李晨燕 張 楊 肖定福 邢月騰 郁元年 吳 信 劉星亮 謝獻明 張 旭 曾勇波 張 彬*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南省畜禽安全生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心，長沙410128；2.中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，長沙410125；3.寧鄉(xiāng)市畜牧獸醫(yī)水產(chǎn)局，寧鄉(xiāng)410600)

隨著國家對畜牧業(yè)中使用抗生素的監(jiān)管愈來愈嚴(yán)，尋找對動物和人類有益無害的抗生素替代品已成為養(yǎng)殖業(yè)向前發(fā)展的根本所在。杜仲提取物(Eucommiaulmoidesoliver extracts,EUOE)因含有綠原酸、桃葉珊瑚甙和黃酮類化合物等多種活性成分[1-2]，具有抗菌、消炎和抗氧化等功能[3-5]，其在畜牧業(yè)中日益受到青睞。寧鄉(xiāng)豬是我國著名的偏肉脂型豬種，具有蓄脂力強、適應(yīng)性廣和肉質(zhì)鮮嫩等特點[6]。目前關(guān)于杜仲提取物改善瘦肉型豬生長性能、胴體性狀和肉品質(zhì)的研究很多[7-8]，但對肉脂型豬影響的研究較少，在寧鄉(xiāng)豬上更是鮮有報道。本試驗主要探索飼糧中添加杜仲提取物對寧鄉(xiāng)豬生長性能、血清生化指標(biāo)和肝臟脂肪代謝的影響，以期為杜仲提取物在地方豬上的科學(xué)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

杜仲提取物的主要成分為綠原酸(≥3.5%)、黃酮類化合物(≥20%)、桃葉珊瑚甙等。

1.2 試驗動物與試驗設(shè)計

試驗于湖南省流沙河花豬生態(tài)牧業(yè)有限公司寧鄉(xiāng)花豬生態(tài)養(yǎng)殖基地進行。采用單因素試驗設(shè)計，選擇同棟欄舍、同一批次、體重約43 kg的健康寧鄉(xiāng)閹母豬24頭，隨機分為2個組，每組4個重復(fù)，每個重復(fù)3頭豬。對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗組在基礎(chǔ)飼糧中添加1 500 mg/kg杜仲提取物?；A(chǔ)飼糧參照《豬飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 65—2004)中肉脂型豬營養(yǎng)需要，并結(jié)合《寧鄉(xiāng)豬飼養(yǎng)技術(shù)規(guī)程》(2009)進行配制，其組成及營養(yǎng)水平參見文獻[9]。每天飼喂3次(08:00、12:00和18:00)，消毒和免疫等按照公司常規(guī)程序進行。試驗期56 d。

1.3 樣品采集與檢測指標(biāo)

1.3.1 生長性能測定

試驗開始和結(jié)束時，測定各組豬的體重，統(tǒng)計每欄的總采食量，計算平均日采食量、平均日增重及料重比。

1.3.2 血清生化指標(biāo)測定

試驗結(jié)束時，每個重復(fù)挑選1頭豬進行前腔靜脈采血10 mL于離心管中，室溫靜置1 h后4 ℃、3 000 r/min離心10 min，收集血清分裝于1.5 mL無菌離心管中，-20 ℃保存。采用全自動生化分析儀(Beckman，美國)檢測血清葡萄糖(GLU)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)含量。

1.3.3 肝臟中長鏈脂肪酸含量測定

試驗結(jié)束時，禁食24 h，自由飲水，每個重復(fù)挑選1頭豬進行屠宰，取肝中葉于錫箔紙包好，放入液氮速凍后轉(zhuǎn)置于-80 ℃冰箱中保存。將肝臟樣品冷凍干燥后，稱0.5 g左右，經(jīng)苯石油醚提取、氫氧化鉀甲醇甲酯化后，進氣相色譜經(jīng)FID檢測器分析肝臟中長鏈脂肪酸含量，具體方法參照喻文娟等[10]外標(biāo)氣相-色譜-質(zhì)譜法進行?？傊竞康臏y定參照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪的測定》(GB 5009.6—2016)進行。

1.3.4 肝臟中脂肪代謝相關(guān)基因表達量測定

采用Trizol(Invitrogen公司，美國)提取肝臟組織中總RNA，取1 000 ng進行反轉(zhuǎn)錄(試劑盒購自TaKaRa公司)，具體操作方法按照說明書進行。利用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測肝臟中脂肪代謝相關(guān)基因的mRNA表達量，引物(序列見表1)由上海生物工程有限公司合成，以β-肌動蛋白(β-actin)為內(nèi)參基因，以過氧化物酶增殖體激活受體α(PPARα)、甘油三酯脂肪酶(ATGL)、乙酰輔酶A羧化酶(ACC)、肝X受體α(LXRα)和脂肪酸合成酶(FAS)為目的基因進行相對定量分析。

