張 紅，魏雪瑩，陳加蓓，陳思佳，賀建武,2

(1.吉首大學生物資源與環(huán)境科學學院，湖南 吉首 416000；2.吉首大學杜仲綜合利用技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室，湖南 吉首 416000)

隨著世界人口不斷增長，環(huán)境污染問題日益嚴峻，化石能源面臨枯竭，能源的供需矛盾進一步升級.生物質(zhì)能源(Biomass Energy)是地球上最豐富的可再生物資源，有替代化石燃料的廣闊發(fā)展?jié)摿?在生物質(zhì)能源中，纖維素和半纖維素類物質(zhì)是最主要的部分.[1]農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的玉米芯、玉米秸稈、小麥秸稈和水稻秸稈等廢棄物，產(chǎn)量大、可再生，利用其木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)可用來生產(chǎn)液體燃料和高附加值化合物，變廢為寶，可望成為保障人類社會可持續(xù)發(fā)展的重要替代能源.

相對于物理降解和化學降解而言，微生物降解木質(zhì)纖維素具有成本低、反應條件溫和、對環(huán)境安全友好等優(yōu)點，有報道[2]稱來自真菌的木質(zhì)纖維素降解酶通常可將木質(zhì)纖維素材料水解為葡萄糖等碳水化合物.里氏木霉Trichodermareesei是多細胞的絲狀真核微生物，是紅褐肉座菌Hypocreajecorina的無性型酶，隸屬于叢梗孢目Moniliales木霉屬Penicillium[3]，具有高效的纖維酶水解活性，是重要的纖維素降解模式菌株和工業(yè)菌株.雖然T.reesei基因組中僅包含200多種負責編碼糖苷水解酶的基因，遠少于其他絲狀真菌，但其外分泌纖維素酶的能力較其他絲狀真菌最高[4].2003年，F(xiàn)oreman等[5]發(fā)現(xiàn)有2個蛋白可以伴隨著纖維素酶一起被誘導，并且協(xié)助纖維素酶對木質(zhì)纖維素進行有效降解.這2個蛋白酶基因被分別命名為CIP 1和CIP 2.近期發(fā)現(xiàn)CIP 1與裂解酶在結(jié)構(gòu)上有相似性，CIP 2屬于CE15家族的葡萄醛酸酯酶[6]，但其更詳細的生物學信息沒有得到闡述.筆者選取里氏木霉生物降解酶CIP 1和CIP 2，利用生物信息學方法，分析蛋白CIP 1和CIP 2的理化性質(zhì)、二級結(jié)構(gòu)、信號肽、定位、跨膜結(jié)構(gòu)和磷酸化位點等信息，進行結(jié)構(gòu)和功能的預測，了解蛋白CIP 1和CIP 2功能和它們與纖維素酶協(xié)同作用，以期實現(xiàn)纖維素酶更高效率的降解，降低工業(yè)上酶用量，減少生產(chǎn)成本.

1 材料與方法

1.1 蛋白基因序列獲取

根據(jù)Forman[5]在GneBank(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)中提交的TrichodermareeseiQM6a菌株生物降解酶基因序列CIP 1(Genbank Accession Number:AY281370.1)和CIP 2(Genbank Accession Number:AY281368.1)獲取相應的酶基因序列，以FASTA格式保存為計算機本地文件.

1.2 氨基酸分析

NCBI數(shù)據(jù)庫應用在線程序ORFfinder(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)讀取開放閱讀框，并且獲取相應的氨基酸序列.利用ProtParam程序(http:∥web.expasy.org/protparam)分別對酶CIP 1和CIP 2進行氨基酸殘基、分子量、理論等電點、脂溶指數(shù)、不穩(wěn)定指數(shù)和氨基酸的親水性和疏水性等進行分析.

1.3 二級結(jié)構(gòu)分析

利用SOPMA在線程序(https:∥npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)進行分析，系統(tǒng)預測其α螺旋、延伸鏈、β折疊和無規(guī)則卷曲等次級結(jié)構(gòu).

