王世龍**

（南京醫(yī)科大學(xué)附屬老年醫(yī)院，江蘇 南京 210024）

維生素是維持人體正常生長(zhǎng)發(fā)育和調(diào)節(jié)各種生理功能的必需物質(zhì)，由于體內(nèi)不能合成，必須從食物中攝取補(bǔ)充[1-2]。維生素A又稱視黃醇，具有預(yù)防癌癥、保持正常視覺(jué)、預(yù)防夜盲癥、維持黏膜正常功能、增強(qiáng)抵抗力，維持骨骼和牙齒正常發(fā)育、令皮膚光潔滑嫩等功能；維生素E又稱生育酚，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，具有促進(jìn)生育、延緩衰老以及抑制腫瘤等功能，并對(duì)糖尿病并發(fā)癥、動(dòng)脈粥樣硬化起到預(yù)防作用。維生素A和維生素E均為脂溶性維生素，化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，遇到空氣、光照和溫度影響易導(dǎo)致氧化分解[3-4]。

維生素A和維生素E的分析檢測(cè)方法主要有層析法[5]、比色法[6]、色譜法[7-9]和質(zhì)譜法[10-11]。層析法和比色法靈敏度偏低，操作過(guò)程繁瑣；質(zhì)譜法設(shè)備昂貴，測(cè)定過(guò)程需要加入同位素內(nèi)標(biāo)校正，儀器普及率較低，不宜推廣；高效液相色譜法是檢測(cè)維生素A和維生素E的主流方法，但紫外檢測(cè)器響應(yīng)值相對(duì)偏低，而維生素A和維生素E均有較強(qiáng)的熒光吸收，故本實(shí)驗(yàn)開(kāi)發(fā)一種利用高效液相-熒光檢測(cè)器檢測(cè)多維生素保健品中的維生素A和維生素E的方法。結(jié)果表明，此法操作簡(jiǎn)單，靈敏度高，準(zhǔn)確度高。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

高效液相色譜儀：agilent1260 in finity主機(jī)（美國(guó)agilent）；檢測(cè)器：G1321A熒光檢測(cè)器（美國(guó)agilent）；色譜柱：WATERS SUNFIRE-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm) （美國(guó)WATERS）；電子天平：梅特勒XS204電子天平（瑞士梅特勒-托利多）；超聲儀：KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗機(jī)（昆山超聲儀器）；振蕩器：HY-4型（天津泰斯特）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

維生素A對(duì)照品（含量98.0%，批號(hào)100368-201502，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；維生素E對(duì)照品（含量97.7%，批號(hào)100062-201110，中國(guó)食品藥品檢定研究院）。

1.3 試藥

甲醇，乙腈：色譜純；純化水，自制（密理博制水器）；多維生素片（惠氏制藥，批號(hào)20180107）；多維生素片（杭州民生藥業(yè)，批號(hào)20171117）；多維生素膠囊（河北恒利集團(tuán)制藥公司，批號(hào)20180226）。

1.4 色譜條件

Waters SunFire C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫30 ℃，進(jìn)樣量25 μl，流速1.0 ml/min；流動(dòng)相A：甲醇；流動(dòng)相B：純化水；維生素A測(cè)定波長(zhǎng)：激發(fā)波長(zhǎng)330 nm，檢測(cè)波長(zhǎng)475 nm；維生素E測(cè)定波長(zhǎng)：激發(fā)波長(zhǎng)295 nm，檢測(cè)波長(zhǎng)325 nm。

表1 梯度洗脫條件

1.5 溶液配制

1.5.1 對(duì)照品儲(chǔ)備溶液 分別取對(duì)照品維生素A和維生素E各約100 mg，精密稱定，置100 ml量瓶，加甲醇溶解，定容至刻度，搖勻。

1.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液 取1.5.1對(duì)照品儲(chǔ)備溶液適量，分別用甲醇稀釋制成濃度依次為0.3，1.0，2.0，5.0，10.0，30.0 μg/ml標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。

1.5.3 供試品溶液 取多維生素保健品（以多維生素片為例）20片，精密稱定，研缽研成細(xì)粉；稱取適量樣品（根據(jù)樣品中含量確定）置于100 ml棕色量瓶，加甲醇約70 ml，超聲震蕩5 min（超聲頻率55 Hz，功率60%）；放置至室溫，用甲醇定容至刻度，搖勻；取上述溶液，0.45 μm濾膜過(guò)濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液作為供試品溶液（實(shí)驗(yàn)注意避光）。

