朱玉霞 高愛琴 張鐵鷹 劉俊麗 劉欣彤 張志鵬 廖朝勇

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，呼和浩特010018)

我國(guó)是玉米種植大國(guó)，每年玉米秸稈產(chǎn)量巨大，2017年玉米秸稈產(chǎn)量達(dá)9億萬(wàn)t[1]。因缺乏切實(shí)可行的處理與利用技術(shù)，焚燒玉米秸稈現(xiàn)象嚴(yán)重，年焚燒量超過(guò)2億t[2]，造成資源浪費(fèi)和嚴(yán)重的環(huán)境污染。玉米秸稈蘊(yùn)藏能值豐富，若經(jīng)科學(xué)處理，可作為能量飼料資源的補(bǔ)充。利用微生物產(chǎn)生的多種纖維分解酶對(duì)玉米秸稈進(jìn)行轉(zhuǎn)化利用是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)方向[3]。

絲狀真菌(黑曲霉、木霉和白腐霉)被認(rèn)為可產(chǎn)生較全的纖維素酶系和部分半纖維素酶系[4]，也是分解秸稈纖維成分的理想菌株?？凳夏久故巧锝到庥衩捉斩挼某Ｓ镁?，可高效降解玉米秸稈中的纖維成分。常娟[5]在玉米秸稈中接種康氏木霉，發(fā)現(xiàn)康氏木霉可顯著降低玉米秸稈中纖維素和半纖維素含量。史國(guó)翠[6]篩選出分解纖維素能力強(qiáng)的菌種為康氏木霉，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，其對(duì)牛瘤胃中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、纖維素、半纖維素降解率增大。玉米秸稈含多種復(fù)雜的化學(xué)鍵，水解需要多種酶配合協(xié)同完成，康氏木霉不僅有分泌纖維素酶的能力，還有分泌大量木聚糖酶的能力，這對(duì)高效水解玉米秸稈具有重要意義。李慧君[7]研究發(fā)現(xiàn)，康氏木霉產(chǎn)纖維素酶和木聚糖酶的最大活性均對(duì)其降解玉米秸稈的能力影響較大。馮波[8]在試驗(yàn)中篩選出1株產(chǎn)木聚糖酶活性能力較高的菌株——康氏木霉。由此可見，纖維分解酶種類與活性對(duì)高效水解秸稈纖維成分影響較大，獲得酶譜全、活性高的菌株是生物處理玉米秸稈的關(guān)鍵。

玉米秸稈化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，微生物纖維分解酶往往需要非酶蛋白因子(解氫鍵酶[9]、溶多糖單加氧酶[10]、溶脹素[11])共同參與才能高效水解纖維素。與基因工程菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生的單一酶種相比，野生菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生的多酶復(fù)合體系更適合于秸稈水解處理，其不僅酶譜豐富，且可產(chǎn)生多種輔助因子，更有利于打開復(fù)雜的纖維結(jié)構(gòu)。但野生菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生的酶活性低、成本高，限制了其在水解處理作物秸稈中的應(yīng)用。因而，提高野生菌產(chǎn)酶能力和生長(zhǎng)速度是秸稈生物酶解處理技術(shù)的關(guān)鍵[6]。誘變篩選是提高微生物產(chǎn)酶能力和降低酶制劑成本的常用方法。紫外、化學(xué)誘變因效果好、操作簡(jiǎn)單、條件和設(shè)備要求較低，現(xiàn)已成為快速突變各類微生物基因組的有效方法。例如在木霉的選育中，Ike等[12]利用紫外線誘變方法篩選出2株高產(chǎn)纖維素酶木霉菌株。Li等[13]以綠色木霉為原始菌株，經(jīng)紫外線和微波誘變處理后，獲得7株高產(chǎn)突變菌。李敏霞[14]對(duì)綠色木霉進(jìn)行紫外、硫酸二乙酯和亞硝酸鈉復(fù)合誘變后，篩選得到高產(chǎn)突變菌。綜上所述，復(fù)合誘變作為一種高效生物突變手段，在菌種改良領(lǐng)域?qū)⒕哂辛己玫膽?yīng)用前景。因此，本文擬采用紫外、化學(xué)和紫外+化學(xué)復(fù)合誘變方法，對(duì)康氏木霉進(jìn)行誘變，以微晶纖維素為唯一碳源，篩選生長(zhǎng)快、產(chǎn)酶能力高的突變菌。通過(guò)對(duì)突變菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶條件的優(yōu)化，以期獲得高產(chǎn)纖維分解酶菌株及其其固態(tài)發(fā)酵工藝參數(shù)，為玉米秸稈高效生物轉(zhuǎn)化提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 原菌菌種

