王東旭，王 虎，樊海寧，王海久，王志鑫，湯 鋒，廖夢(mèng)姣，王 強(qiáng)

(1.青海大學(xué)附屬醫(yī)院肝膽胰外科，青海 西寧；2.青海省包蟲(chóng)病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧；3.青海省衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)，青海 西寧；4.青海大學(xué)高原醫(yī)學(xué)研究中心，青海 西寧)

包蟲(chóng)病是棘球絳蟲(chóng)感染引起的一種嚴(yán)重的寄生蟲(chóng)疾病。但是目前，有關(guān)泡型包蟲(chóng)病的免疫機(jī)制還不是十分清楚。巨噬細(xì)胞(Macrophage，Mφ)主要來(lái)源于骨髓前體細(xì)胞，在機(jī)體固有免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答中發(fā)揮極其重要的作用，與炎癥反應(yīng)、免疫防御密切相關(guān)。目前研究發(fā)現(xiàn)，在不同的微環(huán)境中，巨噬細(xì)胞可以分化為不同細(xì)胞亞群：主要包括M1型，即經(jīng)典活化巨噬細(xì)胞；M2型，即替代活化巨噬細(xì)胞[1-4]。兩種不同表型的巨噬細(xì)胞在不同的疾病中也發(fā)揮著不同的作用，M1型主要分泌各種炎癥因子如IL-6、TNF-α、IL-12等促進(jìn)炎癥反應(yīng)、清除病原體等；M2型主要分泌一些抑炎因子如IL-10、TGF-β1等參與抗炎反應(yīng)、促進(jìn)組織修復(fù)等，同時(shí)也有研究表明其與寄生蟲(chóng)在體內(nèi)存活密切相關(guān)[5-8]。

本研究為了初步探討M1/M2巨噬細(xì)胞在肝泡型包蟲(chóng)病中的作用，檢測(cè)了泡型包蟲(chóng)病模型小鼠的外周血及腹腔巨噬細(xì)胞中M1/M2巨噬細(xì)胞及相關(guān)因子的表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6周齡BABL/C小鼠(SPF級(jí)，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司合格證號(hào)：SCXK(京)2012-0001)。實(shí)驗(yàn)組每只小鼠腹腔接種25%原頭節(jié)300 μL(原頭節(jié)從感染泡型包蟲(chóng)病的蒙古長(zhǎng)爪沙鼠中提取)，對(duì)照組每只小鼠腹腔注射等量生理鹽水。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)主要器材

5810R型離心機(jī)(Eppendorf公司)；BB150型培養(yǎng)箱(Thermo公司)；流式細(xì)胞儀(BD 公司)；超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠)；電子天平(上海閔橋儀器有限公司)；熒光顯微鏡(Olympus公司)；純水制備器(Thermo公司)。

1.1.3 主要試劑

小鼠IL-6、IL-10、TNF-α、TGF- β1 ELISA試劑盒(abcam公司)。CD16/32(CD16/32及同型抗體結(jié)合的熒光素為BV421)、CD206(CD206及同型抗體結(jié)合的熒光素為Alex647)流式抗體及同型抗體(BD公司)。

1.2 方法

1.2.1 腹腔巨噬細(xì)胞的分離與純化

隨機(jī)選取小鼠，向腹腔注射預(yù)冷的不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液5 mL。輕揉小鼠腹部2～5 min，靜置5～10 min后將小鼠處死(頸椎脫臼法)，收集腹腔灌洗液，并重復(fù)灌洗兩次。將三次回收的灌洗液離心(5min，4℃，500g)，所得細(xì)胞沉淀用預(yù)冷EMEM培養(yǎng)液洗滌兩次后離心(5min，4℃，500g)，棄去上清液，將沉淀細(xì)胞再加入預(yù)冷DMEM培養(yǎng)液(0.1%青霉素-鏈霉素和10%胎牛血清)重懸細(xì)胞。以常規(guī)方法計(jì)數(shù)細(xì)胞，用預(yù)冷培養(yǎng)液調(diào)整腹腔細(xì)胞濃度至2×106/mL，然后將細(xì)胞懸液接種于24孔培養(yǎng)板中，1 mL/孔，置于培養(yǎng)箱(37℃、5%CO2、飽和濕度)繼續(xù)孵育2.5 h后換液，并用DMEM培養(yǎng)基洗1～2次，棄去未粘附細(xì)胞，貼壁細(xì)胞為單層的巨噬細(xì)胞。用細(xì)胞刮輕柔將貼壁的巨噬細(xì)胞刮下，并重復(fù)灌洗兩次。將回收的灌洗液離心(5min，4℃，500g)，棄上清液，將沉淀細(xì)胞重懸于1×PBS，渦旋混勻后離心(5min，4℃，500g)，棄上清液，加1×PBS 500 μL。以常規(guī)方法計(jì)數(shù)細(xì)胞，用1×PBS將細(xì)胞濃度調(diào)整至1×106/mL待用[9]。

