張博，韓聞卿，李瑩，2，楊歌，趙蕾，杜信，姜雅秋

（1. 中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，中國醫(yī)科大學(xué)內(nèi)分泌研究所，遼寧省內(nèi)分泌疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽 110001；2. 遼陽市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 遼陽 111000）

葡萄糖是機(jī)體組織細(xì)胞的主要能量來源和基本代謝底物。機(jī)體通過復(fù)雜的神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)機(jī)制將血糖保持在一個(gè)恒定的水平。低血糖作為一種急性代謝應(yīng)激，可誘導(dǎo)多種神經(jīng)內(nèi)分泌反應(yīng)，包括刺激交感神經(jīng)腎上腺系統(tǒng)和下丘腦-垂體-腎上腺軸以及抑制促性腺軸［1］。以往的研究已經(jīng)證實(shí)了低血糖可以導(dǎo)致血清泌乳素［2］、皮質(zhì)醇和促腎上腺皮質(zhì)激素濃度增加，黃體生成素和促性腺激素釋放激素濃度下降［3］，但低血糖應(yīng)激對下丘腦-垂體-甲狀腺 （hypothalamus-pituitary-thyroid，HPT） 軸分泌活動的影響被人們忽視。本研究的目的是通過建立低血糖大鼠模型，分析血清游離三碘甲狀腺原氨酸 （free triiodothyronine，F(xiàn)T3） 、游離甲狀腺素 （free throxine，F(xiàn)T4） 、總甲狀腺素 （total thyroxine，TT4） 、促甲狀腺激素 （thyroid-stimulating hormone，TSH） 及垂體促甲狀腺激素β亞基 （thyroid-stimulating hormone β subunit，TSHβ） 蛋白和mRNA在低血糖應(yīng)激后的動態(tài)變化，探討低血糖應(yīng)激對大鼠HPT軸的影響，為下一步研究應(yīng)激對腦內(nèi)神經(jīng)內(nèi)分泌的影響提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

選取37只體質(zhì)量280～320 g、8周齡SPF級Sprague Dawley雄性大鼠（ 購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司） ，隨機(jī)分成5組。0 min組（ n = 8） ：對照組，只進(jìn)行置管術(shù)而不行鉗夾試驗(yàn)；15 min組（ n = 7） 、30 min組（ n = 7） 、60 min組（ n = 7） 、90 min組（ n = 8） ：大鼠分別持續(xù)低血糖15、30、60、90 min后心臟采血，斷頭法處死大鼠，迅速分離并取出垂體組織，于-80℃凍存。

1.2 方法

1.2.1 血中激素測定：采用ELISA法檢測血清FT3、FT4、TT4及TSH。

1.2.2 垂體TSHβ mRNA表達(dá)檢測：采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR。參照Trizol試劑說明抽提Sprague Dawley大鼠垂體總RNA，組織勻漿，兩相分離，提取的RNA經(jīng)沉淀、洗滌、溶解，并進(jìn)行純度鑒定。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent kit（ 日本TaKaRa公司）的說明書，將抽提的總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析大鼠垂體組織中TSHβ mRNA表達(dá)水平。根據(jù)美國NCBI數(shù)據(jù)庫的基因序列信息，在GenBank中找到相應(yīng)基因序列，應(yīng)用引物設(shè)計(jì)軟件Primer 5.0分別設(shè)計(jì)出TSHβ和GAPDH基因的引物，由日本TaKaRa公司設(shè)計(jì)合成并純化。應(yīng)用LightCycler 480 Rotor-Gene Real-Time Analysis Software 6.0.，選擇“Advanced Relative Quantification”分析路徑對目的基因mRNA表達(dá)的差異進(jìn)行分析。

1.2.3 垂體TSHβ蛋白表達(dá)檢測：采用Western blotting。蛋白裂解液裂解垂體組織，離心15 min（ 12 000 g，4 ℃） ，取上清液行蛋白定量?？偟鞍捉?jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，50 V轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶中封閉5 h，一抗孵育過夜。于TBST溶液中洗膜后，置于二抗溶液中孵育2 h。采用DAB顯色試劑盒顯影并檢測。以β-actin作為內(nèi)對照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 低血糖應(yīng)激后血清FT3水平

低血糖應(yīng)激后15 min組和30 min組血清FT3升高，與0 min組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P ＜ 0.05） ；60 min組血清FT3下降，較30 min組顯著降低（ P ＜ 0.05） ；90 min組血清FT3測量值低于檢測范圍下限，以最小值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，較15 min組、30 min組顯著降低（P ＜ 0.05） 。見表1。