試驗(yàn)用原菌菌種為康氏木霉13006，由中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心提供。

1.2 培養(yǎng)基

傳代培養(yǎng)基：玉米秸稈粉5 g(沸水洗至無(wú)色，過(guò)200目篩)，硫酸銨1.65 g，磷酸氫二鉀(K2HPO4)0.5 g，七水合硫酸鎂(MgSO4·7H2O) 0.25 g，瓊脂18～20 g，自然pH，用蒸餾水定容至1 L。

微晶纖維素剛果紅培養(yǎng)基：微晶纖維素5 g，硫酸銨1.65 g，剛果紅0.3 g，K2HPO40.5 g，脫氧膽酸鈉0.2%，MgSO4·7H2O 0.25 g，瓊脂18～20 g，自然pH，用蒸餾水定容至1 L。

固體發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基：玉米秸稈(過(guò)2 mm篩)7.0 g，麩皮3.0 g，硫酸銨2%，料水比1.0∶2.2，自然pH。

1.3 孢子懸液制備

孢子懸液制備：將木霉孢子懸液2.5 mL(107個(gè)/mL)接入50 mL的限量培養(yǎng)液(葡萄糖0.1%,硫酸銨0.05%)中，30 ℃，150 r/min培養(yǎng)，記錄孢子萌動(dòng)過(guò)程，以萌動(dòng)率20%～30%為最佳萌動(dòng)時(shí)間。

1.4 康氏木霉紫外、化學(xué)和復(fù)合誘變

將康氏木霉孢子液稀釋為40個(gè)孢子菌懸液進(jìn)行紫外誘變(暗室中紫外誘變儀，預(yù)熱30 min，并吸取10 mL至直徑為6 cm無(wú)菌培養(yǎng)皿中，放入紫外誘變儀。選擇365 nm紫外線波長(zhǎng)，并不斷攪拌，照射時(shí)間分別為8、11、14、17、20、23 min。為防止回復(fù)，紫外線誘變后的操作均在紅燈下進(jìn)行)或化學(xué)誘變(取3.5 mL孢子懸液備用，將1 mL的硫酸二乙酯與0.5 mL的無(wú)水乙醇混合均勻后加入到制備好的孢子懸液中。誘變時(shí)間分別為10、20、30、40、50、60 min后加入0.5 mL 25%硫代硫酸鈉(Na2S2O3)以終止反應(yīng)，以加無(wú)菌水處理的作空白對(duì)照)，吸取不同誘變時(shí)間菌液均勻涂布微晶纖維素剛果紅培養(yǎng)基上，30 ℃恒溫培養(yǎng)36 h，菌落計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)誘變前后的變化，計(jì)算致死率。

突變菌交叉復(fù)合誘變：將第1輪突變菌交叉再進(jìn)行紫外和化學(xué)誘變，操作步驟同上述一致。

1.5 最優(yōu)突變菌篩選

以原菌康氏木霉13006在微晶纖維素剛果紅培養(yǎng)基上所產(chǎn)透明圈菌落大小為對(duì)照，挑選平板上突變菌長(zhǎng)得快、菌絲短、產(chǎn)孢子晚、透明圈大的菌落。用0.9%的生理鹽水洗下，然后涂到傳代培養(yǎng)基上，培養(yǎng)4～6 d長(zhǎng)出單菌落后收集保藏，接種至固體發(fā)酵培養(yǎng)基上進(jìn)行發(fā)酵，測(cè)定其纖維素酶(NY/T 912—2004)、木聚糖酶(GB/T 23874—2009)和濾紙酶(GB/T 23881—2009)活性，比較其酶活性大小以確定高產(chǎn)纖維分解菌株。

1.6 突變菌產(chǎn)酶發(fā)酵條件優(yōu)化

1.6.1 單因素試驗(yàn)

以基礎(chǔ)培養(yǎng)基為基準(zhǔn)，30 ℃恒溫培養(yǎng)，依次對(duì)發(fā)酵時(shí)間(48、60、66、72、78、84、90、96、102、108、114、120 h)、硫酸銨濃度(0、1%、2%、3%、4%、5%、6%)、磷酸二氫鉀濃度(0、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%)及孢子(107個(gè)/mL)接種量(0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4 mL)進(jìn)行單因素試驗(yàn)，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。測(cè)定不同發(fā)酵條件下突變菌康氏木霉UH-1產(chǎn)纖維素酶、木聚糖酶、濾紙酶活性，確定這些因素對(duì)突變菌康氏木霉UH-1產(chǎn)酶的影響，并獲得最佳產(chǎn)酶條件。

