周華金 李和朋 張 輝 王繼光 宋志剛

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院/動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，泰安271018)

應(yīng)激反應(yīng)是生理平衡的破壞和恢復(fù)過程，這一過程的實(shí)現(xiàn)主要依賴于交感神經(jīng)系統(tǒng)和下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamo-pituitary-adrenal, HPA)軸的激活[1]。促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子(corticotropin-releasing factor，CRF)在脊椎動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)以及胃腸道在內(nèi)的外周組織中廣泛表達(dá)，在調(diào)節(jié)HPA軸以及應(yīng)激和能量相關(guān)的穩(wěn)態(tài)中起著重要的生理作用[2]。

應(yīng)激或環(huán)境的改變會(huì)導(dǎo)致脊椎動(dòng)物CRF激活，降低動(dòng)物采食量和繁殖活動(dòng)，增加動(dòng)物的覺醒程度和梳理毛發(fā)的行為[3]。研究證明，CRF參與哺乳動(dòng)物和魚類的攝食和體重調(diào)節(jié)[4-5]，外周CRF在應(yīng)激引發(fā)的胃腸動(dòng)力改變過程中發(fā)揮重要作用，外周注射CRF抑制了小鼠胃排空[6]。此外，腸內(nèi)源性CRF在應(yīng)激誘導(dǎo)的結(jié)腸運(yùn)動(dòng)和分泌功能變化的過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，在大鼠結(jié)腸中敲除CRF可防止應(yīng)激對(duì)結(jié)腸運(yùn)動(dòng)和黏膜分泌功能的影響[7]。

胃饑餓素(ghrelin)是生長激素促分泌素受體(growth hormone secretagogues receptor, GHSR)的內(nèi)源性配體，由28個(gè)氨基酸殘基組成，屬于腦腸肽家族成員[8]。主要在脊椎動(dòng)物的胃中產(chǎn)生，但在腦、腸、胰腺、膽囊、腎臟和鰓等組織中也有表達(dá)[9-10]。胃饑餓素通過外周或中樞作用的方式提高哺乳動(dòng)物的采食量和體增重[10]，誘導(dǎo)鱒魚的覓食行為，加速生長[11]。與哺乳動(dòng)物和魚類不同，胃饑餓素在家禽中樞中是一種厭食神經(jīng)肽，新生雛雞腦室注射胃饑餓素后產(chǎn)生焦慮樣行為，強(qiáng)烈抑制采食量[12]。蛋雞腦室注射胃饑餓素后采食量和飲水量均下降[13]。利用糖皮質(zhì)激素受體拮抗劑RU486和CRF受體拮抗劑Astressin研究胃饑餓素誘導(dǎo)肉仔雞食欲抑制機(jī)制，發(fā)現(xiàn)外周胃饑餓素通過HPA軸參與肉仔雞的食欲抑制作用[14]。

考慮到HPA軸受到CRF的調(diào)控，外周胃饑餓素通過HPA軸參與食欲的抑制作用，那么胃饑餓素是否是CRF影響食欲的一個(gè)因素？針對(duì)以上問題，本研究以活體入手，以靜脈注射方式外源導(dǎo)入CRF，通過分析下丘腦、腸道中相關(guān)基因[胃饑餓素、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子受體(corticotrophin releasing factor receptors,CRFR)1、CRFR2、生長激素促分泌素受體-1α(growth hormone secretagogue receptor type 1α,GHSR-1α)]的表達(dá)情況，探討CRF對(duì)肉仔雞食欲和胃饑餓素的影響，為CRF對(duì)肉仔雞食欲調(diào)控作用的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和試驗(yàn)設(shè)計(jì)