2.2 低血糖應(yīng)激后血清FT4水平

低血糖應(yīng)激后，15 min組血清FT4升高，與0 min組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P ＜ 0.05） ；30 min組、60 min組血清FT4輕度降低（ P ＞ 0.05） ；90 min組血清FT4較15 min組、30 min組、60 min組均顯著降低（ P ＜0.05） ，較0 min組輕度降低（ P ＞ 0.05） 。見表1。

2.3 低血糖應(yīng)激后血清TT4水平

低血糖應(yīng)激后，15 min組、30 min組、60 min組血清TT4升高，與0 min組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P ＜0.05） ，15 min組、30 min組、60 min組間比較血清TT4差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P ＞ 0.05） ；90 min組血清TT4較15 min組、30 min組、60 min組均顯著降低（ P ＜ 0.05） ，較0 min組輕度降低（ P ＞ 0.05） 。見表1。

2.4 低血糖應(yīng)激后血清TSH

60 min組血清TSH較0 min組、15 min組顯著升高（ P ＜ 0.05） ；90 min組血清TSH下降，較0 min組、15 min組、30 min組、60 min組輕度降低（ P ＞ 0.05） ；其余各組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P ＞ 0.05） 。見表1。

2.5 大鼠垂體TSHβ mRNA表達(dá)水平

低血糖應(yīng)激后，15 min組垂體TSHβ mRNA表達(dá)水平升高，與0 min組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05） ；其余各組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P ＞0.05） 。見表1。

2.6 大鼠垂體TSHβ蛋白表達(dá)水平

低血糖應(yīng)激后，15 min組及30 min組垂體TSHβ蛋白均較0 min組顯著增加（ P ＜ 0.05） ；60 min組、90min組垂體TSHβ蛋白表達(dá)水平較30 min組顯著減少（P ＜ 0.05） 。見表1、圖1。

表1 低血糖應(yīng)激后血清FT3、FT4、TT4、TSH 及垂體TSHβ mRNA及蛋白表達(dá)水平的變化Tab.1 Changes in the serum levels of FT3，F(xiàn)T4，TT4，and TSH，and the mRNA and protein expressions of TSHβ in the pituitary gland after hypoglycemic stress

圖1 Western blotting檢測垂體TSHβ蛋白表達(dá)Fig.1 Expression of TSHβ protein in the pituitary gland detected by Western blotting

3 討論

嚴(yán)重的低血糖可以改變大腦結(jié)構(gòu)并導(dǎo)致腦損傷［4］、認(rèn)知功能障礙［5］甚至猝死［6］。機(jī)體通過強(qiáng)大的反調(diào)節(jié)機(jī)制快速增加血糖水平，從而保護(hù)身體免受低血糖的危害。在絕對或相對高胰島素血癥的情況下，當(dāng)葡萄糖水平降至80 mg/dL以下時(shí)，負(fù)反饋調(diào)節(jié)被激活［7］。低血糖的負(fù)反饋調(diào)節(jié)包括抑制內(nèi)源性胰島素分泌并增加胰高血糖素、兒茶酚胺 （腎上腺素、去甲腎上腺素） 、皮質(zhì)醇和生長激素的分泌［8］，它們一起通過刺激肝葡萄糖產(chǎn)生和限制外周組織對血糖利用來增加血漿葡萄糖水平。低血糖時(shí)，大腦通過位于幾個(gè)腦區(qū)域 （如下丘腦腹內(nèi)側(cè)核、下丘腦外側(cè)的垂直區(qū)域、弧束核） 以及若干后腦區(qū)域中的葡萄糖傳感神經(jīng)元來感知腦內(nèi)葡萄糖水平［9］。

