吳劍平，張 婧，周悅榕，嚴 鳳，潘 娟

（上海市獸藥飼料檢測所，上海201103）

隨著現(xiàn)代畜牧業(yè)養(yǎng)殖技術(shù)的不斷進步發(fā)展，飼料的質(zhì)量安全越來越受廣大養(yǎng)殖戶的重視。2018年歐洲發(fā)生的雞蛋中發(fā)現(xiàn)氟蟲腈農(nóng)藥殘留事件再次將飼料中的農(nóng)藥殘留問題推到了風(fēng)口浪尖。我國目前已發(fā)布的針對農(nóng)藥殘留進行監(jiān)管的主要法規(guī)公告，其中于2013年3月正式實施的《中國食品安全國家標準：食品中農(nóng)藥最大殘留限量》（GB 2763-2016），規(guī)定了322種農(nóng)藥在10大類食品中的2293項農(nóng)藥最大殘留限量，成為我國農(nóng)藥殘留食品安全市場監(jiān)管的唯一強制性國家標準。雖然其對于谷物、油料作物、蔬菜、水果等食品中的農(nóng)藥殘留監(jiān)管十分有力，而對作為畜牧業(yè)重要投入品的飼料中的農(nóng)藥殘留并沒有明確規(guī)定，既沒有提出受監(jiān)管的種類，也沒有提出相應(yīng)的限量標準。目前國內(nèi)對水果、蔬菜和谷物中多種農(nóng)藥殘留檢測方法研究較多［1-3］，而關(guān)于飼料中多種農(nóng)藥殘留的檢測方法卻相對較少［4-5］。當(dāng)今檢測食品中多種農(nóng)藥殘留的方法手段日趨多樣化，主要有高效液相色譜法（HPLC），氣相色譜法（GC）和色譜質(zhì)譜聯(lián)用法、生物傳感器法和酶聯(lián)免疫法這五大類。氣相色譜結(jié)合FPD或ECD檢測器同時檢測多種農(nóng)藥殘留具有靈敏度高和特異性好的特點［6-7］，但是，對于一些熱不穩(wěn)定和高沸點化合物就難以檢測。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法可以較好的彌補這一缺點，同時也具有高靈敏度和高特異性的優(yōu)點［8-9］，有報道采用液相色譜-串聯(lián)四級桿質(zhì)譜法檢測蔬菜水果中65種農(nóng)藥殘留［10］，其檢測靈敏度可達到 20 μg／kg。 靜電軌道阱質(zhì)譜（Orbitrap Mass）作為高分辨率質(zhì)譜，相比串聯(lián)四級桿質(zhì)譜具有更高的質(zhì)量精確度，同時也具有較高的靈敏度和較寬的線性范圍，在多殘留分析中可以兼顧較多質(zhì)量數(shù)接近的化合物的定性準確性和濃度差別較大的化合物的定量精密性［11-13］。

1 材料與方法

1.1 儀器 Ultimate 3000雙三元超高效液相色譜、Excalibur控制軟件、Trace Founder數(shù)據(jù)處理軟件，Mass Frontier化合物結(jié)構(gòu)推斷軟件，四極桿串聯(lián)靜電軌道阱質(zhì)譜帶HESI電離噴霧源（Q Exactive）、高速冷凍離心機（Allegra X-22R，BECKMAN COULTER）；AL204電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；水浴控溫氮吹儀（N-EVAP，上海安譜公司）。