表1 引物序列

1.4 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2016初步整理后，用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件中的獨立樣本t檢驗進行各組間差異顯著性比較，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)”表示。P<0.05為差異顯著，0.05≤P<0.10為差異趨于顯著。

2 結(jié) 果

2.1 杜仲提取物對寧鄉(xiāng)豬生長性能的影響

由表2可知，與對照組相比，試驗組寧鄉(xiāng)豬的平均日增重略有增加，平均日采食量降低46.88 g/d，料重比降低2.74%，但差異均不顯著(P>0.05)。

表2 杜仲提取物對寧鄉(xiāng)豬生長性能的影響

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)相同或無字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

In the same row, values with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

2.2 杜仲提取物對寧鄉(xiāng)豬血清生化指標(biāo)的影響

由表3可知，與對照組相比，試驗組寧鄉(xiāng)豬的血清TG和HDL含量分別增加33.33%(0.05≤P<0.10)和20.29%(P<0.05)，血清LDL含量顯著降低13.21%(P<0.05)，血清GLU和TC含量有所降低，但無顯著差異(P>0.05)。

表3 杜仲提取物對寧鄉(xiāng)豬血清生化指標(biāo)的影響

2.3 杜仲提取物對寧鄉(xiāng)豬肝臟中長鏈脂肪酸含量的影響

由表4可知，與對照組相比，試驗組寧鄉(xiāng)豬肝臟中總脂肪含量雖有所提高，但差異不顯著(P>0.05)；肝臟單不飽和脂肪酸(MUFA)中的棕櫚烯酸含量增加19.64%(0.05≤P<0.10)；多不飽和脂肪酸(PUFA)中亞油酸含量降低10.71%(0.05≤P<0.10)。

2.4 杜仲提取物對寧鄉(xiāng)豬肝臟中脂肪代謝相關(guān)基因表達量的影響

由表5可知，與對照組相比，試驗組寧鄉(xiāng)豬肝臟中ATGL、ACC、LXRα和FAS的mRNA表達量分別顯著下調(diào)62.00%、76.00%、77.00%和82.00%(P<0.05)，PPARα的mRNA表達量則無顯著差異(P>0.05)。

表4 杜仲提取物對寧鄉(xiāng)豬肝臟中長鏈脂肪酸含量的影響

表5 杜仲提取物對寧鄉(xiāng)豬肝臟中脂肪代謝相關(guān)基因表達量的影響

3 討 論

3.1 杜仲提取物對寧鄉(xiāng)豬生長性能的影響

生長性能的高低直接決定育肥豬的產(chǎn)肉能力，影響?zhàn)B殖場的經(jīng)濟效益。杜仲提取物作為綠色添加劑，兼有藥理和生理功能，不但可以提高飼糧的養(yǎng)分利用率[11]，而且對腸道健康具有重要作用[12]。研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加杜仲葉或其提取物可使育肥豬的平均日增重顯著增加，料重比顯著降低[4,7]。也有報道顯示，飼糧中添加杜仲葉粉顯著降低生長肥育豬的平均日采食量和平均日增重[13]。本試驗中，與對照組相比，試驗組寧鄉(xiāng)豬的料重比降低，平均日增重有所增加，但差異不顯著，這可能是由于杜仲提取物中含有的綠原酸、黃酮類化合物等物質(zhì)會抑制肝臟腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的mRNA表達，京尼平能促進膽汁分泌[14]，也可能是由于試驗動物為育肥期寧鄉(xiāng)豬，其腸道發(fā)育已經(jīng)比較完善，因此未能顯著提高平均日采食量。

3.2 杜仲提取物對寧鄉(xiāng)豬血清生化指標(biāo)的影響

血清生化指標(biāo)的變化會影響動物機體的新陳代謝以及營養(yǎng)物質(zhì)的沉積，且受動物生長發(fā)育階段、內(nèi)分泌狀況和飼糧營養(yǎng)水平等因素的影響[15]。本試驗結(jié)果顯示，飼糧中添加杜仲提取物可提高寧鄉(xiāng)豬的血清TG含量，與楊燦等[16]對杜仲提取物在哺乳母豬上的研究結(jié)果一致。研究表明，杜仲提取物中的綠原酸有抑制腸道胰脂肪酶和肝臟甲基戊二酸輔酶A還原酶活性的功能，從而影響脂肪吸收和膽固醇合成，降低脂肪沉積[17]。本試驗中，飼糧中添加杜仲提取物能夠顯著降低寧鄉(xiāng)豬的血清LDL含量，顯著提高血清HDL含量，可能是由于杜仲提取物中的綠原酸能夠有效調(diào)節(jié)體內(nèi)的血脂代謝，對肝臟起到保護作用，這與Choi等[18]和劉云龍[19]的研究結(jié)果一致。

