王玉晴，吳 君，朱世海，張 霞，栗瑞紅，衛(wèi)福磊，劉 揚(yáng)，韓步鷹，劉小紅，千康康，簡(jiǎn)生龍，王國杰，李長忠*

(1.青海大學(xué) 生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院， 青海 西寧 810016；2.青海省漁業(yè)環(huán)境監(jiān)測(cè)站，青海 西寧 810012)

生物標(biāo)志物作為敏感的生物效應(yīng)“早期預(yù)警”工具，可以快速、準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)生物體在受到重金屬污染時(shí)的毒性與毒害作用，但如何篩選有效的生物標(biāo)記物是研究的難點(diǎn)。本研究以高原花斑裸鯉(Gymnocypriseckloni)為研究對(duì)象，擬通過對(duì)高原花斑裸鯉過氧化氫酶(catalase，CAT)基因的克隆鑒定表達(dá)及對(duì)其Cu2+脅迫的應(yīng)答分析，篩選Cu2+脅迫下的有效生物標(biāo)記物。

2013年發(fā)布的中國漁業(yè)生態(tài)環(huán)境狀況公報(bào)表明，銅污染在重要漁業(yè)區(qū)中已越來越嚴(yán)重。銅作為超氧化物歧化酶(SOD)等催化酶類的輔助因子，是生物體所必需的微量元素[1]，而銅作為必需的微量元素和致毒金屬之間的濃度范圍是很小的[2-3]。當(dāng)生物體內(nèi)銅過量時(shí)，機(jī)體產(chǎn)生大量的ROS，引起蛋白質(zhì)、脂類等的氧化以及免疫毒性[4]，導(dǎo)致重金屬中毒，而SOD-CAT系統(tǒng)作為抗氧化防御的第一道防線，能有效清除ROS，從而使機(jī)體有效地抵制氧化反應(yīng)[5]。有研究表明[6]，CAT可以作為一種有效的生物標(biāo)志物(biomarker)應(yīng)用于分子生態(tài)毒理的研究中。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)前將水族箱用高錳酸鉀進(jìn)行消毒(3～5h)，然后用清水洗凈。養(yǎng)殖用水經(jīng)西安國聯(lián)質(zhì)量檢測(cè)技術(shù)股份有限公司檢測(cè)無重金屬超標(biāo)現(xiàn)象，為正常水質(zhì)。

3齡期成體高原花斑裸鯉取自青海省漁業(yè)環(huán)境監(jiān)測(cè)站隆務(wù)河口養(yǎng)殖場(chǎng)，體重為105±10 g，體長為19±3 cm。運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后，暫養(yǎng)于青海大學(xué)生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院細(xì)胞遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室冷流水養(yǎng)殖箱(溫度17±2℃；光照周期為14h/10h)，適應(yīng)性飼養(yǎng)2周，然后挑取無傷病、規(guī)格相近的健壯個(gè)體作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。

1.2 脅迫方法

本研究選擇以《中國漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》(GB 11607-1989)中Cu2+的標(biāo)準(zhǔn)值(0.05mg/L)為脅迫濃度。試驗(yàn)設(shè)置1個(gè)空白組和1個(gè)處理組，同處理組設(shè)置3個(gè)平行組。每個(gè)平行組投入6尾高原花斑裸鯉。實(shí)驗(yàn)期間正常喂食，每天換三分之一的水以保持水體清潔，并增加相應(yīng)量的Cu2+以維持濃度的平衡。在脅迫后12、24、48 h時(shí)取樣，每次取樣時(shí)，隨機(jī)從每組取1尾魚，解剖鰓、腦、肌肉、腎臟和肝臟組織，立即用液氮速凍，然后放入-80 ℃冰箱保存。

1.3 試劑

CuSO4和總RNA提取試劑盒(DP419，天根，中國)，PrimeScriptTMⅡ1st strand cDNASynthesis Kit(6210A，TaKaRa，Japan)，SMARTer RACE 5′/3′Kit(TaKaRa)，Premix ExTaq(TaKaRa)，pMDTM 19-T Vector Cloning Kit(TaKaRa)，PrimeScriptTM RT reagent Kit(Perfect Real Time，RR0370A，TakaRa，Japan)，iQTM SYBR Green Supermix(BIO-RAD)

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1CAT基因的克隆

用總RNA提取試劑盒提取高原花斑裸鯉肝組織總RNA，用PrimeScriptTMⅡ1st strand cDNA Synthesis Kit及SMARTer RACE 5′/3′Kit(TaKaRa)試劑盒獲得cDNA模板。

