梁小輝，孟戰(zhàn)備，鄭紅玲

（洛陽市婦女兒童醫(yī)療保健中心，河南 洛陽 471000）

哮喘是一種以氣流阻塞為特征的復(fù)雜性臨床綜合征，與氣道高反應(yīng)性（airway hyperresponsiveness,AHR）和細(xì)胞炎癥有關(guān)[1-2]。血清標(biāo)志物在哮喘的診斷中具有重要的意義，并可鑒定哮喘表型。WoodruffPG等[3]利用骨膜蛋白作為Th2誘導(dǎo)氣道炎癥的生物標(biāo)志物，對氣道上皮細(xì)胞的基因表達(dá)譜進(jìn)行研究，結(jié)果顯示白細(xì)胞介素-13的響應(yīng)基因POSTN（該基因可以編碼骨膜蛋白）的表達(dá)水平可將哮喘患者分為高Th2表型和低Th2表型，前者對吸入性皮質(zhì)激素（ICS）反應(yīng)良好，但后者不敏感。另有研究顯示白細(xì)胞介素-13單克隆抗體可改善肺功能，尤其是對血清骨膜蛋白水平很高的患者[4]。生物標(biāo)志物分析表明，奧馬珠單抗可顯著降低高骨膜蛋白水平哮喘患者的發(fā)作頻率，其機(jī)制與呼出氣一氧化氮（FENO）分?jǐn)?shù)及血液中嗜酸性粒細(xì)胞水平相關(guān)[5]。因此，血清中骨膜蛋白是Th2誘導(dǎo)氣道炎癥、嗜酸性氣道早期炎癥和Th2靶向治療反應(yīng)的最理想生物標(biāo)志物[6]。氣道對外源性刺激的AHR是哮喘的重要特征[7]，既往研究表明Th2型細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-13可刺激肺成纖維細(xì)胞和氣道上皮細(xì)胞產(chǎn)生骨膜蛋白[3]。盡管具體作用機(jī)制尚無完全闡明，本文推測哮喘患者中，骨膜蛋白涉及哮喘氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性機(jī)制的調(diào)控。本研究探討哮喘兒童骨膜蛋白與AHR的相關(guān)性，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年12月—2016年6月本中心收治的哮喘兒童60例為哮喘組，根據(jù)《全球哮喘倡議》指南[8]，其中輕度間歇性哮喘16例，輕度持續(xù)性哮喘21例，中度哮喘23例。另外選擇健康兒童30例為對照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南》[9]中兒童支氣管哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：在過去6個月中出現(xiàn)哮喘急性發(fā)作且需全身糖皮質(zhì)激素控制者，在研究前4周胸片顯示有明顯的肺部疾病者。本研究經(jīng)倫理委員會批準(zhǔn)通過，研究對象及監(jiān)護(hù)人均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 研究設(shè)計本研究分為4個階段：①準(zhǔn)備階段，試驗(yàn)期間所有患者均要求停止使用控制藥物；②第1次隨訪，采集兩組血液標(biāo)本，并測量呼出一氧化氮水平，進(jìn)行皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)和肺、支氣管的呼吸量測定；③第2次隨訪，對患者進(jìn)行乙酰甲膽堿和吸入甘露醇支氣管激發(fā)試驗(yàn)；④第3次隨訪，內(nèi)容同第2次隨訪。兩次隨訪之間間隔至少1周。血清中骨膜蛋白水平測定之前，血標(biāo)本-80℃保存。

1.2.2 甘露醇支氣管激發(fā)試驗(yàn)記錄兩組吸入甘露醇干粉的一秒用力呼氣容積（forced expiratory volume in one second，F(xiàn)EV1），作為基線值。當(dāng)出現(xiàn)基線狀態(tài)下FEV1變化值≥15%時，被認(rèn)為結(jié)果陽性，即完成了甘露醇支氣管激發(fā)試驗(yàn)，或者當(dāng)出現(xiàn)最大累積劑量甘露醇（635 mg）也被認(rèn)為完成了甘露醇支氣管激發(fā)試驗(yàn)，其余為陰性結(jié)果。針對甘露醇支氣管激發(fā)試驗(yàn)陽性試驗(yàn)結(jié)果，引起FEV1變化值≥15%的累計激發(fā)劑量（PD15劑量水平）是通過最后兩個數(shù)據(jù)點(diǎn)的對數(shù)線性插值計算出來的。甘露醇相應(yīng)的數(shù)值即PD15值。