1.6.2 正交試驗(yàn)

根據(jù)對(duì)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，即選擇單因素試驗(yàn)中對(duì)產(chǎn)酶影響比較大的4個(gè)因素，每個(gè)因素設(shè)3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，從而確定康氏木霉UH-1產(chǎn)木聚糖酶、纖維素酶、濾紙酶的最優(yōu)固體發(fā)酵條件組合。將試驗(yàn)菌株接種于最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基中，在最優(yōu)發(fā)酵條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)定發(fā)酵產(chǎn)物幾種酶的活性，并與原菌康氏木霉13006進(jìn)行比較。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

運(yùn)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析和差異顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 康氏木霉紫外、化學(xué)誘變與突變菌篩選

將康氏木霉孢子萌發(fā)20 h后(萌發(fā)率為20%)進(jìn)行紫外、化學(xué)誘變，最佳紫外照射時(shí)間為10 min(致死率為80%)，最佳化學(xué)誘變時(shí)間為30 min(致死率為80%)。經(jīng)多輪紫外、化學(xué)誘變，挑選出(微晶纖維素剛果紅培養(yǎng)基，培養(yǎng)7 d)各輪誘變菌透明圈直徑/菌落直徑較大的初篩突變菌。初篩突變菌經(jīng)固態(tài)發(fā)酵進(jìn)行復(fù)篩，突變菌康氏木霉13006產(chǎn)酶能力見表1。由表可知，通過(guò)突變菌菌落大小比較，獲得2個(gè)突變菌，經(jīng)固態(tài)發(fā)酵復(fù)篩發(fā)現(xiàn)，突變菌康氏木霉U11-2的濾紙酶、纖維素酶和木聚糖酶活性較原菌康氏木霉13006均有所提高(P>0.05)。這說(shuō)明單一手段誘變康氏木霉13006無(wú)法獲得較優(yōu)突變菌。鑒于康氏木霉U11-2產(chǎn)酶能力有提高趨勢(shì)，將其作為下輪交叉復(fù)合誘變的出發(fā)菌。

表1 康氏木霉13006突變菌產(chǎn)酶能力

同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同或無(wú)字母表示差異不顯著(P>0.05)。表2～表7同。

In the same column, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as Table 2 to Table 7.

U：紫外誘變；H：化學(xué)誘變。下表同。

U: ultraviole mutagenesis; H: chemical mutagenesis. The same as below.

2.2 康氏木霉U11-2交叉誘變與突變菌篩選

康氏木霉U11-2在紫外(20 min)和化學(xué)(30 min)最佳誘變條件下，經(jīng)多輪紫外、化學(xué)交叉誘變，各輪誘變菌株產(chǎn)透明圈(微晶纖維素剛果紅培養(yǎng)基，培養(yǎng)7 d)和發(fā)酵產(chǎn)酶，康氏木霉U11-2突變菌產(chǎn)酶能力見表2。由表可知，各突變菌(康氏木霉U11-2、康氏木霉UH30-2、康氏木霉UH-1)的木聚糖酶和纖維素酶活性較原菌康氏木霉13006均顯著提高(P<0.05)，濾紙酶活性也有所提高(P>0.05)。

由圖1可見，突變菌康氏木霉UH-1發(fā)酵樣品較原菌康氏木霉13006顏色明顯變深，說(shuō)明菌株發(fā)生了突變，這說(shuō)明交叉復(fù)合誘變是康氏木霉較為適宜的誘變手段。鑒于突變菌康氏木霉UH-1發(fā)酵產(chǎn)酶綜合能力較強(qiáng)，將其作為后續(xù)研究的出發(fā)菌。

表2 康氏木霉U11-2突變菌產(chǎn)酶能力

圖1 康氏木霉原菌和突變菌發(fā)酵樣品顏色變化

2.3 突變菌康氏木霉UH-1產(chǎn)酶發(fā)酵條件優(yōu)化

2.3.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)康氏木霉UH-1產(chǎn)酶能力的影響

由表3可知，發(fā)酵時(shí)間對(duì)康氏木霉UH-1產(chǎn)酶能力的影響較大，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，濾紙酶、纖維素酶和木聚糖酶活性呈升高-降低-升高的變化趨勢(shì)，并均于84 h時(shí)達(dá)到峰值，隨后濾紙酶活性呈降低趨勢(shì)，木聚糖酶和纖維素酶活性呈現(xiàn)無(wú)規(guī)律變化。由于發(fā)酵時(shí)間越短，對(duì)降低生產(chǎn)成本較為有利，因此將康氏木霉UH-1最佳發(fā)酵時(shí)間定為84 h。