1.2 材料、藥品與試劑 2，3，5-混殺威（2，3，5-Trimethacarb），3，4，5-混殺威 （3，4，5-Trimethacarb），涕滅威（Aldicarb），涕滅威亞砜（Aldicarbsulfoxide），滅害威（Aminocarb），惡蟲威（Bendiocarb），丁酮威（Butocarboxim），丁酮威亞砜（Butocarboxim sulfoxide），丁酮砜威（Butoxycarboxim），甲萘威（Carbaryl），克百威（Carbofuran），3-羥基克百威（Carbofuran-3-hydroxy），乙硫苯威（Ethiofencarb），仲丁威（Fenobucarb），呋霜靈（Furathiocarb），異丙威（Isoprocarb），滅梭威（Methiocarb），滅多威（Methomyl），速滅威（Metolcarb，MTMC），滅殺威（Xylylcarb，MPMC），殺線威（Oxamyl），抗蚜威（Pirimicarb），猛殺威（Promecarb），殘殺威（Propoxur），特草靈（Terbucarb），硫雙威（Thiodicarb），久效威（Thiofanox），滅除威（XMC），乙霉威（Diethofencarb），苯硫威（Fenothiocarb），涕滅威砜（Aldicarb Sulfone）， 2，4，5-三氯苯氧乙酸（2，4，5-Trichlorophenoxy-Acetic acid， 2，4，5-T），2，4-二氯苯氧乙酸（（2，4-Dichlorophenoxy-Acetic acid， 2，4-D），2-萘氧乙酸（2-Naphthyloxyacetic Acid），4-氯苯氧基乙酸（4-Chlorophenoxyacetic acid），三氟羧草醚（Acifluorfen），苯草醚（Aclonifen），溴苯腈（Bromoxynil），調(diào)果酸（Cloprop），二氯吡啶酸（Clopyralid），環(huán)丙酸酰胺（Cyclanilide），2，4-滴丙酸（2，4-Dichlorprop racemate），氯氟吡氧乙酸（Fluroxypyr），氟磺胺草醚（Fomesafen），赤霉酸（Gibberellic acid），碘苯腈（Ioxynil），2-甲基-4-氯苯氧乙酸（2-Methyl-4-Chlorophenoxy Acetic Acid，MCPA），2-甲基-4-氯苯氧丁酸（2-Methyl-4-Chlorophenoxy-g-Butyric Acid，MCPB），2-甲基-4-氯苯氧丙酸（Mecoprop），魚藤酮（Rotenone），綠草定（Triclopyr）（50 μg／mL，Bepure?，北京振翔科技有限公司）；乙腈、甲酸（色譜純，Merk，德國）；去離子水（自制，電阻率≥18 MΩ·cm）；高純氮、高純氬（純度均為99.999%，上海佳杰特種氣體公司）。

1.3 色譜條件 色譜柱：Syncronis C18 150 mm×2.1 mm 3 μm，柱溫：30 ℃，流速：0.3 mL／min，進樣量：10 μL，流動相：A 為 0.1%甲酸，B 為 0.1%甲酸乙腈，采用梯度洗脫程序如表1，所得典型特征離子質(zhì)量色譜（XIC）圖如圖1所示。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Procedure of gradient elution

圖1 樣品添加定量限濃度典型XIC圖Fig 1 Typical XIC of sample with LOQ concentration

1.4 質(zhì)譜條件 使用Thermo Fisher公司的Q Exactive四極桿靜電軌道阱質(zhì)譜帶HESI電離噴霧源質(zhì)譜檢測器對1 μg／mL的51種農(nóng)藥標準溶液進行建庫優(yōu)化，兼顧各目標化合物優(yōu)化后的質(zhì)譜條件為：選擇正負離子切換模式，正電壓3200 V，負電壓2600 V，鞘氣（Sheath gas）壓力344 kPa，輔助氣（Aux gas）流速 5 L／min，吹掃氣（Sweep gas）流速 0.3 L／min，碰撞氣壓力 0.2 Pa，毛細管（Capillary tube） 溫度325℃，輔助氣加熱（Aux gas heater temperature）溫度350℃，離子透鏡射頻電壓（S-lens RF voltage）50.0 V；掃描模式為全掃描加目標物二級離子碎片掃描模式，一級母離子掃描范圍為100～800 M／Z，母離子掃描分辨率為70000，靜電軌道阱離子捕獲器門限值（AGC Target）為3×106，最大注入捕獲器時間（Maximum inject time）為 100 ms，二級碎片離子掃描分辨率為17500，二級碎片離子捕獲器門限值（dd-MS2 AGC Target）為 1×105，最大注入捕獲器時間（dd-MS2 Maximum inject time）為 50 ms，同時最大響應(yīng)離子（Top N）選取5個，動態(tài)排除時間（Dynamic exclusion time）5 s，數(shù)據(jù)處理軟件提取離子質(zhì)量精度5 ppm，精確至小數(shù)點后5位（表2）。

1.5 前處理條件 準確稱取谷物飼料樣品4.00 g，加入 5.00 mL 0.1 mol／L 鹽酸溶液振蕩濕潤2 min，再加入15 mL甲醇，振蕩2 min后室溫下超聲15 min，然后8000 r／min轉(zhuǎn)速下離心5 min，取上層清液0.5 mL，加入 0.1% 甲酸 0.5 mL 混勻后 14000 r／min離心3 min，上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后上機測定。