甲狀腺激素具有設(shè)定基礎(chǔ)代謝率的能力，在饑餓期間抑制甲狀腺激素會降低代謝率并保存能量儲存，并通過快速抑制T4和T3水平來保存能量儲存［10］。在禁食大鼠中，垂體Ⅱ型脫碘酶水平和肝臟Ⅰ型脫碘酶水平減少，并與從肝臟勻漿中分離出的外周T3減少相關(guān)［11］。盡管垂體和肝臟T3減少，但下丘腦Ⅱ型脫碘酶活性實(shí)際上隨空腹增加而增加，導(dǎo)致來自弓形核的神經(jīng)肽Y和刺鼠相關(guān)蛋白增加。因此，盡管禁食相關(guān)的外周甲狀腺激素水平降低，但在禁食期間下丘腦內(nèi)T3局部升高仍然存在，導(dǎo)致食欲信號顯著增加，這反過來又作用于室旁核以減少促甲狀腺激素釋放激素 （thyrotropin-releasing hormone，TRH） 的產(chǎn)生。這被認(rèn)為是盡管血清T4濃度降低，但血清TSH水平仍基本正常的機(jī)制［12］。SCHULTES等［13］的研究發(fā)現(xiàn)3.2 mmol/L水平的低血糖可以急劇降低垂體TSH釋放，而不會伴隨FT3和FT4水平的變化。后者可能是由這些甲狀腺激素的半衰期長所致。血漿葡萄糖水平低于3.0 mmol/L時(shí)，F(xiàn)T3濃度降低。此外，低血糖應(yīng)激對垂體-甲狀腺軸的分泌活性具有延長的抑制作用。維持較長持續(xù)時(shí)間的較低血漿葡萄糖水平 （＜3.0 mmol/L），可引起血清FT3濃度和FT3/FT4比率的降低。這表明，低血糖除了通過減少T4向T3的轉(zhuǎn)化而對其中樞即垂體和（或）下丘腦部位的抑制性影響外，還會急劇影響外周甲狀腺激素代謝。

本研究發(fā)現(xiàn)低血糖應(yīng)激15 min后血清FT3升高，30 min左右可升至高峰，低血糖持續(xù)60 min后血清FT3下降，90 min組血清FT3低于0 min組。血清FT4在低血糖應(yīng)激15 min后升高，持續(xù)低血糖30 min后血清FT4降低，60 min時(shí)血清FT4繼續(xù)降低，90 min時(shí)血清FT4降低至0 min組水平。低血糖應(yīng)激15 min后血清TT4升高，低血糖持續(xù)30 min組血清TT4繼續(xù)升高；60 min組血清TT4達(dá)最高值；90 min組血清TT4顯著降低。低血糖應(yīng)激30 min后血清TSH升高，60 min后血清TSH達(dá)最高值；之后血清TSH下降。低血糖應(yīng)激15 min后垂體TSHβ mRNA表達(dá)水平升高。30 min后TSHβ蛋白表達(dá)升至最高，60 min后垂體TSHβ蛋白表達(dá)顯著減少，90 min后垂體TSHβ蛋白表達(dá)繼續(xù)減少，基本接近0 min組水平。本研究認(rèn)為，在低血糖應(yīng)激的初始階段，低血糖能夠興奮HPT軸；而隨著時(shí)間的延長，HPT軸逐漸被抑制。低血糖應(yīng)激對HPT軸有抑制作用，但低血糖應(yīng)激初始階段甲狀腺激素水平的變化仍有待進(jìn)一步研究。既往的研究表明，溫和的壓力源可能會引起外周甲狀腺激素水平輕微增加或沒有變化，而更嚴(yán)重的壓力源會導(dǎo)致甲狀腺激素水平下降。這表明甲狀腺激素的變化可能會對刺激的感知嚴(yán)重程度進(jìn)行“分級”［14］。這可能解釋了本研究中在低血糖應(yīng)激的初始階段，HPT軸表現(xiàn)為被刺激。

本研究探討了低血糖應(yīng)激后血清FT3、FT4、TT4、TSH水平及垂體組織TSHβ mRNA表達(dá)，但對下丘腦TRH的水平仍需要進(jìn)一步研究。在以往的研究［15］中，起源于下丘腦室旁核的TRH神經(jīng)元亞群將其軸突末端投射到緊鄰垂體-門脈系統(tǒng)的毛細(xì)血管的正中隆起。TRH神經(jīng)元在這些毛細(xì)血管中釋放的TRH刺激垂體TSH的生物合成和分泌［10］。TRH神經(jīng)元可從含有α促黑素細(xì)胞激素的下丘腦弓狀核中的2個(gè)單獨(dú)的瘦素反應(yīng)神經(jīng)元群接受直接單突觸投射，合成可卡因和安非他明調(diào)控的轉(zhuǎn)錄物及神經(jīng)肽Y和刺激相關(guān)蛋白［13］。在人和嚙齒類動物中進(jìn)行的幾項(xiàng)研究［16］顯示，禁食期間HPT軸被抑制，可能是由降低的血清瘦素濃度影響TRH神經(jīng)元合成神經(jīng)肽Y所介導(dǎo)的。

綜上所述，低血糖應(yīng)激可影響HPT軸，但其具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究和完善。這對指導(dǎo)低血糖的治療、減少低血糖對患者的危害、降低發(fā)病率與死亡率具有重要意義。