CRF由邁拓(中國)生物科技有限公司合成，純度為96.29%。

選取體重相近的1日齡雄性愛拔益加(AA)肉仔雞20只(購自山東大寶禽業(yè)有限公司)，采用籠養(yǎng)方式飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度35 ℃，自然通風(fēng)，相對(duì)濕度保持在55%～65%，飼喂參照NRC(1994)肉仔雞營養(yǎng)需要量標(biāo)準(zhǔn)配制的基礎(chǔ)飼糧，基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1，自由采食和飲水。7日齡時(shí)隨機(jī)分為2個(gè)組，每組10只雞，單籠單飼，試驗(yàn)組肉仔雞10日齡08:00翅靜脈注射1 000.0 μg/kg BW的CRF，對(duì)照組同時(shí)注射等量的生理鹽水。根據(jù)本試驗(yàn)中肉仔雞體重(256～272 g)，配制成1 mg/mL CRF注射液，即體重260 g的肉仔雞注射0.26 mL CRF注射液。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1)多維和多礦為每千克飼糧提供 Multi-vitamin and multi-mineral provided the following per kg of the diet：VA 9 000 IU，VD32 000 IU，VE 11.0 IU，VK 1.00 mg，硫胺素 thiamine 1.20 mg，核黃素 riboflavin 5.80 mg，煙酸 niacin 66.0 mg,泛酸 pantothenic acid 10.0 mg，吡哆醇 pyridoxine 2.60 mg，生物素 biotin 0.20 mg，葉酸 folic acid 0.70 mg，VB120.012 mg，Mn 100 mg，Zn 75.0 mg，F(xiàn)e 80.0 mg，I 0.65 mg，Cu 8.00 mg，Se 0.35 mg。

2)營養(yǎng)水平為計(jì)算值。Nutrient levels were calculated values.

1.2 樣品采集和指標(biāo)測定

統(tǒng)計(jì)每只雞在注射后2 h內(nèi)的采食量，CRF注射2 h后試驗(yàn)組和對(duì)照組同時(shí)采集下丘腦、十二指腸、空腸、回腸分子樣品，迅速放液氮中，而后置-80 ℃冰箱待測。

下丘腦、十二指腸、空腸、回腸分子樣品總RNA的提取按照動(dòng)物組織/細(xì)胞RNA提取試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)說明書進(jìn)行，提取的總RNA用微量紫外分光光度計(jì)(DS-11，DeNovix公司，美國)在260 nm波長下檢測RNA的濃度和純度。

cDNA的合成采用羅氏第一鏈cDNA合成試劑盒(Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit，Roche公司，德國)，反應(yīng)體系為20 μL，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)參數(shù)為：25 ℃ 10 min,55 ℃ 30 min,85℃ 5 min。反應(yīng)結(jié)束后于-20 ℃保存待用。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)的反應(yīng)程序：第1步預(yù)變性95 ℃ 10 s；第2步PCR反應(yīng)40、95 ℃ 5 s；60 ℃ 40 s。所有引物均根據(jù)Fast Start Universal SYBR Green Master (Rox)試劑盒要求，參照GenBank上已發(fā)表的序列，采用Dnaman 5.0設(shè)計(jì)(跨內(nèi)含子)，引物DNA由上海生工生物工程公司合成，引物序列見表2。參照Livak等[15]的方法用2-ΔΔCT法定量目標(biāo)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為參照基因進(jìn)行校準(zhǔn)。

表2 引物序列

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，置信區(qū)間為95%，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 靜脈注射CRF對(duì)肉仔雞采食量的影響

由圖1可知，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組翅靜脈注射CRF在2 h內(nèi)的采食量顯著降低(P<0.05)。

2.2 靜脈注射CRF對(duì)肉仔雞下丘腦和腸道中食欲調(diào)控相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

由圖2可知，與對(duì)照組相比，靜脈注射CRF顯著升高了肉仔雞下丘腦中胃饑餓素、CRFR1 mRNA相對(duì)表達(dá)量(P<0.05)，對(duì)下丘腦中GHSR-1α、CRFR2 mRNA相對(duì)表達(dá)量無顯著影響(P>0.05)。

由圖3可知，與對(duì)照組相比，靜脈注射CRF顯著降低了肉仔雞十二指腸中胃饑餓素mRNA相對(duì)表達(dá)量(P<0.05)，顯著提高了十二指腸中GHSR-1α、CRFR1、CRFR2 mRNA相對(duì)表達(dá)量(P<0.05)。

數(shù)據(jù)柱標(biāo)相同小寫字母或無字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下圖同。

Value columns with the same small or no letters mean no significant difference (P>0.05), while with different small letters mean significant difference (P<0.05). The same as below.

