陳曉春，韓 爽，吳華偉，鄧 永，曹明慧，李俊平?

（1.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081；2.青島信得藥業(yè)有限公司，山東青島266100）

偽狂犬病毒（Psedorabies virus，PRV）屬于皰疹病毒科（Herpesviridae）α皰疹病毒亞科（Alphaherpesvirinae）水痘病毒屬（Varicellovirus）的豬皰疹病毒I（Suid herpesvirus I），為線狀雙股DNA病毒，基因組全長約150 kb，含有至少77個開放閱讀框編碼。病毒基因組有大量的復(fù)制非必需基因，如TK、gG、gE、gI等［1-3］。 這些基因編碼的蛋白大多與毒力有關(guān)，由單個或多個毒力基因缺失的偽狂犬病毒毒株制備的疫苗在應(yīng)用上相對成熟［4］。如商品化偽狂犬病毒活疫苗（SA215株）為gE、gI、TK三基因缺失疫苗，豬偽狂犬病活疫苗（HB-98株）為TK和gG雙基因缺失疫苗，豬偽狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）為gE、gI自然缺失疫苗。長期實踐證實，偽狂犬病毒基因缺失疫苗安全性良好，且在偽狂犬病的防控中起到重要的作用。但隨著我國養(yǎng)殖環(huán)境的改變和免疫壓力的增加，豬病流行呈現(xiàn)老病新發(fā)，新病不斷，混合感染突出等趨勢，導(dǎo)致一些病原變異加劇，毒力不斷增加。2011年以來，許多使用基因缺失活疫苗免疫的規(guī)?；i場出現(xiàn)了疑似PR流行，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失，可見現(xiàn)有疫苗已不能對變異的PRV株產(chǎn)生100%的保護力［5-7］。

以一株偽狂犬流行毒株為親本株，人工構(gòu)建了一株 5 基因缺失毒株（PRV-gE-／gI-／US9-／△UL49.5／TK-），經(jīng)試驗證實，該毒株在小鼠、家兔、山羊、仔豬和懷孕母豬上的安全性優(yōu)于Bartha-K61株。本研究將其與親本毒株在敏感細胞上共同培養(yǎng)，分析培養(yǎng)物中毒株的類型、所占比例及對家兔的安全性，以了解該毒株在體外從親本毒株中獲得缺失基因的能力及安全性，為偽狂犬缺失疫苗的研制和轉(zhuǎn)基因生物安全評價提供研究數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 病毒 偽狂犬病毒5基因缺失株P(guān)RV-gE-／gI-／US9-／△UL49.5／TK-株、PRV 野毒株 SX 株，均由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所構(gòu)建／分離、鑒定和保存。病毒含量分別為 107.5TCID50／mL、107.25TCID50／mL。

1.1.2 細胞 PK15細胞由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所保存。

1.1.3 主要試劑 DMEM 營養(yǎng)液，Gibco公司產(chǎn)品；胎牛血清，PΛA公司產(chǎn)品；低熔點瓊脂糖，Sigma公司產(chǎn)品；DNA／RNA抽提試劑盒，TIANGEN公司產(chǎn)品；KOD FX Neo DNA聚合酶購自TOYOBO公司；膠回收試劑盒購自Promega公司。

1.1.4 鑒定引物 自行設(shè)計了 TK、UL49.5、gE、gI、US9基因鑒定引物，引物序列及擴增信息見表1。

1.1.5 主要儀器設(shè)備 二氧化碳培養(yǎng)箱（三洋 ）、恒溫培養(yǎng)箱（三洋）、PCR儀（Biometra）、電泳儀、紫外成像儀等。

1.2 方法

1.2.1 病毒傳代 將 PRV-gE-／gI-／US9-／△UL49.5／TK-株病毒液和PRV野毒株SX株病毒液用DMEM營養(yǎng)液分別稀釋成病毒含量為 106.0TCID50／mL，分別取1 mL混合，接種已長成良好PK15細胞單層的25 cm2細胞瓶，培養(yǎng)至80%細胞出現(xiàn)細胞病變時，凍融3次，離心去除細胞碎片，取上清，記為F1，分裝成1 mL／管，凍存或進行下一代接種，每代取1 mL接種1瓶25 cm2的PK15細胞單層進行傳代。如此連續(xù)傳代10代，收獲病毒液，記為F10，分裝成1 mL／管，凍存。

表1 引物序列及擴增信息Tab 1 The information of primers and amplification

1.2.2 病毒含量測定 將收獲的F10病毒液用DMEM細胞培養(yǎng)液作10倍系列稀釋，取 10-2、10-3、10-4、10-5、10-65 個稀釋度，分別接種已長成良好PK15細胞單層、棄去細胞培養(yǎng)液的96孔培養(yǎng)板，每個稀釋度接種8孔，每孔0.1 mL，同時設(shè)正常細胞對照8孔。置37℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d。記錄細胞病變情況，按Reed-Muench法計算TCID50。

