究顯示，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中，腫瘤干細胞(CSC)具有非常重要的作用。此種細胞是指具有多向分化潛能、無限自我更新的干細胞生物學特性的一種細胞群體[3]。側群細胞(SP細胞)是在流式細胞實驗中發(fā)現(xiàn)的一組細胞亞群，含有豐富的造血重建細胞，存在較為明顯的干細胞特性[4]。研究發(fā)現(xiàn)，大部分腫瘤SP細胞中可能含有大量的腫瘤起始細胞，在實驗過程不僅在體外表現(xiàn)出顯著的增殖活力，而且在體內異種移植瘤實驗中也表現(xiàn)出較強的成瘤能力，比非SP細胞(NSP細胞)明顯較強[5]。針對此種情況，本研究旨在對分選肺癌細胞株SP及鑒定其干細胞特性進行分析，從而更好實施肺癌的預后評估以及靶向治療。

1 材料與方法

1.1材料來源 肺癌細胞株NCI-H460和SK-MES-1購買自中國科學院細胞庫，在常規(guī)復蘇結束之后通過RPMI 1640培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，其中還包括了鏈霉素100 μg/mL、青霉素100 U/mL和10%的胎牛血清。然后將培養(yǎng)基放置在37 ℃，CO2飽和濕度為5%的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，定期更換培養(yǎng)液，進行傳代培養(yǎng)。選擇從上海生工動物實驗中心購買的18只BALB/C裸小鼠進行裸鼠成瘤實驗，小鼠均為雌性，且均為4周齡大小，正常的方式進行飼養(yǎng)，適應1周。

1.2方法 通過流式細胞儀對SP與非SP細胞進行分選，然后進行培養(yǎng)并且傳代，選擇的培養(yǎng)基分別為正常情況及干細胞培養(yǎng)基。對細胞分化能力與表型進行觀察；通過電鏡對細胞進行觀察，了解其超微結構；利用免疫熒光對干細胞標志物CD44的表達進行檢測；利用CCK-8法對細胞增殖能力進行檢測，平板克隆、裸鼠成瘤實驗及Transwell侵襲實驗對細胞進行了解，明確其惡性程度。

1.2.1流式細胞儀分選SP細胞 選擇對數(shù)生長期細胞，然后采取胰酶消化并進行離心操作，選擇含2%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液重懸，制備濃度為1×106/mL單細胞懸液。加入Hoechst 5 μg/mL和維拉帕米50 μmol/L，采取水浴孵育的方式，溫度設定為37 ℃，時長為60 min；當染色完成后馬上放置在冰上，然后停止染色操作，進行離心，并且充分的洗滌與重懸后，將1 μg/mL的碘化丙啶加入其中，放置30 min；選擇美國BD公司生產(chǎn)的流式細胞儀進行分選，按照加維拉帕米組的流式，即“門”的圖形來設定未加維拉帕米組流式圖形的SP區(qū)域。

1.2.2觀察細胞表型和分化能力 對干細胞培養(yǎng)基進行配置：DMEM/F12(1∶1)培養(yǎng)基+表皮細胞生長因子(20 μg/L)+重組(人)堿性成纖維細胞生長因子(20 μg/L)+B27(2%)，培養(yǎng)基選擇RPMI 1640培養(yǎng)液，其中加入10%胎牛血清，重懸細胞濃度為1×105/mL；選擇直徑為6 cm的培養(yǎng)皿，定期更換培養(yǎng)液，進行傳代培養(yǎng)。培養(yǎng)3 d之后，通過倒置顯微鏡對細胞形態(tài)進行觀察并拍照，然后重復3次實驗。進行連續(xù)培養(yǎng)直到第5代，然后對SP細胞的分化能力與比例進行檢測。

1.2.3電鏡觀察超微結構 單細胞懸液的標準為1×106/mL，然后進行離心運動，轉速為1 000 r/min，時長為5 min，然后進行洗滌，結束之后繼續(xù)進行離心操作；通過乙醇進行固定，然后進行離心操作等一系列過程中，最終進行充分的洗滌；進行離心操作，在4 ℃環(huán)境下，在1%四氧化鋨的環(huán)境中固定2 h；首先進行脫水操作，然后利用618號樹脂進行包埋處理，再者通過Reicher超薄切片機進行切片，最后利用Philips CM120透射電鏡進行觀察。