1.2.3 乙酰甲膽堿激發(fā)試驗(yàn)受試者以日本產(chǎn)Chest Hl-501型肺功能儀測FEV13 次（相差＜5%），取平均值作為基線。取坐位、夾鼻，以Wright霧化器[美國產(chǎn)DEVILBISSAP-50空氣壓縮機(jī)驅(qū)動，霧化量恒定在（0.13±0.02）mL/min，霧化顆粒直徑1.0～ 3.0 μ]，潮氣呼吸法吸入生理鹽水2 min后測FEV13次并與基礎(chǔ)值比較降低均不到10%，然后從低濃度開始順次吸入各濃度的乙酰甲膽堿溶液(濃度為0.03～128 mg/mL,成倍遞增)，每一濃度吸入2分鐘，于吸入后第30 s、90 s各測FEV1，間隔5 min吸下一濃度，直至FEV1下降20%以上或最高濃度為止。以引起FEV1下降20%的乙酰甲膽堿濃度表示氣道反應(yīng)性（即PC20值）的高低。

1.2.4 呼出一氧化氮水平測定采用便攜式一氧化氮分析儀測量呼出一氧化氮，該分析儀可以提供以每十億分之一為度量單位的50 mL/s呼氣流速的測量。根據(jù)美國胸科協(xié)會的指導(dǎo)方針，用該裝置測定的結(jié)果在臨床上可接受，與固定分析儀提供的測量結(jié)果一致。

1.2.5 血清生物標(biāo)志物的測量兩組采集空腹肘靜脈血5 mL，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測量骨膜蛋白水平。

1.3 觀察指標(biāo)

觀察并記錄兩組一般資料、外周血標(biāo)志物水平，包括骨膜蛋白、總免疫球蛋白（Ig）E水平、嗜酸性粒細(xì)胞計數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞陽離子蛋白和呼出一氧化氮；采用受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic，ROC）評價血清骨膜蛋白水平的診斷價值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 21.0軟件分析數(shù)據(jù)，正態(tài)分布的計量資料以“±s”表示，采用t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)（四分位間距）[M（Q1，Q3）]表示，采用秩和檢驗(yàn)；計數(shù)資料以百分?jǐn)?shù)（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Spearman法；應(yīng)用ROC曲線分析血漿骨膜蛋白診斷哮喘的效能。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較

兩組年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、用力肺活量（forced vital capacity，F(xiàn)VC）等資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。60名哮喘兒童中，乙酰甲膽堿支氣管激發(fā)試驗(yàn)（BPT）結(jié)果全部為陽性，甘露醇支氣管激發(fā)試驗(yàn)陽性40例，陰性20例。哮喘組FEV1、FEV1/FVC顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；哮喘組使用支氣管擴(kuò)張劑FEV1變化量大于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

2.2 兩組血清標(biāo)志物比較

哮喘組骨膜蛋白、總IgE水平、嗜酸性粒細(xì)胞計數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞陽離子蛋白水平和呼出一氧化氮值高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

2.3 血清骨膜蛋白水平診斷哮喘的ROC曲線

ROC曲線結(jié)果顯示，當(dāng)血清骨膜蛋白為90 ng/mL作為最佳截斷值，其診斷哮喘的AUC為0.65（95CI：0.50～0.75，P＜0.05），靈敏度為30%，特異度為95%，陽性預(yù)測值為49%，陰性預(yù)測值91%。見圖1。

2.4 檢測指標(biāo)與骨膜蛋白水平的相關(guān)性分析

Spearman秩相關(guān)結(jié)果顯示，血清骨膜蛋白水平與嗜酸性粒細(xì)胞計數(shù)、呼出一氧化氮水平呈正相關(guān)（r=0.332，P=0.017；r=0.383，P=0.002），與總 IgE 水平、嗜酸性粒細(xì)胞陽離子蛋白水平、FVC1、FEV1/FVC等無線性相關(guān)（P＞0.05）。見表3。

2.5 乙酰甲膽堿和甘露醇激發(fā)試驗(yàn)檢測骨膜蛋白與AHR的相關(guān)性

哮喘組血清骨膜蛋白水平與乙酰甲膽堿PC20值和甘露醇PD15值呈負(fù)相關(guān)（r=-0.293，P=0.038；r=-0.463，P=0.003）。調(diào)整了年齡、性別、遺傳性過敏癥、Log骨膜蛋白水平之后，血清骨膜蛋白水平的對數(shù)值與乙酰甲膽堿PC20對數(shù)值（生物標(biāo)志物水平增加2倍，乙酰甲膽堿PC20對數(shù)值下降1.229%）、甘露醇PD15對數(shù)值（生物標(biāo)志物水平增加2倍，甘露醇PD15對數(shù)值下降1.661%）顯著相關(guān)（P＜0.05）。見表4。