2.3.2 硫酸銨濃度對(duì)康氏木霉UH-1產(chǎn)酶能力的影響

由表4可知，濾紙酶和纖維素酶活性在硫酸銨濃度為6%時(shí)最高，顯著高于硫酸銨濃度為0、1%、2%時(shí)(P<0.05)，硫酸銨濃度為2%時(shí)顯著高于硫酸銨濃度為0、1%時(shí)(P<0.05)。木聚糖酶活性在硫酸銨濃度為2%時(shí)最高，顯著高于其他硫酸銨濃度(P<0.05)。因此，綜合考慮硫酸銨硫酸銨對(duì)纖維素酶、木聚糖酶和濾紙酶活性的影響，康氏木霉UH-1產(chǎn)酶的最佳硫酸銨濃度定為2%。

表3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)康氏木霉UH-1產(chǎn)酶能力的影響

表4 硫酸銨濃度對(duì)康氏木霉UH-1產(chǎn)酶能力的影響

2.3.3 磷酸二氫鉀濃度對(duì)康氏木霉UH-1產(chǎn)酶能力的影響

由表5可知，磷酸二氫鉀濃度對(duì)濾紙酶、纖維素酶、木聚糖酶活性均無(wú)顯著影響(P>0.05)，且磷酸氫二鉀濃度為1%時(shí)各個(gè)酶活性相對(duì)較高，綜合考慮成本，因此康氏木霉UH-1產(chǎn)酶的最佳磷酸二氫鉀濃度定為1%。

表5 磷酸二氫鉀濃度對(duì)康氏木霉UH-1產(chǎn)酶能力的影響

2.3.4 接種量對(duì)康氏木霉UH-1產(chǎn)酶能力的影響

由表6可知，濾紙酶活性在接種量為1.2 mL時(shí)最高，顯著高于接種量為0.8、1.1、1.4 mL時(shí)(P<0.05)。纖維素酶活性在接種量為1.0 mL時(shí)最高，顯著高于接接種量為1.3 mL時(shí)(P<0.05)。木聚糖酶活性在接種量為1.3 mL時(shí)最高，顯著高于接接種量為0.9 mL時(shí)(P<0.05)。綜合考慮，康氏木霉UH-1產(chǎn)酶的最佳接種量定為1.0 mL。

表6 接種量對(duì)康氏木霉UH-1產(chǎn)酶能力的影響

2.3.5 培養(yǎng)基含水量對(duì)康氏木霉UH-1產(chǎn)酶能力的影響

由表6可知，培養(yǎng)基含水量對(duì)康氏木霉UH-1的產(chǎn)酶能力無(wú)顯著影響(P>0.05)。綜合考慮，康氏木霉UH-1產(chǎn)酶的最佳培養(yǎng)基含水量定為67%。

表7 培養(yǎng)基含水量對(duì)康氏木霉UH-1產(chǎn)酶能力的影響

2.3.6 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，選擇對(duì)康氏木霉UH-1固體發(fā)酵產(chǎn)酶能力影響較大的4個(gè)因素(發(fā)酵時(shí)間、硫酸銨濃度、接種量、培養(yǎng)基含水量)進(jìn)行L9(34)的正交試驗(yàn)。由表8可知，影響濾紙酶活性的主要因素依次為硫酸銨濃度>培養(yǎng)基含水量>發(fā)酵時(shí)間>接種量，其最優(yōu)發(fā)酵條件為硫酸銨濃度3%、培養(yǎng)基含水量67%、發(fā)酵時(shí)間78 h、接種量1.2 mL。影響纖維素酶活性的主要因素依次為硫酸銨濃度>發(fā)酵時(shí)間>接種量>培養(yǎng)基含水量，其最優(yōu)發(fā)酵條件為硫酸銨濃度4%、發(fā)酵時(shí)間90 h、接種量1.0 mL、培養(yǎng)基含水量68%。影響木聚糖酶活性的主要因素依次為硫酸銨濃度>接種量>培養(yǎng)基含水量>發(fā)酵時(shí)間，其最優(yōu)發(fā)酵條件為硫酸銨濃度2%、接種量1.1 mL、培養(yǎng)基含水量67%、發(fā)酵時(shí)間84 h。