1.2.2 巨噬細(xì)胞的形態(tài)觀察

1.2.1步驟中貼壁的細(xì)胞即為巨噬細(xì)胞，在顯微鏡下觀察巨噬細(xì)胞的形態(tài)，并且在熒光顯微鏡下拍照。如圖1所示：巨噬細(xì)胞形態(tài)多樣，呈圓形或橢圓形、長(zhǎng)梭形、不規(guī)則形，細(xì)胞體積較大，胞漿含量豐富，有些細(xì)胞可見(jiàn)較長(zhǎng)的偽足和突起。

1.2.3 瑞氏染色和巨噬細(xì)胞的純度計(jì)算

取1滴細(xì)胞懸液滴加于潔凈載玻片上，制備涂片，自然干燥，瑞氏染色后將干燥好的涂片置光學(xué)顯微鏡下觀察，用油鏡計(jì)數(shù)細(xì)胞。結(jié)果顯示細(xì)胞形態(tài)多樣，體積較大，胞漿豐富，內(nèi)含較多顆粒，巨噬細(xì)胞的純度大于97%。

圖1 腹腔巨噬細(xì)胞(×400)

1.2.4 流式細(xì)胞技術(shù)應(yīng)用

每管中加入1.2.1步驟中得到的巨噬細(xì)胞(濃度1×106/mL)100 μL。加入抗體各5 μL，室溫避光孵育30 min；離心(5min，4℃，200g)；小心棄掉上清液；加入2 mL1×PBS，渦旋混勻；離心(5min，4℃，200g)；小心棄掉上清液；加入500 μL1×PBS渦旋混勻上機(jī)。

1.2.5 M1/M2巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子的表達(dá)檢測(cè)

ELISA法檢測(cè)小鼠泡型包蟲(chóng)病模型血清中IL-6、IL-10、TNF-α、TGF-β1的含量，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作。將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成不同濃度，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出各樣本的濃度(最終樣本的濃度需要乘以稀釋倍數(shù))。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 流式結(jié)果

如圖2、表1所示，與正常小鼠(0.25%±0.13%)相比，感染泡球蚴90天的小鼠CD16/32+(24.18%±3.60%)的巨噬細(xì)胞(M1)百分比呈增加趨勢(shì)，P<0.05；與正常小鼠(0.30%±0.14%)相比，感染泡球蚴90天的小鼠CD206+(5.75%±0.45%)的巨噬細(xì)胞(M2)百分比呈增加趨勢(shì)，P<0.05。

A為正常對(duì)照組與感染組CD16/32+巨噬細(xì)胞百分比；B為正常對(duì)照組與感染組CD206+巨噬細(xì)胞百分比

表1泡球蚴感染過(guò)程中M1和M2巨噬細(xì)胞百分比的變化值

Table 1 Changes in percentages of M1 and M2 macrophages during E.multilocularis infection

2.2 ELISA結(jié)果

如表2所示，IL-6、IL-10、TNF-α、TGF-β1的ELISA結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組相比，感染組中IL-6、TNF-α、TGF-β1的含量均有不同程度增加，*P<0.05；而感染組與對(duì)照組中IL-10差異不明顯，**P>0.05。IL-6分別為正常對(duì)照組0.374±0.054，感染組197.160±59.167；TNF-α分別為正常對(duì)照組0.269±0.199，感染組8.033±1.641；TGF-β1分別為正常對(duì)照組47.800±16.943，感染組95.128±13.073；IL-10分別為正常對(duì)照組0.026±0.006，感染組0.030±0.011。

表2泡球蚴感染過(guò)程中M1/M2巨噬細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的變化值

Table 2 Changes of M1 and M2-related cytokine expression in macrophages during E. multilocularis infection