圖1 血清骨膜蛋白水平診斷哮喘的ROC曲線

表1 兩組一般資料比較

表2 兩組血清標(biāo)志物比較

表3 檢測指標(biāo)與骨膜蛋白水平的相關(guān)性分析

表4 多元線性回歸分析乙酰甲膽堿和甘露醇激發(fā)試驗(yàn)檢測骨膜蛋白與AHR的相關(guān)性

3 討論

骨膜蛋白是一種分泌蛋白，在結(jié)締組織、骨、心肌、心瓣膜和皮膚中均可表達(dá)[10-11]。研究認(rèn)為骨膜蛋白通過與多種整合素相互作用，可參與細(xì)胞增殖和再生、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、纖維化和血管生成[12-13]。傳統(tǒng)上認(rèn)為哮喘是由于吸入性過敏原引起的Th2炎癥反應(yīng)所致，通常是以氣道嗜酸性粒細(xì)胞浸潤為常見特征[14]。導(dǎo)致氣道炎癥細(xì)胞持續(xù)存在、氣道結(jié)構(gòu)的改變、平滑肌功能的改變、哮喘患者AHR的機(jī)制尚不清晰。可通過采用直接刺激（如乙酰甲膽堿）或間接刺激（包括鍛煉、高滲鹽水及甘露醇）來進(jìn)行支氣管激發(fā)試驗(yàn)，進(jìn)而評估氣道對外源性刺激的AHR。骨膜是哮喘氣道新發(fā)現(xiàn)的一種成分的加厚基底膜，與哮喘纖維化有關(guān)，是氣道重塑的一個特征[15-17]。

本研究結(jié)果顯示，與健康兒童比較，哮喘兒童血清骨膜蛋白水平顯著升高，與文獻(xiàn)[3,18,19]研究結(jié)論一致。本研究中血清中骨膜蛋白水平與外周細(xì)胞嗜酸性粒細(xì)胞計數(shù)、呼出一氧化氮量顯著正相關(guān)，與文獻(xiàn)[20]報道相符。用乙酰甲膽堿導(dǎo)致支氣管收縮和甘露醇所致的特征不同，甘露醇試驗(yàn)通過1個或多個中間機(jī)制觸發(fā)氣道平滑肌收縮，如介質(zhì)，包括白三烯，前列腺素，組胺和炎性細(xì)胞，引起氣道炎癥；而乙酰膽堿直接作用于呼吸道平滑肌受體，不會引起炎癥的觸發(fā)收縮[21]。與乙酰膽堿試驗(yàn)相比，甘露醇試驗(yàn)用來識別當(dāng)前哮喘癥狀時，特異度更高，此外，甘露醇數(shù)據(jù)與氣道炎癥程度和疾病嚴(yán)重程度有較好的相關(guān)性[22-23]。本研究結(jié)果顯示，血清骨膜蛋白水平的對數(shù)值與乙酰甲膽堿PC20對數(shù)值（生物標(biāo)志物水平增加2倍，乙酰甲膽堿PC20對數(shù)值下降1.229%）、甘露醇PD15對數(shù)值（生物標(biāo)志物水平增加2倍，甘露醇PD15對數(shù)值下降1.661%）顯著相關(guān)。該試驗(yàn)結(jié)果測量使用乙酰甲膽堿和甘露醇所致AHR。

總之，哮喘兒童血清中骨膜蛋白水平與甘露醇試驗(yàn)和乙酰甲膽堿試驗(yàn)引發(fā)的AHR相關(guān)，外周血細(xì)胞中骨膜蛋白水平有望作為具有臨床應(yīng)用的生物標(biāo)志物。然而，本研究存在以下局限性：樣本量??；無法討論研究結(jié)果與哮喘控制不佳的關(guān)系；盡管本研究結(jié)果顯示哮喘患者群體和健康群體之間骨膜蛋白水平差異顯著，但骨膜蛋白水平的ROC曲線AUC僅為0.65。骨膜蛋白與其它生物標(biāo)志物聯(lián)合使用可能更有效，因此，有必要進(jìn)行大型隨機(jī)臨床試驗(yàn)證實(shí)。