1.2.4免疫熒光檢測CD44的表達 選擇標準為2×104/mL的細胞，然后接種在培養(yǎng)皿中進行細胞爬片，培養(yǎng)3 d后通過免疫熒光進行檢測；首先進行洗滌處理，然后放置在4%多聚甲醛進行固定，時長為30 min，然后繼續(xù)洗滌，然后加入10%封閉液放置在室溫環(huán)境中30 min；通過滴加的方式加入美國Sigma公司生產(chǎn)的鼠抗人單克隆一抗，標準為1∶2 000，放入到37 ℃環(huán)境中進行孵育，時長為2 h，然后放入到4 ℃環(huán)境中過夜；通過滴加的方式加入美國Sigma公司生產(chǎn)的羊抗鼠多克隆抗體IgG二抗，標準為1∶2 000，放入到37 ℃環(huán)境中進行孵育，時長為45 min，采取閉關處理；選擇的標準為10 μg/mL DAPI，放入到37 ℃環(huán)境中進行孵育，時長為10 min，然后進行洗滌處理，烘干操作；最后蓋上玻璃片進行封片處理，通過熒光顯微鏡進行觀察并且拍照。

1.2.5細胞增殖能力和惡性程度 CCK-8法：選擇具有96個孔的孔板進行接種，每孔接種的細胞數(shù)量標準為1×104/mL，接種結束后通過CCK-8試劑分別對第2、5和7天的情況進行檢測，通過光吸收度值(AV值)來衡量活細的胞增殖速度。每個組中設置有重復孔，具體數(shù)量為5，重復3次實驗取得平均值。

平板克?。?×104/mL重懸細胞，培養(yǎng)板為6孔，選出100 μL進行接種，選擇的培養(yǎng)液為RPMI 1640，其中加入了15%胎牛血清，培養(yǎng)液的容量為3 mL，每個組中設置有重復孔，具體數(shù)量為3，然后將培養(yǎng)基放置在37 ℃，CO2飽和濕度為5%的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，時長為2周；結束后，每孔加入的染液標準為1∶10 Giemsa，在室溫環(huán)境下進行染色，時長為10 min，對克隆的形成過程進行觀察并計數(shù)。

Transwell侵襲實驗：創(chuàng)造出人工重組基底膜，對細胞濃度進行調整，具體標準是1×106/mL，把Transwell小室的上室浸入到下室培養(yǎng)液當中，上室中加入細胞懸液，容量為100 μL，在下室中加入培養(yǎng)液RPMI 1640，容量為600 μL，培養(yǎng)液中還加入了20%胎牛血清；小室放置在培養(yǎng)箱中進行孵育，時長為24 h，然后進行充分的洗滌，利用濃度為75%的乙醇進行固定，時長為10 min，然后4%臺盼藍進行染色，時長為10 min，繼續(xù)洗滌，然后通過200倍光鏡對微孔濾膜下室面侵襲的腫瘤細胞數(shù)進行計數(shù)，每張膜選擇上、中、下、左、右5個不同的視野，選擇平均值。重復3次實驗。

裸鼠成瘤實驗：通過隨機數(shù)字表法將祼鼠進行分組，共包括3組，每組6只，每組接種的細胞數(shù)量分別為104、105和106個。然后，通過RPMI 1640培養(yǎng)液和Matrigel混合液(1∶1)重懸細胞為5×104/mL、5×105/mL和5×106/mL 3個濃度。濃度為10%的水合氯醛，共75 μL對裸鼠進行麻醉，在腋下皮下進行注射細胞懸液，容量為200 μL，8周后將裸鼠處死，對轉移及成瘤的情況進行觀察，取出瘤體行HE和免疫組織化學染色。

2 結 果

2.1流式細胞儀分選SP細胞 初次分選NCI-H460和SK-MES-1細胞株NSP和SP細胞所占百分比，與再純化細胞株NSP和SP細胞所占百分比進行比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 流式細胞儀分選兩種肺癌細胞株中SP細胞百分比和再純化百分比

2.2細胞表型和分化能力 在干細胞培養(yǎng)基中，NSP和SP細胞都無法形成干細胞球，然而增殖速度較快。SP細胞具有較小的胞體，存在折光性及較長的神經(jīng)絲樣突起，表現(xiàn)集聚生長；NSP細胞具有較大的胞體，存在扁平的特征，以及沒有神經(jīng)絲樣突起，表現(xiàn)接觸抑制的單層生長。當培養(yǎng)到第5代時，SP細胞與NSP細胞分別表現(xiàn)出的是不顯著的變化及混雜表型。其中，當培養(yǎng)到第4代的時候，NSP細胞表現(xiàn)出的是一致的表型，逐漸表現(xiàn)出分化能力，見圖1。

2.3電鏡觀察超微結構 電鏡下SP細胞具有較大的核體、細胞質較少，即具有較高的核質比；NSP細胞具有較小的核體、較多的細胞質，具有較低的核質比。從細胞器方面進行比較，SP細胞質顯著少于NSP細胞，見圖2。