根據(jù)虹鱒魚(Oncorhynchusmykiss)、鯉魚(Cyprinuscarpio)、斑馬魚(Daniorerio)、鯽魚(Carassiusauratus)等已知物種的CAT基因cDNA保守序列，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物(表1)擴(kuò)增特異性片段。用特異性片段設(shè)計(jì)RACE引物(表1)，通過RACE技術(shù)獲得基因末端片段。將得到的三段序列拼接并再次設(shè)計(jì)引物(表1)，應(yīng)用RT-PCR法擴(kuò)增并測(cè)序，確定克隆得到的是GeCATcDNA全長序列。所有測(cè)序均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

表1PCR引物相關(guān)參數(shù)

Table 1 Reference of the Oligo nucleotide primers used for PCR

1.4.2 序列分析與同源性分析

首先利用National Centre for Biotechnology Information blastn(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比對(duì)序列，通過DNAMAN V6進(jìn)行蛋白質(zhì)翻譯，利用NCBI blastp中保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫(Conserved Domain Database，CDD)分析保守結(jié)構(gòu)域，利用VectorNTI11、MAGA5對(duì)GeCAT進(jìn)行同源性分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建。

1.4.3 各組織中GeCAT的表達(dá)分布特征及其在Cu2+脅迫下的應(yīng)答模式

根據(jù)實(shí)驗(yàn)克隆得到的GeCATcDNA序列設(shè)計(jì)Real time PCR引物(表1)，用RT-PCR法比較高原花斑裸鯉肝臟、腎臟、腦、鰓及肌肉組織中GeCAT在mRNA水平上的表達(dá)分布以及其在Cu2+脅迫下的應(yīng)答模式，以β-actin為內(nèi)參照?？俁NA提取同前所述，用PrimeScriptTM RT reagent Kit試劑盒合成cDNA。RT-PCR體系為iQTM SYBR Green Supermix 10 μL；Ge-CAT-RTF1及Ge-CAT-RTR1 0.5 μL；ddH2O 8.0 μL；cDNA模板1.0 μL。擴(kuò)增條件為95 ℃ 30 s ；95 ℃ 15 s；57 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s，共39個(gè)循環(huán)。同一樣本重復(fù)3次，單次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，運(yùn)用2-△△Ct法計(jì)算CAT的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析方法

利用SPSS 20.0(IBM，USA)和OriginPro 8.0.0(OriginLab，USA)等軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，差異性檢驗(yàn)采用單因素方差分析(Analysis of variance，ANOVA)，多重比較采用Student-Newman-Keuls。結(jié)果均以P<0.05作為顯著性判斷的標(biāo)準(zhǔn)。

M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；PCR擴(kuò)增結(jié)果(箭頭所指為目標(biāo)條帶)

M：DNA Maker；PCR fragment(The arrow refers to the target product)

圖1高原花斑裸鯉CATPCR產(chǎn)物電泳圖

Figure1PCRproductsofGeCAT

2 結(jié)果

2.1 CAT全長序列的克隆及序列

根據(jù)1.2中的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行RT-PCR和RACE擴(kuò)增，獲得特異性片段條帶(圖1A)、5′-UTR條帶(圖1B)、3′-UTR條帶(圖1C)及通過Confirm PCR獲得全長條帶(圖1D)。測(cè)序比對(duì)后得到全長cDNA序列編碼區(qū)1665 bp、5′-UTR 158 bp和3′-UTR 440 bp，其ORF編碼555個(gè)氨基酸殘基。利用CDD分析GeCAT氨基酸序列保守結(jié)構(gòu)域，其具有1個(gè)酶活性中心序列和亞鐵血紅素結(jié)合信號(hào)序列、3個(gè)催化位點(diǎn)殘基、1個(gè)3'端加尾信號(hào)序列和多個(gè)亞鐵血紅素結(jié)合口袋(heme binding pocket)、NADPH結(jié)合位點(diǎn)(NADPH binding site)及多肽結(jié)合位點(diǎn)(polypeptide binding site)(圖2)。

方框分別表示起始密碼子ATG和終止密碼子TGA；酶活性中心序列“FDRERIPERVVHAKGA”用加粗下劃線標(biāo)出；亞鐵血紅素結(jié)合信號(hào)序列“RLFSYPDTH”用方框標(biāo)出；3個(gè)催化位點(diǎn)殘基“H”“N”“Y”及其相應(yīng)的核苷酸密碼子用陰影標(biāo)出；信號(hào)序列“AATAAA”用下劃線標(biāo)出；加粗下劃線部分為亞鐵血紅素結(jié)合口袋；斜體加粗為NADPH結(jié)合位點(diǎn).