2 方法與結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限

取1.5.2項(xiàng)溶液分別進(jìn)樣分析，以各對(duì)照品溶液的濃度（X）與其對(duì)應(yīng)的峰面積（Y）做線性曲線，結(jié)果維生素A和維生素B在一定范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系；取對(duì)照品溶液，逐級(jí)稀釋至各對(duì)照品色譜峰峰高分別達(dá)到3倍信噪比。得到維生素A和維生素E的檢測(cè)限分別為0.08，0.10 μg/ml。結(jié)果見(jiàn)表2，典型譜圖見(jiàn)圖1。

表2 線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)

圖1 典型譜圖

2.2 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

取已知含量的供試品樣品，分別加入適量的1.5項(xiàng)維生素A和維生素E對(duì)照品溶液，制備低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度（相當(dāng)于供試品溶液75%，100%和125%）供試品溶液，每個(gè)質(zhì)量濃度制備3份。按1.4項(xiàng)色譜條件檢測(cè)，結(jié)果表明，維生素A回收率約91.4%～104.2%；維生素E回收率約94.3%～105.2%。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 精密度考察

取已知含量的供試品樣品，進(jìn)行樣品前處理，得供試品溶液。按1.4項(xiàng)色譜條件檢測(cè)，同一樣品連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果表明，維生素A測(cè)定結(jié)果的精密度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.61%；維生素E測(cè)定結(jié)果的精密度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.04%。

2.4 重復(fù)性與穩(wěn)定性

已知含量的供試品樣品，進(jìn)行樣品前處理，得供試品溶液。同法配制6份供試品溶液。按1.4項(xiàng)色譜條件檢測(cè)，結(jié)果表明，維生素A測(cè)定結(jié)果的重復(fù)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.32%；維生素E測(cè)定結(jié)果的重復(fù)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.11%；取重復(fù)性溶液1份，室溫下放置0，2，4，8，12，24 h，按1.4項(xiàng)色譜條件分析，測(cè)得維生素A和維生素E的峰面積的RSD為2.32%和3.19%，結(jié)果表明，在此實(shí)驗(yàn)條件下，供試品溶液能穩(wěn)定放置24 h（避光條件下）。

2.5 應(yīng)用

取不同廠家多維生素保健品共3份，按1.5.3項(xiàng)進(jìn)行樣品前處理，取續(xù)濾液按1.4項(xiàng)色譜條件分別進(jìn)樣分析，測(cè)定維生素A和維生素E的含量。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 樣品檢測(cè)結(jié)果

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

維生素A和維生素E極性相差較大，維生素A極性較強(qiáng)，而維生素E極性較弱。如果選用等度洗脫方式，會(huì)導(dǎo)致維生素A出峰過(guò)早或維生素E出峰較遲。故選擇梯度洗脫方式，通過(guò)控制流動(dòng)相的極性變化，調(diào)節(jié)兩種待測(cè)物的出峰時(shí)間，保證兩者有較好的分離度前提，盡量縮短分析時(shí)間。實(shí)驗(yàn)分別選擇乙腈體系和甲醇體系對(duì)兩種待測(cè)化合物進(jìn)行洗脫。結(jié)果表明，選擇乙腈體系時(shí)，維生素A洗脫速度較快，出峰時(shí)間3.213 min，與死體積有交叉，影響準(zhǔn)確定量；選擇甲醇體系時(shí)，維生素A和維生素E能較好分離，且甲醇相對(duì)于乙腈對(duì)實(shí)驗(yàn)人員及環(huán)境的影響更小，故最終選擇甲醇體系作為流動(dòng)相。

3.2 熒光檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

取維生素A標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用甲醇配制含有維生素A約3 μg/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液。在熒光分光光度計(jì)上測(cè)定維生素A的激發(fā)波長(zhǎng)和檢測(cè)波長(zhǎng)分別為330 nm和475 nm；同法取維生素E標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用甲醇配制含有維生素E約3 μg/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液。得到維生素E的激發(fā)波長(zhǎng)和檢測(cè)波長(zhǎng)分別為295 nm和325 nm。相同條件下，測(cè)定試劑空白的影響，結(jié)果表明，試劑空白在上述激發(fā)波長(zhǎng)和檢測(cè)波長(zhǎng)下無(wú)干擾。