注：A為SP細胞表型；B為NSP細胞表型

圖1光鏡下觀察SP和NSP的細胞表型(×200)

注：A為SP細胞超微結構；B為NSP細胞的超微結構

圖2電鏡觀察SP和NSP的細胞超微結構(×1 000)

2.4免疫熒光檢測CD44的表達 NCI-H460和SK-MES-1細胞株SP細胞能夠對CD44高表達，組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 免疫熒光檢測兩種肺癌細胞株中SP和NSP細胞CD44的表達

表3 兩種肺癌細胞株SP和NSP細胞不同培養(yǎng)時間的細胞增殖能力比較

注：與同細胞株同時間NSP細胞比較，#P<0.05； 與同細胞株同細胞第2天比較，△P<0.05；與同細胞株同細胞第5天比較，*P<0.05

2.5細胞增殖能力 對比NCI-H460和SK-MES-1細胞株SP細胞與NSP細的AV值在第2、5和7天時的數(shù)據(jù)情況，前者明顯比后者高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3。

2.6細胞惡性程度 SK-MES-1和NCI-H460細胞株SP細胞平均克隆數(shù)和克隆形成率顯著高于NSP細胞，侵襲過膜的平均細胞數(shù)增加，成瘤裸鼠數(shù)目增多，均無轉移灶，瘤體HE和免疫組化染色證實為典型肺癌細胞，見表4。

表4 兩種肺癌細胞株SP和NSP細胞的細胞惡性程度比較

注：與NSP細胞比較，#P<0.05

3 討 論

實驗表明，大部分腫瘤細胞系和肺癌組織都具有SP細胞，且存在類干細胞特性[6]。然而對于肺癌SP細胞而言，在生物學特性方面至今都沒有給予肯定。本研究表明，經(jīng)過初次分選之后，所得兩種不同的肺癌細胞株SP達到3.5%，再純化之后具有較高的百分比，傳代培養(yǎng)細胞具有良好的生長狀況。在干細胞培養(yǎng)基中，NSP和SP細胞都無法形成干細胞球，但具有更快的增殖速度；SP細胞表現(xiàn)出的是集聚生長，NSP細胞表現(xiàn)出接觸抑制的單層生長；在傳代培養(yǎng)過程中，SP細胞變化表現(xiàn)不顯著，當培養(yǎng)到第5代時，NSP細胞表現(xiàn)出混雜表型，以及一定的分化潛能；通過電鏡進行觀察，從細胞核質方面進行分析，SP細胞較高，而NSP較低。這些都反映出SP細胞具有腫瘤的分化與增殖能力[7]。從CSC學說的角度進行研究，它們一方面啟動了腫瘤的生長和形成，另一方面還對腫瘤的復發(fā)與轉移具有重要的意義，是導致腫瘤異質性一項重要因素[8]。SP細胞中富含CSC，SP分選技術已成為富集CSC十分簡單、有效方法。SP細胞具有高致瘤性、自我更新、多向分化、耐藥潛能，這些特性與CSC十分相似，已成為研究CSC的重要切入點。

通過深入研究得知，SP細胞能夠對CD44高表達，從增值能力進行對比發(fā)現(xiàn)SP細胞明顯比NSP細胞高，克隆形成率和平均克隆數(shù)明顯提高。在侵襲過膜方面，平均細胞數(shù)有所提高，成瘤裸鼠的數(shù)量也有所增加，都沒有轉移灶，瘤體HE與免疫組織化學染色都得到了證實，均屬于典型肺癌細胞。需要注意的是肺癌細胞株SP細胞具有干細胞特性，在腫瘤的侵襲、增殖及分化等方面都有參與[9-10]。目前，在多種腫瘤細胞系如NSCLC、胃癌、肝癌、鼻咽癌、結腸癌、乳腺癌、子宮內膜癌等，和多種腫瘤組織如肝癌、膠質母細胞瘤、平滑肌瘤、骨髓等中成功分離得到SP細胞。在懸浮腫瘤細胞球的形成能力方面，在無血清培養(yǎng)基中SP細胞比NSP細胞更強；在SP細胞中ABCG2和CD133的表達強度比NSP細胞更強；SP細胞的耐藥存活能力及體外增殖能力比NSP以及未分選出的細胞更強；在體外SP細胞能夠發(fā)生分化現(xiàn)象，變成NSP細胞，然而NSP細胞無法分化成SP細胞，在裸鼠體中SP細胞的致瘤性非常強。

綜上所述，本研究證實肺癌細胞中的確存在SP細胞，并且存在干細胞促瘤特性，為更好地研究腫瘤的靶向治療及發(fā)生機制提供了依據(jù)。