1.4 蛋白信號肽預測與分析

通過SignalP 4.1 server(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)利用人工神經(jīng)網(wǎng)絡和HMM(Hidden Markov Models)的原理對氨基酸序列的信號肽存在情況和信號肽切割位點進行預測分析.

1.5 蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預測

使用TMHMM(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0)進行酶CIP 1和CIP 2二級跨膜域分析.

1.6 蛋白卷曲螺旋預測

利用EMBnet的COILS卷曲螺旋預測GO工具(http:∥www.ch.embnet.org/software/COILS_form.html)分別預測酶CIP 1和CIP 2的卷曲螺旋結(jié)構(gòu).

1.7 亞細胞定位分析

利用TargetP 1.1(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)對酶CIP 1和CIP 2分別進行亞細胞定位分析.

1.8 三級結(jié)構(gòu)預測

利用SWISS-MODEI(http:∥swissmodel.expasy.org/)對酶CIP 1和CIP 2氨基酸序列進行三級結(jié)構(gòu)預測.

1.9 內(nèi)含子和外顯子檢測

利用NCBI提供的Graphics工具，在NCBI搜索AY281370.1和AY281368.1之后，用NCBI提供的Graphics工具來查看，得到相應基因的內(nèi)含子和外顯子的序列，此序列同時也是一個基因結(jié)構(gòu)圖.

1.10 磷酸化位點預測

利用KinasePhos(http:∥kinasephos.mbc.nctu.edu.tw/)進行蛋白磷酸化位點預測分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 基因序列與氨基酸序列

用相應的登錄號在GneBank查找得到里氏木霉生物降解酶CIP 1和CIP 2的基因序列和編碼的氨基酸序列，其中CIP 1基因序列長度為951 bp，CIP 2長度為1 383 bp，CIP 1編碼氨基酸數(shù)為316，CIP 2為460.

2.2 氨基酸分析

利用ProtParam程序[7]分析酶CIP 1和CIP 2的理化特性，得到相應的氨基酸理化特性分析數(shù)據(jù)(表1)、氨基酸組成(表2).結(jié)果表明，編碼CIP 1和CIP 2的氨基酸一級結(jié)構(gòu)殘基、分子量、脂溶指數(shù)等都存在差異，其中CIP 1與CIP 2的理論等電點分別為4.93和7，CIP 1為酸性蛋白.根據(jù)ProtParam的算法[8]，不穩(wěn)定指數(shù)小于40時，預測的蛋白在試驗中比較穩(wěn)定，反之則較差.CIP 1與CIP 2的不穩(wěn)定指數(shù)分別為26.53和37.67，則CIP 1和CIP 2屬于穩(wěn)定蛋白.CIP 1的平均疏水性預測結(jié)果為負值，CIP 2的平均疏水性預測結(jié)果為正值，則很有可能CIP 1為親水性蛋白，CIP 2為疏水性蛋白.從表2可以看出，酶CIP 1和CIP 2都由20種氨基酸組成，其中Gly，Ser，Thr和Ala組成比例相對較大，且都不含Pyl和Sec.

表1 降解酶CIP 1和CIP 2的一級結(jié)構(gòu)預測分析

表2 里氏木霉生物降解酶CIP 1和CIP 2的氨基酸組成

2.3 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)

利用SOPMA在線程序得到酶CIP 1和CIP 2二級空間結(jié)構(gòu)預測特征(表3).從表3可知，酶CIP 1和CIP 2均含有大量無規(guī)則卷曲，分別是56.01%和44.13%，其次是延伸鏈；CIP 2的α螺旋比例高于CIP 1，分別是22.83%和11.71%，兩者的β折疊比例都相對較少；且酶CIP 1和CIP2 二級結(jié)構(gòu)中的α螺旋和無規(guī)則卷曲分布較集中，而β折疊結(jié)構(gòu)分布相對分散.