表2 51種農(nóng)殘化合物母離子和子離子Tab 2 Parent ion and Daughter ion of 51 Pesticides

續(xù)表

2 結(jié)果與分析

2.1 線性定量范圍的確定 將51種農(nóng)藥殘留先用甲醇配制成50 μg／mL的混合標準貯備液，再將空白谷物飼料按1.5項樣品前處理方法獲得空白樣品基質(zhì)溶液，用此溶液將標準貯備液分別稀釋成1、2、5、10、20、50、100、500 ng／mL 標準曲線工作溶液，按1.3項與1.4項的儀器方法上機檢測，將檢測結(jié)果進行線性回歸，獲得各目標化合物的標準曲線，結(jié)果見表3。實驗結(jié)果表明，在1～500 ng／mL區(qū)間內(nèi) 37 種化合物的 R2＞0.99（R＞0.995），14 種化合物的 R2＞0.98（R＞0.99），線性良好。

2.2 檢測限與定量限的確定 選擇20個空白樣品，按優(yōu)化條件進行處理后上機測定，取與標準品圖譜中相同保留時間的噪音信號平均值，以信噪比S／N≥3 為檢出限（LOD），S／N≥10 為定量下限（LOQ），確定該方法對的檢出限與定量限，國外有相關(guān)規(guī)定對不在其肯定列表目錄中的農(nóng)殘化合物一律要求不得高于 10 μg／kg 的限量［14］，因此，本方法在結(jié)合信噪比和實際檢測需要的情況下選擇10 μg／kg作為方法檢測限，20 μg／kg 作為方法定量限，其檢測限處各化合物信噪比見表2，實際樣品檢測限處XIC圖譜見圖1。實驗結(jié)果表明，檢測限附近峰型良好，定性準確。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)的考察 為驗證方法基質(zhì)效應(yīng)，選取不同種類空白谷物飼料6批，按1.5項前處理方法進行操作，將其空白溶液中分別加入1倍定量限的51種農(nóng)藥殘留，其回收率結(jié)果在50%～120%之間，RSD＜10%，證明該前處理方法處理后的樣品溶液還是有一定的基質(zhì)效應(yīng)影響，但是，考慮到農(nóng)藥殘留物質(zhì)種類繁多，性質(zhì)差異較大，作為一個多殘留物質(zhì)同時篩查和定量的方法，很難在兼顧到每一種目標物的同時完全消除基質(zhì)效應(yīng)的影響，因此，采用基質(zhì)標準溶液定量，這可以在很大程度上減少基質(zhì)效應(yīng)影響，將其控制在可接受的范圍內(nèi)。

2.4 方法準確度與精密度實驗 為驗證方法精密度與準確度，采用標準添加法使用6批不同谷物飼料，每批稱取等量6份，6份一組分三組，分別加入1倍定量限、2倍定量限、5倍定量限的51種農(nóng)殘化合物，所得結(jié)果如表4所示。實驗結(jié)果表明，該方法檢測谷物飼料中51種農(nóng)殘化合物時回收率結(jié)果在50.61%～109.49%之間，RSD＜10%，證明該方法具有較高的準確度與精密度。

2.5 方法選擇性的驗證 選擇20個空白樣品，按優(yōu)化條件進行處理后上機測定，未發(fā)現(xiàn)有假陽性結(jié)果，表明該方法的選擇性良好。

表3 51種農(nóng)藥殘留標準曲線Tab 3 Standard curve of 51 Pesticides

表4 51種農(nóng)殘化合物準確度和精密度Tab 4 Accuracy and precision of 51 Pesticides in Grain feed

續(xù)表

3 討論與結(jié)論

3.1 前處理方法的研究 嘗試了多種前處理方法，包括固相萃取柱法、分散固相萃取法和直接萃取后稀釋進樣法，發(fā)現(xiàn)無論是固相萃取柱法還是分散固相萃取法都會產(chǎn)生對某些化合物的歧視效應(yīng)，因為多殘留檢測面對的目標化合物的范圍廣泛，性質(zhì)差異也較大，最后還是選擇直接萃取后稀釋法作為本方法前處理方法。嘗試了0.1 mol／L鹽酸溶液 ∶甲醇＝1 ∶3，1 ∶1，3 ∶1以及 0.1 mol／L 鹽酸溶液 ∶乙腈＝1∶3，1∶1，3∶1的提取1倍定量限、2倍定量限、5倍定量限的51種農(nóng)殘化合物的效率，主要考察對象為回收率均值和標準偏差，并將其中回收率結(jié)果在均值的±40%以外的數(shù)據(jù)定義為乖離數(shù)據(jù)，統(tǒng)計其個數(shù)，實驗結(jié)果見表5。通過這三項指標，發(fā)現(xiàn)使用0.1 mol／L鹽酸溶液 ∶甲醇＝1 ∶3和1∶1以及0.1 mol／L鹽酸溶液 ∶乙腈＝1∶3的回收率均值均達到了70%以上，結(jié)合對各化合物回收率的相對標準偏差比較可知，使用0.1 mol／L鹽酸溶液與甲醇組成的提取劑均具有更小的相對標準偏差，而統(tǒng)計乖離數(shù)據(jù)個數(shù)也佐證了0.1 mol／L鹽酸溶液 ∶甲醇＝1∶3具有更小的歧視效應(yīng)，因此，選擇該條件作為前處理方法。