3 討論

包蟲(chóng)病是全球范圍內(nèi)危害最為嚴(yán)重的人畜共患寄生蟲(chóng)疾病之一，也是青海地區(qū)重點(diǎn)防治的寄生蟲(chóng)疾病之一。該地區(qū)包蟲(chóng)病呈分布范圍廣泛、病死率高的特點(diǎn)。調(diào)查顯示青海地區(qū)人群包蟲(chóng)病患病率為0.63%，部分地區(qū)高達(dá)12.38%。研究發(fā)現(xiàn)[10]，囊型包蟲(chóng)病患者存在Th17與Treg細(xì)胞的失衡，更重要的是Nannan Pang[11]等人發(fā)現(xiàn)小鼠在感染泡球蚴的中晚期也存在這一現(xiàn)象，同時(shí)也證實(shí)可能是通過(guò)TGF- β/Smad信號(hào)通路導(dǎo)致Th17/Treg細(xì)胞失衡的。與其他感染性疾病相同，宿主免疫的狀態(tài)對(duì)于泡球蚴在宿主體內(nèi)的持續(xù)感染及生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程具有決定性的影響；與腫瘤不同的是，泡球蚴作為外源性病原體具有更強(qiáng)的免疫原性，理應(yīng)更容易被宿主免疫系統(tǒng)識(shí)別并殺傷，然而大量的臨床泡型包蟲(chóng)病病例證實(shí)：泡球蚴感染人體后能有效躲避宿主正常免疫系統(tǒng)的殺傷作用而在宿主體內(nèi)生長(zhǎng)發(fā)育并造成繼發(fā)損傷。目前我們對(duì)包蟲(chóng)病缺少有效的早期檢測(cè)手段，原因是有關(guān)棘球絳蟲(chóng)是如何有效逃避宿主正常的免疫殺傷機(jī)制而在人體內(nèi)長(zhǎng)期存活并造成嚴(yán)重的病理?yè)p害的免疫機(jī)制尚不清楚，故深入研究棘球絳蟲(chóng)感染后的免疫逃逸機(jī)制有助我們對(duì)該疾病進(jìn)展過(guò)程中關(guān)鍵環(huán)節(jié)的了解，為后期尋找相應(yīng)有效防治措施奠定基礎(chǔ)。

巨噬細(xì)胞作為機(jī)體免疫系統(tǒng)重要的組成部分，在免疫防御、免疫應(yīng)答等方面均發(fā)揮重要作用。巨噬細(xì)胞具有可塑造性，在不同的刺激因子作用下可以極化為功能不同的M1巨噬細(xì)胞和M2巨噬細(xì)胞[12]。研究發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞參與不同寄生蟲(chóng)感染過(guò)程。Jifeng Zhu[13]等在研究感染血吸蟲(chóng)的小鼠時(shí)發(fā)現(xiàn)，不同感染階段M1/M2巨噬細(xì)胞的百分比發(fā)生了改變，提示血吸蟲(chóng)感染過(guò)程存在巨噬細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)換[14]。Rajeev Kumar Pandey[15]等通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)上調(diào)巨噬細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá)有利于利什曼原蟲(chóng)的存活。另一項(xiàng)研究表明瘧疾患者通過(guò)抗Tim-3治療可以下調(diào)單核-巨噬細(xì)胞中Tim-3的表達(dá)，這有利于機(jī)體內(nèi)瘧原蟲(chóng)的清除[16]。

本研究采用小鼠泡型包蟲(chóng)病模型，討論小鼠在感染棘球絳蟲(chóng)90天后M1/M2巨噬細(xì)胞的變化。其中，通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞CD16/32及CD206表達(dá)情況；通過(guò)ELISA檢測(cè)小鼠外周血M1/M2相關(guān)細(xì)胞因子(IL-6、IL-10、TNF-α、TGF-β1)的表達(dá)情況。CD16/32和CD206陽(yáng)性率的大小分別反映了M1/M2巨噬細(xì)胞含量的高低；IL-6、TNF-α表達(dá)高低反映M1巨噬細(xì)胞的多少；IL-10、TGF-β1表達(dá)高低反映M1巨噬細(xì)胞的多少。

通過(guò)流式實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，與對(duì)照組相比，感染組CD16/32+及CD206+的巨噬細(xì)胞均有不同程度的增加；而ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，除IL-10外，IL-6、TNF-α、TGF-β1均有不同程度的增加，說(shuō)明小鼠在感染棘球絳蟲(chóng)90天后，宿主一方面通過(guò)上調(diào)M1巨噬細(xì)胞的表達(dá)，分泌如IL-6、TNF-α等促炎物質(zhì)發(fā)揮促炎作用，幫助機(jī)體清除病原體；另外一方面，泡球蚴可能通過(guò)表達(dá)某些物質(zhì)作用于宿主免疫系統(tǒng)，使M2巨噬細(xì)胞表達(dá)上調(diào)，分泌IL-10、TGF-β1等因子，幫助棘球絳蟲(chóng)逃避宿主免疫系統(tǒng)的殺傷作用。二者處于一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)二者失衡，就會(huì)引起機(jī)體殺傷或者保護(hù)寄生蟲(chóng)。為了進(jìn)一步闡明泡球蚴感染后M1/M2巨噬細(xì)胞變化，一方面我們需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，另一方面我們需要從不同的時(shí)間點(diǎn)收集實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)動(dòng)態(tài)觀察M1/M2巨噬細(xì)胞的變化。