表3 里氏木霉生物降解酶CIP 1和CIP 2的二級結(jié)構(gòu)預測分析

2.4 蛋白信號肽預測與分析

通過SignalP 4.1 server對酶CIP 1和CIP 2氨基酸序列利用神經(jīng)網(wǎng)絡模型進行信號肽分析，得到3種C，Y和S值計算結(jié)果(圖1).對于一個典型的信號肽,C值和Y值趨向于+1，S值在剪切位點之前高,而在剪切位點之后變低[9].由圖1可知：CIP 1的第20位氨基酸殘基具有最高的原始剪切位點分值0.456，第3位氨基酸有最高的信號肽分值0.918，第1～19 位氨基酸殘基的信號肽分值為0.896，第20位氨基酸殘基具有最高的綜合剪切位點分值0.629，信號肽與成熟肽鏈間的剪切位點很可能位于第19～20位氨基酸之間；CIP 2的第18位氨基酸殘基具有最高的原始剪切位點分值0.786，第10位氨基酸有最高的信號肽分值0.974，第1～17位氨基酸殘基的信號肽分值為0.951，第18位氨基酸殘基具有最高的綜合剪切位點分值0.862，信號肽與成熟肽鏈間的剪切位點很可能位于第17～18位氨基酸之間.

圖1 降解酶CIP 1和CIP 2信號肽截圖Fig. 1 Signal Peptide of Biodegrading Enzyme CIP 1 and CIP 2

2.5 蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預測

利用TMHMM得到的蛋白CIP 1和CIP 2二級跨膜域分析結(jié)果表明，氨基酸的位置在膜外的可能性評估分值均大于1，位于跨膜區(qū)和內(nèi)部的可能性極小，可忽略不計，說明酶CIP 1和CIP 2無跨膜區(qū)域，且都位于膜外.

2.6 蛋白卷曲螺旋預測

利用EMBnet的COILS卷曲螺旋預測GO工具分別預測蛋白CIP 1和CIP 2的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示蛋白CIP 1和CIP 2幾乎不含有卷曲螺旋結(jié)構(gòu)，表明該蛋白屬于膜蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白和轉(zhuǎn)錄因子的可能性很小[10].

2.7 亞細胞定位分析

利用TargetP 1.1對酶CIP 1和CIP 2分別進行亞細胞定位分析(圖2)，結(jié)果表明CIP 1和CIP 2定位在分泌途徑信號肽(SP)的可能性分別為82.6%和97.9%，定位于線粒體等其他部位的可能性較小，且定位結(jié)果可靠性較高，說明酶CIP 1和CIP 2為定位于胞外細胞間隙的分泌蛋白.

圖2 里氏木霉生物降解酶CIP 1和CIP 2亞細胞定位截圖Fig. 2 Sub-Cellular Localization of Biodegrading Enzyme CIP 1 and CIP 2

2.8 三級結(jié)構(gòu)預測

應用Swiss-Model在線軟件，根據(jù)同源建模理論預測里氏木霉生物降解酶CIP 1和CIP 2的三級結(jié)構(gòu)(圖3)，結(jié)果表明CIP 1蛋白和CIP 2蛋白的三級結(jié)構(gòu)主要由無規(guī)卷曲構(gòu)成，延伸鏈的數(shù)目很多，α螺旋和β折疊比例相對較少，與二級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果一致.

圖3 里氏木霉生物降解酶CIP 1和CIP 2的三級結(jié)構(gòu)預測Fig. 3 Tertiary Structure of Biodegrading Enzyme CIP 1 and CIP 2

2.9 內(nèi)含子和外顯子檢測

利用NCBI提供的Graphics工具在NCBI搜索AY281370.1和AY281368.1，結(jié)果顯示CIP 1的FCBD是849～948這一段基因序列，CIP 2的CBM-1是64～147這一段基因序列，即CIP 1基因序列中的1～848，948～951屬于內(nèi)含子，849～948屬于外顯子，CIP 2基因序列中的1～63，148～1 383屬于內(nèi)含子，64～147屬于外顯子.

2.10 磷酸化位點預測

根據(jù)磷酸化位點分析結(jié)果，CIP 1共有14個磷酸位點，分別為9個Ser、3個Thr、2個Tyr；CIP 2共有10個磷酸位點，分別為7個Ser、3個Thr、0個Tyr.

