李 佳，白振忠，格日力

(青海大學高原醫(yī)學研究中心；青海省高原醫(yī)學應用基礎(chǔ)重點實驗室；青海-猶他聯(lián)合重點實驗室，青海 西寧，810001)

高原土著動物具有良好的抵御外在環(huán)境壓力的能力。本文將從與脂代謝和能量平衡相關(guān)的三種蛋白(PTEN、CPT1A和COX4)為著眼點，研究它們在白色脂肪(fat)、棕色脂肪(bfat)、肝臟(liver)和骨骼肌(muscle)的表達水平，從而探討高原鼠兔在高原生存的策略及可能的適應機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

研究對象為同一時間在青海門源地區(qū)(海拔3250m)捕捉的高原鼠兔，雄性12只，雌性8只，平均體重為(133.245±12.816)g。排除體弱及寄生蟲感染的實驗個體。

1.2 實驗方法

1.2.1 標本采集與處理：所有實驗動物應用烏拉坦麻醉，下腔靜脈采血后，斷頸處死，分別取腹股溝區(qū)白色脂肪組織，肩胛區(qū)棕色脂肪組織，肝臟，比目魚肌肌肉組織。所有組織置于-80 ℃低溫保存，統(tǒng)一提取蛋白，用BCA試劑盒定量后備用。

1.3 統(tǒng)計學方法

本實驗采用SPSS 24.0醫(yī)學統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果以均數(shù)±標準差表示，不同組織間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用事后檢驗分析(boferroni檢驗)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 PTEN在四種組織中的表達

Western blotting結(jié)果顯示，PTEN在高原鼠兔肝臟組織的表達明顯高于其他組織，差異具有統(tǒng)計學意義。同時在肌肉組織中的表達最低(圖1，表1)。

2.2 CPT1A在四種組織中的表達

蛋白電泳結(jié)果顯示，CPT1A在肝臟和肌肉組織高表達，且在肝臟表達最高。與此同時，在兩種脂肪組織中，發(fā)現(xiàn)其在棕色脂肪組織略有表達，但差異無統(tǒng)計學意義(圖2，表1)。

2.3 COX4在四種組織中的表達

實驗結(jié)果顯示，COX4在肝臟、肌肉及棕色脂肪組織高表達，且在肝臟表達最高。在兩種脂肪組織中，棕色脂肪組織的表達顯著高于白色脂肪組織，差異有統(tǒng)計學意義。與此同時，我們發(fā)現(xiàn)COX4在四種組織中表達的趨勢與CPT1A一致(圖3，表1)。

圖1PTEN在高原鼠兔四種組織中的表達圖

Figure1PTENexpressioninthefourkindsoftissueinPika

圖2 CPT1A在高原鼠兔四種組織中的表達圖

圖3 COX4在高原鼠兔四種組織中的表達圖

Table 1 PTEN， CPT1A and COX4 expression in the four kinds of tissue in

*：與fat比較P<0.05；#：與liver比較P<0.05；△：與bfat比較P<0.05.

3 討論

第10號染色體缺失性磷酸酶及張力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN)在細胞生長、發(fā)育等方面發(fā)揮重要作用，其主要作用是抑制增殖和促進凋亡[1]。PTEN在機體組織和器官中廣泛表達。近年來發(fā)現(xiàn)，PTEN基因多態(tài)性與脂代謝紊亂相關(guān)[2]，可負性調(diào)節(jié)胰島素信號，其上調(diào)可能導致胰島素抵抗的發(fā)生[3]。作用機制可能是通過負向調(diào)節(jié)PI3K/Akt途徑[4]，并誘導細胞凋亡[5]。研究表明，特異性敲除小鼠PTEN基因可增加胰島素敏感性。然而，可同時增加肝腫大、肝脂肪變、腫瘤的機率。本研究發(fā)現(xiàn)PTEN基因在高原鼠兔與胰島素作用的靶器官廣泛表達，但在肝臟組織表達最高，可能與其調(diào)節(jié)胰島素以及脂肪酸合成有關(guān)。由于本研究的局限性，未做季節(jié)性比較，不能更加有效地探討高原鼠兔面對高原極端環(huán)境挑戰(zhàn)的不同策略和適應性改變。以往的研究證實PTEN基因受寒冷刺激后在脂代謝相關(guān)組織的表達下調(diào)。因此，需要更加完善的實驗設計，進而從組織水平探討高原土著物種的適應策略。

肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶-1A(carnitine palmitoyltransferase 1A，CPT1A)，是脂肪酸β氧化的限速酶[6，7]。CPT1A介導脂肪酸β氧化是通過將脂肪酸在細胞內(nèi)的長鏈酯酰CoA催化為長鏈酯酰肉堿，繼而轉(zhuǎn)運進入線粒體，進行氧化供能。人類CPT1A主要在肝、腎、肺等組織中表達，且不同組織中CPT1A的活性不同，以肝臟最強。一項新的發(fā)現(xiàn)表明，CPT1A基因可促進細胞的運動性能[8]，且長時耐力運動對CPT1基因表達具有重要影響，這可能是由于長時耐力訓練的能量主要由脂肪酸氧化供給導致。高原鼠兔CPT1A基因在不同組織的表達差異可能與其所面臨的高原極端環(huán)境有關(guān)，比如，在極端寒冷條件下捕食以及避免其他動物的獵殺等需要消耗過多的能量和體力。因此，CPT1A在高原鼠兔肝臟、骨骼肌組織表達較高，通過CPT1A脂肪酸氧化，從而及時補充能量。CPT1A在高原鼠兔與脂代謝及胰島素相關(guān)的組織中廣泛表達，且在不同組織中存在明顯的差異，即在肝臟中表達最高，這一點與人類相一致。近年來的研究表明，CPT1A對脂肪細胞中游離脂肪酸誘導的胰島素抵抗(IR)起保護作用[9]。CPT1A在肝臟中表達最高，可能由于肉堿主要在肝臟中合成，所以肉堿轉(zhuǎn)移酶基因高表達。Gao等[10]研究表明，CPT1A表達上升可抑制JNK因子，從而阻斷大量游離脂肪酸引起的IR效應及炎癥反應，維持脂肪細胞的正常功能。同時，Bruce等[11]發(fā)現(xiàn)增強CPT1A活性或提高CPT1A表達量均可促進脂肪酸β氧化，從而間接增強胰島素的活性，改善高脂飲食誘導的IR效應。一項在肥胖小鼠及瘦鼠的體內(nèi)實驗也表明，CPT1A表達增加，可顯著降低肝臟甘油三酯的含量[12]。因此，通過提高CPT1A的表達加快脂肪酸氧化，可改善代謝紊亂、及時進行能量補給，從而調(diào)節(jié)機體能量代謝平衡。

線粒體是脂肪酸氧化、ATP合成的重要場所，細胞色素C氧化酶亞單位IV(cytochrome c oxidase subunit IV，COX4)是線粒體氧化呼吸的關(guān)鍵酶，對線粒體氧化磷酸化具有重要作用。COX4表達的增加為機體提供更多的熱量，從而保持體溫及維持能量代謝平衡。有研究表明，耐力運動可提高脂膳食大鼠趾長伸肌COX4mRNA表達。高原鼠兔在廣闊的高原草場喜奔跑，通過這種方式進行捕食及避免天敵的獵殺。COX4在高原鼠兔肝臟、骨骼肌、棕色脂肪組織中高表達表明，高原鼠兔面臨周圍環(huán)境的挑戰(zhàn)時主要通過線粒體氧化呼吸產(chǎn)熱、供能，從而在低溫環(huán)境下維持體溫及保持能量平衡。一項針對高原鼠兔的研究表明，將其從高海拔轉(zhuǎn)移至低海拔后，通過模擬高海拔環(huán)境，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，其產(chǎn)熱相關(guān)基因解偶聯(lián)蛋白-1(UCP-1)、過氧化物酶體增殖-激活受體-1α (PGC-1α)表達明顯增加，同時線粒體活性基因表達增加[13]。另一項研究表明，運動可激活PGC-1α的表達，促進線粒體增殖，改善線粒體代謝酶活性，證明COX4是PGC-1α介導的線粒體適應性改變的靶基因[14]，運動可上調(diào)PGC-1α的表達，促進線粒體增殖，增加COX4的表達和活性，從而提高線粒體的功能。由此可見，高原鼠兔在應對高原高寒低氧環(huán)境挑戰(zhàn)時，可能是通過增強線粒體活性及脂肪酸氧化，從而增加產(chǎn)熱，補充能量，維持體溫，避免低體溫損傷。高原鼠兔COX4基因在脂代謝及胰島素作用相關(guān)組織廣泛表達，揭示高原特殊環(huán)境可能為脂代謝紊亂、胰島素抵抗相關(guān)疾病提供潛在的治療策略。

綜上所述，PTEN 、CPT1A和COX4基因在高原鼠兔不同組織表達的差異，可能揭示高原這一土著物種面臨高原特殊環(huán)境的策略與適應性改變，譬如高原鼠兔的瘦素(leptin)基因發(fā)生了適應性改變[15]，從而更好地適應高原極端環(huán)境。PTEN在介導胰島素通路所呈現(xiàn)的負向作用揭示，可通過下調(diào)或特異性敲除PTEN基因，從而改善脂代謝紊亂、胰島素抵抗等代謝性疾病。CPT1A和COX4基因在高原鼠兔與代謝相關(guān)組織的表達水平相一致，揭示它們可能是高原鼠兔面臨環(huán)境壓力的對抗策略，或許它們的某些基因已經(jīng)發(fā)生特異性改變，因此，需要更多的實驗來驗證這一假說。同時，CPT1A和COX4基因介導的脂肪酸β氧化和線粒體氧化呼吸作用，可能為代謝相關(guān)性疾病提供靶向治療，從而減少肥胖、胰島素抵抗、心血管疾病等的發(fā)生。