The start codon“ATG”and the stop codon“TAA”are indicated by blocks；Enzyme active site sequences“FDRERIPERVVHAKGA”are indicated by bold and underline；and heme-ligand banding signal sequences“RLFSYPDTH”are box；The three conserved catalytic amino acids“H”，“N”and“Y”and their corresponding nucleotide codon are shadowed；The polyadenylation signal sequence“AATAA”is underlined.The boldface respresent heme binding pocket；The Italics bold respresent the NADPH binding site.

圖2GeCATcDNA序列和氨基酸序列圖

Figure2ThecompletecDNAsequencesandaminoacidsequencesofGeCAT

利用Vector NTI11對(duì)GeCAT分析同源性(表2)。再通過MEGA6.0構(gòu)建鄰接(neighbor-joining，NJ)系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)。經(jīng)同源序列比對(duì)分析高原花斑裸鯉與草魚(Ctenopharyngodonidella)、大西洋鮭(Salmosalar)、條石鯛(Oplegnathusfasciatus)、人(Homosapiens)、褐家鼠(Rattusnorvegicus)、鰱魚(Hypophthalmichthysmolitrix)、斑馬魚(Daniorerio)、核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum)等的同源性為33.6%至87.6%。系統(tǒng)進(jìn)化聚類分析表明，GeCAT與草魚、鰱魚、斑馬魚的親緣關(guān)系很近，聚為一枝，而與菌類的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

表2高原花斑裸鯉與其他物種CAT氨基酸序列同源性分析表

Table 2 Homology analysis of GeCAT amino acid sequences between Gymnocypris eckloni and other species

續(xù)表：

物種登錄號(hào)與CAT同源性大西洋鮭Salmo salarNP_001133774.168.8%草魚Ctenopharyngodon idellaACL99859.287.1%鰱魚Hypophthalmichthys molitrixADJ67807.187.6%家蠶Bombyx mori NP_001036912.158.8%棉鈴蟲Helicoverpa armigeraXP_021187541.159.5%囊舌蟲Bombyx moriSaccoglossus kowalevskiiXP_002738841.160.8%盤鮑Haliotis discus discusABQ60044.159.2%蝦夷扇貝Mizuhopecten yessoensisAKV63251.160.8%合浦珠母貝Pinctada fucataADW0870061.3%酵母Saccharomyces sp.‘boulardii’KQC44730.140.1%曲霉菌Aspergillus flavusKOC11428.137.3%寄生曲霉Aspergillus parasiticusKJK68729.134.3%核盤菌Sclerotinia sclerotiorumEDN93275.133.6%

所引用的序列均來自GenBank All sequences and the accession numbers are from the GenBank database

圖3GeCAT進(jìn)化樹分析圖

Figure3ThephylogenetictreeanalysisofGeCAT

2.2 GeCAT的應(yīng)答模式

2.2.1 各組織中GeCAT的表達(dá)分布特征

正常生理狀態(tài)下，高原花斑裸鯉肝臟、腎臟、鰓、腦及肌肉等組織中GeCAT轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)表現(xiàn)出差異(圖4)。GeCAT在肝臟中表達(dá)水平最高，腦、腎臟和肌肉組織次之，鰓中最低。

圖4GeCAT在高原花斑裸鯉各組織中的表達(dá)分布圖

Figure4ExpressionanalysisofGeCATintissuesofG.eckloni

2.2.2 Cu2+脅迫下GeCAT的應(yīng)答模式

Cu2+脅迫下48 h內(nèi)，高原花斑裸鯉GeCAT在不同時(shí)間段中肝臟、腎臟、鰓及腦組織中的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量的變化表現(xiàn)出一定的規(guī)律性(圖5)。Cu2+脅迫后48 h內(nèi)，GeCAT最先在腦和鰓中應(yīng)答，在脅迫12 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到高峰；其次是在腎中應(yīng)答，在脅迫24 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到高峰，而在肝臟中脅迫48 h時(shí)表達(dá)量才有顯著升高(P<0.05)。