3 討論

基因功能最終通過其表達產(chǎn)物——蛋白質(zhì)來實現(xiàn)，因此，要了解相關(guān)基因功能,最終也必須回到蛋白質(zhì)上.CIP 1和CIP 2都存在一段信號肽，信號肽剪切位點分別在19～20，17～18位的氨基酸之間.蛋白質(zhì)分子中的信號肽是引導新合成肽鏈轉(zhuǎn)移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的一段多肽，位于新合成肽鏈的N端，由于信號肽又是引導肽鏈進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔的一段序列,又稱為開始轉(zhuǎn)移序列(start transfer sequence).在信號肽位置對其進行修飾，可以提高編碼蛋白在體內(nèi)特定位置的表達效率，為進一步表達該蛋白提供依據(jù).信號肽的功能，不僅決定一個蛋白質(zhì)是否為分泌蛋白，而且和蛋白質(zhì)或其新生肽鏈在細胞內(nèi)的全方位的定位有關(guān).[11]綜合亞細胞定位分析和蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預測結(jié)果，CIP 1和CIP 2都定位在分泌途徑信號肽(SP)，可能性分別為82.6%和97.9%，而定位于線粒體等其他部位的可能性很小.定位結(jié)果可靠性較高，且CIP 1和CIP 2都無跨膜結(jié)構(gòu)域，在膜外，CIP 1和CIP 2都屬于分泌蛋白.

酶CIP 1和CIP 2幾乎不含有卷曲螺旋結(jié)構(gòu)(coiled-coil,CC).構(gòu)成CC的鏈都是α-螺旋，CIP 1與CIP 2的α-螺旋比例分別是22.83%和11.71%，含量不高.自然界中，CC是一個介導蛋白質(zhì)相互作用或形成蛋白質(zhì)骨架的通用結(jié)構(gòu)域，CC常見于蛋白質(zhì)的折疊結(jié)構(gòu)中.多種跨膜蛋白的跨膜部分含有CC結(jié)構(gòu)，在基因組數(shù)據(jù)庫中，有20%～30%的產(chǎn)物被預測為跨膜蛋白[12].蛋白卷曲螺旋預測結(jié)果表明CIP 1與CIP 2屬于膜蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白和轉(zhuǎn)錄因子的可能性很小，與跨膜結(jié)構(gòu)預測結(jié)果能相互印證.

根據(jù)磷酸化位點分析結(jié)果，CIP 1含有9個Ser、3個Thr、2個Tyr，CIP 2含有7個Ser、3個Thr、0個Tyr，這些可能是酶的磷酸化位點.蛋白質(zhì)磷酸化是蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄后修飾的一個重要可逆機制，它影響許多重要的細胞過程.一條蛋白質(zhì)鏈的磷酸化一般只發(fā)生在絲氨酸(serine,S)、蘇氨酸(threonine,T)、酪氨酸(tyrosine,Y)這3個殘基上，在生命現(xiàn)象的許多關(guān)鍵調(diào)節(jié)機制中，蛋白質(zhì)的磷酸化是重要的翻譯后修飾，它與信號傳導、細胞周期、生長發(fā)育以及癌癥機理等諸多生物學問題有密切關(guān)系.[13]

4 結(jié)論

里氏木霉生物降解酶CIP 1和CIP 2均屬于穩(wěn)定蛋白，CIP 1是親水性蛋白，CIP 2是疏水性蛋白；含有大量無規(guī)則卷曲，幾乎不含有螺旋卷曲結(jié)構(gòu)，都有一段信號肽.無跨膜結(jié)構(gòu)域，并定位在分泌途徑信號肽(SP)上，含有少量的磷酸化位點.為保證預測準確性，本研究對里氏木霉生物降解蛋白CIP 1和CIP 2的各種結(jié)構(gòu)性質(zhì)進行分析預測，均選用了多種不同軟件,其所使用的原理和算法各有不同，但結(jié)果基本一致，能相互印證.因此，本研究結(jié)果具有較強的可信度.但由于生物信息學是根據(jù)已知的信息預測結(jié)果，所以還有很大的局限性，進一步確定蛋白質(zhì)的功能和性質(zhì)還需要實驗的驗證.