1.2.3 病毒蝕斑挑選及培養(yǎng) 將收獲的F10代病毒液按10～20 TCID50劑量接種已長成良好PK15細胞單層的6孔細胞培養(yǎng)板，吸附1 h后，棄去吸附液，鋪上1%的低熔點瓊脂糖，繼續(xù)培養(yǎng)48～72 h，共挑取50個病毒蝕斑，各浸于1 mL DMEM營養(yǎng)液中，凍融1次后，分別接種已長成良好單層的PK15細胞6孔板，每個蝕斑接種1孔，培養(yǎng)至病變達50%以上，收獲病毒液，凍融 1次后，進行 TK、UL49.5、gE、gI、US9 基因鑒定。

1.2.4 重組情況分析

1.2.4.1 重組病毒PCR鑒定 將挑選的50個病毒蝕斑采用表1中的引物分別進行PCR鑒定，初步確定基因缺失類型，并計算病毒重組的百分率，即除流行株和5基因缺失株外能擴增出TK、UL49.5、gE／gI／US9中任一基因或多個基因的克隆斑數(shù)／50。

1.2.4.2 重組病毒基因序列測定 將擴增條帶大小一致的蝕斑各選取3個樣品進行序列測定，分析基因序列變異情況。

1.2.5 重組病毒安全性試驗 取12只 2.5 kg左右的健康易感家兔，隨機分成6組，每組2只。第1、2、3、4、5組分別皮下接種新出現(xiàn)的重組毒株，每只接種1 mL（含103.0TCID50）；第6 組不接種作為對照。隔離飼養(yǎng)觀察14 d，觀察有無偽狂犬病臨床癥狀。

2 結(jié) 果

2.1 病毒蝕斑挑選 PRV-gE-／gI-／US9-／△UL49.5／TK-株病毒液和PRV野毒株SX株病毒液混合后傳代，收獲F10代病毒液進行蝕斑挑選，隨機挑選出50個蝕斑（部分蝕斑圖片見圖1）。

2.2 蝕斑PCR鑒定結(jié)果 將隨機挑選的50個蝕斑采用 6d-F／9b-R、TK-F／TK-R、PUL50-F2／PUL50-R2三對引物進行PCR鑒定。結(jié)果（圖2-圖 4，表 2）發(fā)現(xiàn)，同時擴增出 gI／gE／US9、TK、gN 三段基因的有13個蝕斑（即野毒株），同時擴增出其中兩段基因的有26個蝕斑，擴增出其中一段基因的有10個蝕斑，僅1個蝕斑未擴增出全部的三段基因（即5基因缺失株），共存在7種不同類型的毒株。即除 PRV 野毒株和 PRV-gE-／gI-／US9-／△UL49.5／TK-株外，出現(xiàn)了5種新的基因組合類型，分別為PRV（ gE-／gI-／US9-／TK-）、 PRV （ gE-／gI-／US9-／gN-）、PRV（gE-／gI-／US9-）、PRV（TK-）、PRV（gN-），蝕斑個數(shù)分別為13個、1個、5個、5個、15個、6個、5個。病毒重組百分率＝（擴增出1段基因的蝕斑數(shù)+擴增出兩段基因的蝕斑數(shù)）×100%÷50＝（10+26）×100%÷50＝72%。 重組毒株中以gI／gE／US9三基因缺失型為主，占重組蝕斑數(shù)的41.7%，占挑選蝕斑數(shù)的30%，高于流行株的比例，成為主要的優(yōu)勢重組毒株。

圖1 部分蝕斑圖片（×200）Fig 1 The pictures of part plaques（×200）

圖2 gE／gI／US9三基因鑒定結(jié)果Fig 2 Identification of gE／gI／US9 gene

圖3 TK基因鑒定結(jié)果Fig 3 Identification of TK gene

圖4 gN基因鑒定結(jié)果Fig 4 Identification of gN gene

表2 50個蝕斑毒株類型、個數(shù)及所占比例Tab 2 Type，number and proportion of the 50 plaques

除流行株和5基因缺失株外，其他5種新類型按照單個基因擴增情況分析，擴增出gI／gE／US9段基因的蝕斑數(shù)為11個；擴增出TK基因的蝕斑數(shù)為25個，其中僅擴增出TK一段基因的有5個蝕斑，擴增出TK+gN或gI／gE／US9+TK兩段基因的有20個蝕斑；擴增出gN基因的蝕斑為26個，其中僅擴增出gN一段基因的有5個蝕斑，擴增出TK+gN或gI／gE／US9+gN兩段基因的有21個蝕斑。

2.3 擴增片段測序結(jié)果 對條帶大小一致的樣品隨機選取3個進行序列測定，結(jié)果顯示均未出現(xiàn)基因突變，說明出現(xiàn)任意兩個或單個基因的重組時，是整段插入或缺失，不存在基因的突變現(xiàn)象。

2.4 重組病毒安全性試驗 將新出現(xiàn)的5種毒株，即 PRV（gE-／gI-／US9-／TK-）、PRV（gE-／gI-／US9-／gN-）、 PRV （gE-／gI-／US9-）、 PRV （TK-）、PRV（gN-），經(jīng) PK15細胞增殖，測定病毒含量，分別稀釋成103.0TCID50／mL皮下接種健康易感家兔，觀察14 d，未見異常臨床反應(yīng)。