表5 谷物飼料中51種農(nóng)殘化合物提取效率研究Tab 5 Research on Extraction Efficiency of 30 Carbarmates in grain feed

3.2 定性與定量方法的研究 根據(jù)歐盟相關(guān)規(guī)定［15］，以識別分（identification points，IPs）為基礎(chǔ)進行化合物的定性分析，對于不同法規(guī)要求的殘留物，確證所需的IPs也各不相同，A類（違禁）需滿足4IPs，B類（限用）滿足3IPs，農(nóng)藥殘留適用違禁物質(zhì)A類，因此，需要4IPs來進行確證；不同的技術(shù)所獲得的IPs也不同，靜電軌道阱質(zhì)譜作為高分辨質(zhì)譜獲得的一個母離子有2.0IPs，相對應(yīng)的一個子離子有2.5IPs，因此，選出一對合適的母離子與子離子就可以確證一個農(nóng)殘化合物。按照此原則和1.3～1.4項的儀器方法，對目標農(nóng)藥殘留藥物進行了標品的進樣并建庫分析，獲得最合適的目標物母離子精確質(zhì)量數(shù)、保留時間以及其二級碎片離子的全掃描圖譜，結(jié)合Mass Frontier所推斷的子離子找出豐度最高的子離子和母離子一起作為確證所需的定性離子。51種農(nóng)藥殘留的保留時間、母離子精確質(zhì)量數(shù)和子離子精確質(zhì)量數(shù)相結(jié)合可作為定性依據(jù)，具體信息見表2。定量時用一級母離子的精確質(zhì)量數(shù)對總離子流圖進行提取色譜圖，對目標物的色譜峰進行積分，通過曲線校準或單點校準進行定量分析。

3.3 區(qū)分同分異構(gòu)體的研究 方法中涉及的目標化合物包含多對同分異構(gòu)體，比如丁酮威亞砜和涕滅威亞砜，丁酮威砜和涕滅威砜，丁酮威和涕滅威，滅除威和滅殺威等，它們具有相同的分子組成，因此，即使靜電軌道阱質(zhì)譜擁有高達140000分辨率的質(zhì)量精度也無法區(qū)分這些化合物，但是，多殘留篩查過程中不可排除這些化合物同時存在的可能，因此，經(jīng)過實驗驗證可采用三種不同方法解決這一問題。其一，通過質(zhì)譜前端的液相部分對元素組成相同但分子結(jié)構(gòu)差異較大的化合物采用優(yōu)化梯度洗脫條件，增加色譜分離度的辦法，使同分異構(gòu)體目標化合物的保留時間有較大差異，從而實現(xiàn)分離定性，例如本方法中丁酮威亞砜和涕滅威亞砜等；其二，通過質(zhì)譜源區(qū)對同分異構(gòu)體目標化合物母離子帶電離行為的差異，分別檢測其不同的加合物形式進行區(qū)分，例如丁酮威和涕滅威，丁酮威砜和涕滅威砜這兩對化合物經(jīng)過單標進樣后發(fā)現(xiàn)涕滅威和丁酮威砜在ESI+離子源作用下難以獲得+H的母離子，而主要以+Na離子形式存在，而丁酮威和涕滅威砜母離子則主要以+H形式存在，因此，在保留時間接近難以區(qū)分時，檢測不同形式的母離子加合物也可以起到區(qū)分同分異構(gòu)體的目的；其三，有些同分異構(gòu)體化合物保留時間非常接近，母離子加合物形式也相同，那只能通過單標進樣后分析其所產(chǎn)生的特征碎片離子的差異進行區(qū)分，滅除威和滅殺威就是一例。

本研究建立了超高效液相色譜-靜電軌道阱質(zhì)譜法檢測谷物飼料中的51種農(nóng)藥殘留物的檢測方法和目標化合物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫。谷物飼料樣品經(jīng)0.1 mol／mL HCl∶甲醇＝1 ∶3 提取，高速離心，經(jīng)稀釋后進樣分析。實驗結(jié)果表明，51種，農(nóng)殘化合物分離良好，在定量范圍內(nèi)均線性良好（線性相關(guān)系數(shù)r≥0.99），回收率也可達到 50.61% ～109.49% ，相對標準偏差（RSD）小于9.3%。本方法具有簡便、快速、靈敏、準確等特點，適用于谷物飼料中同時篩查和定量農(nóng)殘化合物。