圖1靜脈注射CRF對(duì)肉仔雞采食量的影響

Fig.1 Effects of intravenous injection of CRF on
feed intake of broilers

Ghrelin；胃饑餓素 ghrelin；GHSR-1α：生長激素促分泌素受體-1α growth hormone secretagogue receptor type 1α；CRFR1：促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子受體1 corticotrophin releasing factor receptor 1；CRFR2：促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子受體2 corticotrophin releasing factor receptor 2。下圖同 The same as below.

圖2靜脈注射CRF對(duì)肉仔雞下丘腦中相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

Fig.2 Effects of intravenous injection of CRF on
related genes mRNA relative expression level in
hypothalamus of broilers

圖3 靜脈注射CRF對(duì)肉仔雞十二指腸中

由圖4可知，與對(duì)照組相比，靜脈注射CRF顯著提高了肉仔雞空腸中GHSR-1α、CRFR1、CRFR2 mRNA相對(duì)表達(dá)量(P<0.05)，對(duì)空腸中胃饑餓素mRNA相對(duì)表達(dá)量無顯著影響(P>0.05)。

由圖5可知，與對(duì)照組相比，靜脈注射CRF顯著提高了肉仔雞回腸中GHSR-1α、CRFR1、CRFR2 mRNA相對(duì)表達(dá)量(P<0.05)，對(duì)回腸中胃饑餓素mRNA相對(duì)表達(dá)量無顯著影響(P>0.05)。

圖4 靜脈注射CRF對(duì)肉仔雞空腸中

圖5 靜脈注射CRF對(duì)肉仔雞回腸中

3 討 論

3.1 靜脈注射CRF對(duì)肉仔雞采食量的影響

CRF在應(yīng)激條件下通過調(diào)節(jié)HPA軸及下丘腦以外的其他CRF通路調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)分泌系統(tǒng)、自主神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)及行為。在哺乳動(dòng)物中，腦室注射CRF會(huì)導(dǎo)致采食量降低并產(chǎn)生焦慮行為，誘導(dǎo)腎上腺分泌釋放糖皮質(zhì)激素[16-18]。已有研究表明，CRF系統(tǒng)通過中樞直接參與能量平衡的調(diào)控[19]，如果CRF系統(tǒng)發(fā)生功能性障礙則會(huì)引發(fā)病理性肥胖和進(jìn)食障礙[20-22]。在家禽中，CRF的作用與哺乳動(dòng)物相似，CRF系統(tǒng)在機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)受到威脅時(shí)參與食欲及能量平衡的調(diào)控[23]。已有研究表明，CRF是雞應(yīng)激反應(yīng)的中介分子，腦室注射CRF導(dǎo)致雞采食量下降，進(jìn)而影響體增重[24]。2日齡肉仔雞腦室注射CRF后，采食量顯著降低[25]。本試驗(yàn)中，靜脈注射CRF顯著降低了肉仔雞采食量，與前人研究相符，證實(shí)CRF是肉仔雞的一種有效抑食因子。

3.2 靜脈注射CRF對(duì)肉仔雞CRFR1和CRFR2 mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

CRF家族包括CRF和尿皮素(UCN)1～3，在哺乳動(dòng)物中高度保守，它們的功能由2個(gè)G蛋白偶聯(lián)受體CRFR1和CRFR2介導(dǎo)，CRF和UCN3作為多功能神經(jīng)肽參與應(yīng)激反應(yīng)并具有降低食欲的功能[20]。應(yīng)激反應(yīng)包括啟動(dòng)、維持和恢復(fù)3個(gè)階段[26]，研究普遍認(rèn)為CRF-CRFR1系統(tǒng)在應(yīng)激啟動(dòng)過程中不可獲缺[27]。有研究表明，在應(yīng)激反應(yīng)中，CRF可通過CRFR1誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，而CRFR1阻斷劑R317573對(duì)此種凋亡具有抑制作用，因此可用于治療應(yīng)激相關(guān)性焦慮障礙[28]。本研究中，靜脈注射CRF顯著升高了肉仔雞下丘腦、腸道(十二指腸、空腸、回腸)中CRFR1 mRNA相對(duì)表達(dá)量，提示CRF誘導(dǎo)CRFR1引發(fā)的焦慮障礙可能是造成肉仔雞采食量降低的原因之一。