3.3 杜仲提取物對寧鄉(xiāng)豬肝臟中長鏈脂肪酸含量的影響

脂肪酸可分為飽和脂肪酸(SFA)、MUFA和PUFA。SFA和MUFA與肉質(zhì)有正的相關(guān)性，可改善豬肉的嫩度、香味和風(fēng)味等，但SFA會在血液中轉(zhuǎn)化為膽固醇，導(dǎo)致動脈硬化，所以SFA含量過高對人體健康有害。PUFA含量過高則易導(dǎo)致肌肉氧化、酸敗，脂肪松軟，肉品質(zhì)下降[20-21]。本試驗結(jié)果顯示，與對照組相比，試驗組寧鄉(xiāng)豬肝臟中SFA含量降低0.43%，MUFA和PUFA含量分別增加0.43%和0.49%，但均無顯著差異，說明飼糧中添加杜仲提取物對肝臟中脂肪酸組成無顯著影響。但試驗組肝臟SFA中棕櫚烯酸含量有增加趨勢，PUFA中亞油酸含量有降低趨勢。研究表明，棕櫚烯酸能降低人的血清TC含量[22]。PUFA中亞油酸能夠降低血清TG含量[23]，與本試驗研究結(jié)果一致。此外，杜仲提取物富含綠原酸、杜仲黃酮等抗氧化物質(zhì)，可以延緩肝臟脂肪酸中不飽和脂肪酸(UFA)的氧化損失，因此提高了部分UFA的含量，其具體的作用機制還有待進一步研究。

3.4 杜仲提取物對寧鄉(xiāng)豬肝臟中脂肪代謝相關(guān)基因表達量的影響

動物體內(nèi)的脂肪是在肝臟中通過脂肪代謝酶催化糖及氨基酸代謝中間產(chǎn)物內(nèi)源性合成。肝臟中含有種類豐富的脂肪代謝相關(guān)酶，是動物體內(nèi)脂肪酸合成的重要場所，在脂肪代謝中起重要作用[24]。在脂肪代謝過程中，關(guān)鍵性的酶有PPARα、ATGL、ACC、FAS和LXRα等，其中ACC和FAS與脂肪酸合成有關(guān)，而ATGL、PPARα和LXRα與脂肪分解有關(guān)[9]。研究顯示，杜仲提取物能促進大鼠肝臟脂肪氧化、降低四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)的脂肪沉積[25-26]。本試驗結(jié)果表明，與對照組相比，試驗組寧鄉(xiāng)豬肝臟中ATGL、ACC、LXRα和FAS的mRNA表達量顯著下調(diào)。杜仲提取物中的主要化學(xué)成分有綠原酸、黃酮類化合物和桃葉珊瑚甙。研究表明，綠原酸對肝臟有保護作用[3]。ACC可催化乙酰輔酶A合成丙二酸單酰輔酶A，為脂肪酸合成提供二碳單位，因此認(rèn)為ACC是調(diào)控脂肪酸合成的限速酶[27]。FAS可催化乙酰輔酶A和丙二酸單酰輔酶A合成脂肪酸，添加杜仲提取物會抑制FAS的mRNA表達，從而減少體脂沉積[28]。杜仲提取物可降低肝臟中FAS和ACC的mRNA表達量，致使肝臟中脂肪酸合成降低，體脂沉積減少，從而影響肝臟的脂肪代謝[17,27]。ATGL是脂肪代謝中的限速酶，其可將TG水解為甘油二酯和游離脂肪酸[29]。肝臟中ATGL的mRNA表達量下調(diào)可能也是導(dǎo)致血清中TG含量升高的原因。LXRα是核受體超家庭中的一員，參與脂類平衡。杜仲提取物中的綠原酸能夠顯著抑制LXRα的mRNA表達，研究表明，杜仲提取物可能會通過調(diào)控LXRα的mRNA表達而抑制TG含量[30]。本試驗結(jié)果表明，杜仲提取物通過對肝臟中脂肪代謝相關(guān)基因表達的調(diào)控，影響機體的脂肪酸代謝。

4 結(jié) 論

飼糧中添加杜仲提取物對寧鄉(xiāng)豬的生長性能無顯著影響，但能提高血清HDL含量，降低血清LDL含量，抑制肝臟中脂肪代謝相關(guān)基因FAS和ACC等的mRNA表達，進而影響機體的棕櫚烯酸和亞油酸代謝。