表8 正交試驗(yàn)結(jié)果

續(xù)表8項(xiàng)目Items因素 Factors發(fā)酵時(shí)間Fermentation time/h硫酸銨濃度(NH4)2SO4concentration/%接種量Inoculation quantity/mL 培養(yǎng)基含水量Culture medium moisture/%濾紙酶Filter paper enzyme 纖維素酶Cellulase 木聚糖酶Xylanase K3(2)90.03791.29086.77086.683R(2)4.0709.5773.9962.697K1(3)681.657879.277674.313728.537K2(3)713.003640.643756.250690.453K3(3)711.603586.343675.700687.273R(3)31.346292.93481.93741.264

K1、K2、K3分別為各因素在1、2、3水平時(shí)產(chǎn)酶量；R為極差；(1)為濾紙酶活性；(2)為纖維素酶活性；(3)為木聚糖酶活性。

K1, K2 and K3 were the enzyme production when the factors at 1, 2 and 3 levels, respectively; R was the range; (1) was the filter paper enzyme activity; (2) was the cellulase activity; (3) was the xylanase activity.

2.3.7 正交試驗(yàn)驗(yàn)證

在上述正交試驗(yàn)優(yōu)化條件下，對(duì)原菌康氏木霉13006和誘變菌康氏木霉UH-1固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶、木聚糖酶和濾紙酶活性的最適發(fā)酵條件進(jìn)行驗(yàn)證。由表9可知，康氏木霉UH-1產(chǎn)濾紙酶與木聚糖酶的最優(yōu)條件為硫酸銨濃度2%、接種量1.1 mL、培養(yǎng)基含水量67%、發(fā)酵時(shí)間84 h，活性分別可以達(dá)到0.86和1 150.32 U/g。康氏木霉UH-1產(chǎn)纖維素酶的最優(yōu)條件為硫酸銨濃度4%、發(fā)酵時(shí)間90 h、接種量1.0 mL、培養(yǎng)基含水量68%，活性可以達(dá)到103.99 U/g?？凳夏久?3006纖維素酶、木聚糖酶和濾紙酶活性最高可以達(dá)到53.17、812.78和0.30 U/g，康氏木霉UH-1較其酶活性均有所提高。

表9 正交試驗(yàn)驗(yàn)證

3 討 論

玉米秸稈化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，很難被動(dòng)物高效利用。利用微生物產(chǎn)生的多種纖維分解酶將玉米秸稈轉(zhuǎn)化為易于動(dòng)物消化吸收形式的飼料資源是當(dāng)前秸稈綜合利用的研究熱點(diǎn)。通過(guò)誘變和基因改造獲得高產(chǎn)酶能力的優(yōu)良菌株是生物酶解處理秸稈的關(guān)鍵。因霉菌的成熟分生孢子處于休眠狀態(tài)，萌發(fā)孢子可改善誘變育種的效果[15-17]。劉春芬[18]試驗(yàn)表明，利用萌發(fā)的孢子進(jìn)行誘變可提高菌株正突變率。因此本試驗(yàn)對(duì)康氏木霉孢子進(jìn)行萌發(fā)處理，當(dāng)孢子萌發(fā)率達(dá)到20%時(shí)進(jìn)行誘變處理，并獲得了較高的突變率。本文通過(guò)對(duì)康氏木霉13006進(jìn)行紫外、硫酸二乙酯、紫外-硫酸二乙酯復(fù)合誘變獲得了產(chǎn)酶能力較強(qiáng)的突變菌康氏木霉UH-11。獲得的突變菌康氏木霉UH-1木聚糖酶活性較原菌康氏木霉13006提高了42.7%，纖維素酶活性提高了78.5%。這可能與單一誘變方法突變點(diǎn)單一、突變幾率小、不穩(wěn)定和菌株易對(duì)單一誘變劑發(fā)生抗性有關(guān)，因此復(fù)合誘變可能是絲狀真菌更為有效的誘變方式。