在小鼠上的研究表明，CRFR2能介導(dǎo)CRF對(duì)飽腹感的影響，CRFR2選擇性拮抗劑能夠劑量依賴性的逆轉(zhuǎn)CRF對(duì)采食的影響，因而CRFR2拮抗劑可能對(duì)神經(jīng)性厭食癥具有治療作用[29]。此外，大鼠腦室注射CRFR2選擇性受體拮抗劑能劑量依賴性的抑制胃排空延遲，而CRFR1受體選擇性拮抗劑則不能，說明CRFR2受體介導(dǎo)CRF引起胃排空延遲[30]。本研究中，靜脈注射CRF顯著升高了肉仔雞腸道(十二指腸、空腸、回腸)中CRFR2 mRNA相對(duì)表達(dá)量，提示CRFR2可能通過影響飽腹感和延遲胃排空造成肉仔雞采食量下降。

3.3 靜脈注射CRF對(duì)肉仔雞胃饑餓素和GHSR-1α mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

胃饑餓素是一種肽類激素，在促進(jìn)垂體生長激素分泌、食欲刺激等多種生理活動(dòng)中發(fā)揮重要作用[31-32]。本研究中，靜脈注射CRF顯著降低了肉仔雞十二指腸中胃饑餓素mRNA相對(duì)表達(dá)量，空腸、回腸中胃饑餓素mRNA相對(duì)表達(dá)量無顯著變化，這說明靜脈注射CRF對(duì)胃饑餓素影響在下丘腦與腸道之間存在差異，且腸道各段響應(yīng)CRF的閾值不同，十二指腸響應(yīng)閾值更低。有研究表明，胃饑餓素對(duì)不同動(dòng)物的攝食有不同的影響，胃饑餓素可促進(jìn)大鼠、綿羊、金魚和人的攝食行為，但對(duì)幼魚和鵪鶉有相反作用[33]。哺乳動(dòng)物注射胃饑餓素后，通過激活神經(jīng)肽Y(NPY)和刺鼠色蛋白相關(guān)蛋白(AgRP)造成食物攝入的增加[34]。與人和小鼠不同，雞注射胃饑餓素后出現(xiàn)強(qiáng)烈的食欲抑制作用，且抑制效果存在劑量依賴性[35]。本研究中，靜脈注射CRF顯著提高了肉仔雞下丘腦中胃饑餓素mRNA相對(duì)表達(dá)量，胃饑餓素mRNA相對(duì)表達(dá)量升高會(huì)降低肉仔雞采食量，這可能是本試驗(yàn)中肉仔雞采食量降低的一個(gè)重要原因。

胃饑餓素受體(GHSR)存在GHSR-1α、GHSR-1β 2種類型，其中GHSR-1α為其功能型受體[36]。研究指出，大鼠切除腎上腺后注射地塞米松(人工合成的糖皮質(zhì)激素)，增加了GHSR-1α的mRNA相對(duì)表達(dá)量，用地塞米松對(duì)大鼠垂體細(xì)胞進(jìn)行處理也引起了GHSR-1αmRNA相對(duì)表達(dá)量升高[37]。在科布肉仔雞上的研究表明，胃饑餓素引起的厭食反應(yīng)是由HPA軸激活引起的[14]。本試驗(yàn)中，靜脈注射CRF顯著提高了肉仔雞腸道中GHSR-1αmRNA相對(duì)表達(dá)量，這可能是由于注射CRF后激活了HPA軸引起應(yīng)激，刺激腎上腺皮質(zhì)釋放糖皮質(zhì)激素，外周糖皮質(zhì)激素含量升高引起GHSR-1αmRNA相對(duì)表達(dá)量上升。

4 結(jié) 論

外周靜脈注射CRF能降低肉仔雞采食量，誘導(dǎo)中樞胃饑餓素的基因表達(dá)，中樞CRFR1、胃饑餓素以及腸道CRFR1、CRFR2、GHSR-1α基因表達(dá)上調(diào)導(dǎo)致的食欲抑制可能是造成采食量下降的原因。