圖5Cu2+脅迫下GeCAT表達(dá)模式圖

Figure5TheexpressionpatternsofGeCATunderCu2+stress

3 討論

保守序列結(jié)構(gòu)分析表明，GeCAT屬于單功能CAT。GeCAT的3′-UTR不含CA重復(fù)序列，這與草魚[7]和斑馬魚[8-9]的CAT3′UTR具有較長CA重復(fù)序列不同，這表明在不同的水生動(dòng)物中，CAT3′-UTR有著不同的序列特征。序列特征分析表明，GeCAT與鰱魚、草魚的同源性分別為87.6%、87.1%，花斑裸鯉同硬骨魚的同源性都較高，在進(jìn)化關(guān)系上表現(xiàn)出高度的保守性。

在Cu2+脅迫下，在不同組織中的GeCATmRNA水平相對(duì)表達(dá)量的變化趨勢(shì)呈現(xiàn)出一定的規(guī)律性和組織特異性。在腦和鰓中，脅迫12 h時(shí)GeCAT表達(dá)量達(dá)到最高值(P<0.05)；在腎臟中脅迫24 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高值(P<0.05)，而在肝臟中，脅迫48 h時(shí)表達(dá)量才有顯著升高(P<0.05)。首先，這一結(jié)果表明，在本實(shí)驗(yàn)條件下，花斑裸鯉被檢測(cè)的4個(gè)組織中GeCAT在mRNA水平產(chǎn)生了不同程度的應(yīng)答。其次，不同組織中的GeCAT在mRNA水平產(chǎn)生應(yīng)答的時(shí)間和量上表現(xiàn)出組織特異性。這與Hidalog等人[10]、Gul等人[11]的研究結(jié)果基本一致。分析其主要原因，一方面，Cu2+在本實(shí)驗(yàn)條件下的脅迫可能使花斑裸鯉體內(nèi)產(chǎn)生大量的ROS，而ROS可以作為信號(hào)分子使核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2 related factor 2，Nrf2)與Keap1(Kelch-like相關(guān)蛋白1)發(fā)生泛素化解體，Nrf2發(fā)生核易位進(jìn)入細(xì)胞核，先與小MAF蛋白結(jié)合，然后結(jié)合到抗氧化反應(yīng)元件(Antioxidant Response Element，ARE)，使靶基因(CAT、SOD等)轉(zhuǎn)錄激活[12]，發(fā)揮抗氧化調(diào)節(jié)作用，保護(hù)機(jī)體免受氧化應(yīng)激損傷。另一方面，在Cu2+脅迫下，Cu2+首先會(huì)作為必須元素結(jié)合到Cu/Zn-SOD上，使Cu/Zn-SOD先發(fā)揮作用，所以在Cu2+脅迫之初并沒有觀察到GeCAT表達(dá)量的升高，也可能是我們以國家漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的濃度進(jìn)行了脅迫，GeCAT表達(dá)量的變化與脅迫濃度相吻合。

GeCAT在肝臟中的表達(dá)變化最顯著，F(xiàn)ranchi等人[13]研究發(fā)現(xiàn)，肝臟是氧化反應(yīng)最強(qiáng)的器官，其抗氧化酶活性最高，氧化反應(yīng)最激烈。GeCAT在鰓組織中的應(yīng)答比其他組織更早，可能是由于鰓長期暴露在水中并最先接觸Cu2+而導(dǎo)致的。大腦含有大量的不飽和脂質(zhì)，占用總需氧量的20%，很容易受到氧化損傷的影響[14]。所以，在Cu2+脅迫后，腦中GeCATmRNA表達(dá)水平與鰓一樣最先進(jìn)行應(yīng)答。

綜上所述，Cu2+脅迫下GeCAT在不同組織中的應(yīng)答模式主要由Nrf2-ARE信號(hào)通路調(diào)控，并表現(xiàn)出明顯的組織特異性，而Cu2+脅迫產(chǎn)生的ROS可以作為多條信號(hào)通路的信號(hào)分子，激活其他信號(hào)通路，所以花斑裸鯉在Cu2+脅迫下的應(yīng)答調(diào)控機(jī)制以及GeCAT在不同組織中應(yīng)答模式的調(diào)控機(jī)理都還需要進(jìn)一步研究。本研究成功實(shí)現(xiàn)花斑裸鯉CAT的克隆鑒定表達(dá)，初步分析了花斑裸鯉CAT對(duì)Cu2+脅迫的應(yīng)答模式，更好地揭示了CAT等抗氧化酶類與氧化應(yīng)激之間的關(guān)系，并篩選出了有效生物標(biāo)記物。