在誘變育種過(guò)程中如何快速高效篩選出優(yōu)良的突變菌十分關(guān)鍵。本研究采用透明圈和固態(tài)發(fā)酵酶活性測(cè)定對(duì)突變菌進(jìn)行初篩與復(fù)篩。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雖然菌株產(chǎn)酶高低和透明圈與菌落直徑比值間存在有一定關(guān)聯(lián)，但也并非比值越大的突變菌酶活性就越高。因絲狀真菌在天然作物秸稈平板培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較快，且透明圈不明顯，難以用來(lái)篩選突變菌。在本試驗(yàn)中采用微晶纖維素平板篩選突變菌，雖具有一定代表性，僅展示出菌株對(duì)微晶纖維素的分解能力，不能代表其對(duì)秸稈的降解能力。同時(shí)，康氏木霉固態(tài)發(fā)酵可以產(chǎn)生多種酶系，包括纖維素酶、木聚糖酶、濾紙酶、外切葡聚糖酶活、β-木聚苷酶活、β-葡萄糖苷酶，這些酶在秸稈的降解過(guò)程中發(fā)揮著不同作用。因此，發(fā)酵酶活性測(cè)定是突變菌篩選的必要手段。但酶活性測(cè)定耗時(shí)費(fèi)力，如何建立一種可快速篩選高效降解作物秸稈絲狀菌株的方法尚需要進(jìn)一步研究。

氮是微生物細(xì)胞重要營(yíng)養(yǎng)素，也是菌體合成酶蛋白的關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)素。微生物不僅可利用有機(jī)氮，還可大量利用非蛋白氮。因硫酸銨等無(wú)機(jī)氮價(jià)格低廉，常作為微生物發(fā)酵的主要氮源[17-20]。孫君社等[21]研究康氏木霉產(chǎn)纖維素酶發(fā)酵條件時(shí)，適宜的硫酸銨濃度為2%，發(fā)酵時(shí)間為84 h，這與本試驗(yàn)研究結(jié)果一致。磷是微生物生長(zhǎng)所必不可少礦物元素。菌體代謝培養(yǎng)基中碳源會(huì)產(chǎn)生大量的酸，導(dǎo)致發(fā)酵pH下降，從而影響菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶能力。在固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中加入一定量磷酸鹽不僅能起緩沖作用，還可促進(jìn)微生物生長(zhǎng)和代謝。謝夏陽(yáng)[20]和王實(shí)玉[22]在研究康氏木酶產(chǎn)纖維素酶條件時(shí)確定適宜的磷酸二氫鉀濃度為0.1%，與本試驗(yàn)研究結(jié)果不一致，可能與菌株發(fā)酵培養(yǎng)基碳源組成有關(guān)。

在絲狀真菌的固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中不能進(jìn)行養(yǎng)分補(bǔ)充，接種量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶量影響至關(guān)重要。孫斐等[23]確定擬康氏木霉適宜接種量為10%，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。培養(yǎng)基含水量過(guò)低會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)基表面干燥進(jìn)而影響菌種的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶能力，培養(yǎng)基含水量過(guò)高會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)基通氣孔阻塞，供氧不足，從而抑制菌體生長(zhǎng)。孫斐等[23]確定擬康氏木霉適宜含水量為55%～60%，與本試驗(yàn)結(jié)果(培養(yǎng)基含水量為67%)不一致。由試驗(yàn)可知，含水量對(duì)于菌種發(fā)酵產(chǎn)酶能力影響不大，這可能與本試驗(yàn)中起始含水高有關(guān)；其以玉米芯和麩皮為碳源，而本試驗(yàn)為玉米秸稈和麩皮。林元山[24]通過(guò)對(duì)康氏木霉AS3.2774發(fā)酵條件優(yōu)化表明稻草粉與麩皮培養(yǎng)基含水量為67%，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。因此，需要針對(duì)康氏木霉發(fā)酵培養(yǎng)基的組成來(lái)確定其適宜培養(yǎng)基含水量。

4 結(jié) 論

① 對(duì)康氏木霉13006進(jìn)行多輪紫外、化學(xué)和交叉復(fù)合誘變，獲得1株產(chǎn)纖維分解酶能力較強(qiáng)的突變菌康氏木霉UH-1，其木聚糖酶活性提高了42.7%，纖維素酶活性提高了78.5%。

② 優(yōu)化康氏木霉UH-1固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)條件，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為玉米秸稈∶麩皮為7∶3、硫酸銨濃度2%、接種量1.1 mL、含水量67%、發(fā)酵時(shí)間84 h。在此條件下，康氏木霉UH-1濾紙酶活性達(dá)到0.86 U/g，纖維素酶活性達(dá)到99.81 U/g，木聚糖酶活性達(dá)到1 150.32 U/g。