3 討 論

對于偽狂犬病毒活疫苗的研制，人工致弱是篩選候選毒株的最有效的方法。目前我國市場上使用的多種人工致弱（毒力基因缺失）的偽狂犬病毒活疫苗都具有良好的安全性。但人工致弱株的毒力返強或基因重組一直備受關(guān)注。本研究通過同源重組的方式構(gòu)建了偽狂犬病毒5基因缺失的人工致弱毒株，在此基礎(chǔ)上，通過體外細胞培養(yǎng)，了解5基因缺失株與野毒株的基因重組情況，為下一步疫苗開發(fā)提供數(shù)據(jù)。

研究結(jié)果顯示，5基因缺失株與野毒株混合培養(yǎng)，在體外連續(xù)傳代10代，共獲得包括野毒株和5基因缺失株在內(nèi)的7種不同基因組合的毒株，符合偽狂犬病毒同源重組的規(guī)律。從缺失株P(guān)RV-gE-／gI-／US9-／△UL49.5／TK-株病毒與野毒株混合培養(yǎng)，獲得缺失基因的能力角度分析，除13個流行株蝕斑和 1 個五基因缺失 PRV（gE-／gI-／US9-／TK-／gN-）的蝕斑外，出現(xiàn)其余5種新類型的36個蝕斑的可能性有兩種：一是流行株在傳代培養(yǎng)過程中缺失了 gI／gE／US9、TK、gN 中一段或兩段基因；二是五基因缺失株在傳代培養(yǎng)的過程中分別獲得了gI／gE／US9、TK、gN 中一段或兩段基因。 但從分子生物學角度分析，單個基因缺失或同源重組的幾率應(yīng)高于多個基因。在36個新類型的蝕斑中，有26個擴增出 gI／gE／US9、TK、gN 中的兩段基因，提示我們這26個蝕斑可能來自流行毒株的缺失，其中g(shù)I／gE／US9 段基因的缺失比例最高（15／36）。 有 10個擴增出TK、gN單個基因，提示我們這10個蝕斑可能來自5基因缺失株的同源重組。而且，未發(fā)現(xiàn)有僅擴增出gI／gE／US9段基因的蝕斑，可能因其長度較長（3550bp），同源重組的幾率較小，這也符合同源重組的分子生物學規(guī)律。

整體來看，流行毒株和 PRV（gE-／gI-／US9-）在10代培養(yǎng)物中所占比例較大，分別占26%（13／50）和30%（15／50），這說明流行株相對于5基因缺失株（僅1個蝕斑），仍屬于體外培養(yǎng)的優(yōu)勢毒株，雖然不能排除基因缺失株重新獲得5個基因的可能，但理論上有很大難度。而且其所占比列較培養(yǎng)前有所下降，也在一定程度上說明，缺失株同時獲得所有缺失基因的幾率很小。而 PRV（gE-／gI-／US9-）毒株所占比例較高，可能有兩個方面的原因：一是在10代的培養(yǎng)中不斷同源重組形成的，二是在最初幾代的同源重組中獲得細胞培養(yǎng)優(yōu)勢毒株，經(jīng)多代不斷培養(yǎng)增殖形成。值得注意的是，PRV（gE-／gI-／US9-）與商品化疫苗 Bartha 株基因缺失情況基本一致，Bartha株屬于自然缺失株，進一步說明 PRV（gE-／gI-／US9-）類型毒株可能具有一定的遺傳優(yōu)勢。 此外 PRV（gE-／gI-／US9-／TK-）型與商品化 SA215 株（PRV-gE-／gI-／TK-／LacZ+）基因缺失疫苗的基因缺失情況相似。實踐證明，Bartha株、SA215株等活疫苗長期使用過程中未出現(xiàn)過安全問題?？梢酝茢?，本研究出現(xiàn)的PRV（gE-／gI-／US9-）、PRV（gE-／gI-／US9-／TK-）兩個類型的毒株是安全的，不存在引起烈性感染的危險。其他三種基因類型 PRV（gE-／gI-／US9-／gN-）、PRV（TK-）和PRV（gN-）蝕斑個數(shù)分別為5個、6個、5個，所占比例不高。家兔安全性試驗證實，新出現(xiàn)的5種基因類型的毒株以103.0TCID50劑量進行接種時，未見異常臨床反應(yīng)，是安全的。

實踐證明，偽狂犬病毒弱毒疫苗無論是自然缺失株還是人工缺失致弱株，均具有良好的安全性［4］。本研究通過體外培養(yǎng)研究5基因缺失株與野毒株混合感染時重組情況，結(jié)果顯示病毒重組后基因構(gòu)成整體上趨向于目前常見的自然缺失株，符合病毒重組特性，新重組的偽狂犬病毒株安全性良好，為該毒株今后作為疫苗候選毒株提供一些數(shù)據(jù)參考。