陳會甫 皮定安 冷煒博 王秀英 朱惠玲 劉玉蘭 康 萍

(武漢輕工大學(xué)動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點實驗室，武漢430023)

在現(xiàn)代化養(yǎng)豬業(yè)中，早期斷奶仔豬容易受到飼養(yǎng)環(huán)境中的一系列不良因素的影響，如細(xì)菌、病毒等的刺激，從而發(fā)生免疫應(yīng)激。在免疫應(yīng)激狀態(tài)下，免疫系統(tǒng)會產(chǎn)生大量的炎性細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素(IL)-6和IL-1等，會導(dǎo)致組織(如腸道和肝臟)的損傷[1]，并最終導(dǎo)致動物生長性能下降。因此，通過營養(yǎng)調(diào)控手段(如添加脂肪酸和氨基酸)減少炎性介質(zhì)的過量釋放，對緩解仔豬免疫應(yīng)激具有重要意義。

傳統(tǒng)營養(yǎng)學(xué)認(rèn)為天冬酰胺(Asn)是一種非必需氨基酸，但有研究表明，Asn在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能方面具有重要作用[2]。Wu等[3]認(rèn)為Asn是一種精氨酸(Arg)家族氨基酸，其在體內(nèi)可以通過脫氨基和轉(zhuǎn)氨基等一系列作用途徑生成Arg和谷氨酰胺(Gln)，而Arg和Gln在調(diào)節(jié)機(jī)體組織功能、緩解炎癥方面發(fā)揮重要的作用。本實驗室前期的研究也表明，Asn可以緩解脂多糖(LPS)刺激導(dǎo)致的仔豬免疫應(yīng)激和組織損傷[4]，而且可以改善LPS刺激仔豬受損肝臟的能量代謝[5]。下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸可以調(diào)節(jié)許多生理過程，如免疫、生育和機(jī)體的應(yīng)激反應(yīng)等[6]，在機(jī)體應(yīng)激和感染中扮演著重要的角色[7]。LPS可以刺激外周免疫細(xì)胞產(chǎn)生大量的炎性細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-1和IL-6等[8]。而這些炎性細(xì)胞因子含量的升高會促使HPA軸活化，從而引起免疫應(yīng)激反應(yīng)[9-10]。而通過降低炎性細(xì)胞因子的營養(yǎng)調(diào)控方式可能有利于減輕由LPS刺激誘導(dǎo)的免疫應(yīng)激[11]。因此，鑒于本實驗室先前的研究結(jié)果，推測在豬的飼糧中添加適量的Asn，可能會緩解由LPS誘導(dǎo)的HPA軸炎癥反應(yīng)，從而緩解機(jī)體應(yīng)激。

Toll樣受體4(TLR4)是機(jī)體固有免疫的一個重要組成部分，其與髓樣分化蛋白88(MyD88)相互作用可啟動核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)活化，后者可刺激炎性基因的表達(dá)，促進(jìn)炎性細(xì)胞因子生成。同樣的，核苷酸結(jié)合寡聚域受體(NOD)1和NOD2也可以激活炎性細(xì)胞因子的釋放。這些炎性細(xì)胞因子可以防止病原菌的入侵，但也可以導(dǎo)致宿主組織的損傷以及神經(jīng)內(nèi)分泌的紊亂。HPA軸在機(jī)體應(yīng)激和感染中扮演著重要的角色，LPS刺激可以激活HPA軸中TLR4和NOD炎癥信號通路，從而導(dǎo)致炎性因子如TNF-α分泌量升高[12]。先前的研究表明，飼糧中添加魚油可以通過抑制斷奶仔豬HPA軸中TLR4和NOD炎癥信號通路，降低炎性因子的分泌，從而緩解LPS刺激所導(dǎo)致的仔豬免疫應(yīng)激反應(yīng)[12]。但Asn對HPA軸TLR4和NOD信號通路的影響至今還未見報道。因此，本試驗研究了Asn對LPS刺激斷奶仔豬的生長性能和HPA軸TLR4和NOD信號通路的影響，旨在為緩解仔豬免疫應(yīng)激提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

Asn：有效成分>99.4%，購自武漢阿米諾科技有限公司。

1.2 試驗動物與設(shè)計

試驗選取24頭健康的(21±2)日齡“杜×長×大”斷奶仔豬[平均體重(8.12±0.56) kg]，按體重相近原則隨機(jī)分為4組，分別為：1)對照組(基礎(chǔ)飼糧)；2)LPS組(基礎(chǔ)飼糧+LPS)；3)LPS+0.5% Asn組(基礎(chǔ)飼糧+0.5%Asn+LPS)；4)LPS+1.0% Asn組(基礎(chǔ)飼糧+1.0% Asn+LPS)。每組6個重復(fù)，每個重復(fù)1頭豬，試驗期為20 d?；A(chǔ)飼糧用丙氨酸進(jìn)行等氮處理。試驗第20天，LPS組、LPS+0.5% Asn組和LPS+1.0% Asn組的試驗豬注射100 μg/kg BW的LPS(大腸桿菌血清型055∶B5，美國Sigma公司)，對照組則注射等量的生理鹽水。

1.3 試驗飼糧

飼糧配制參照NRC(1998)仔豬的營養(yǎng)需要，基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

續(xù)表1項目 Items含量 Content蛋氨酸+半胱氨酸 Met+Cys0.72天冬氨酸+天冬酰胺 Asp+Asn1.69

1)每千克預(yù)混料中含有 Contained the following per kg of the premix：視黃醇乙酸酯 retinol acetate 2 700 μg，膽鈣化醇 cholecalciferol 62.5 μg，DL-α-生育酚乙酸酯DL-α-tocopheryl acetate 20 mg，甲萘醌 menadione 3 mg，VB1218 μg，核黃素 riboflavin 4 mg，煙酸 niacin 40 mg，泛酸 pantothenic acid 15 mg，氯化膽堿 choline chloride 400 mg，葉酸folic acid 700 μg，硫胺素 thiamin 1.5 mg，吡哆醇 pyridoxine 3 mg，生物素 biotin 100 μg，Zn (ZnSO4·7H2O) 80 mg，Mn (MnSO4·5H2O) 20 mg，F(xiàn)e (FeSO4·H2O) 83 mg，Cu (CuSO4·5H2O) 25 mg，I (KI) 0.48 mg，Se (Na2SeO3·5H2O) 0.36 mg。

2)計算值 Calculated values。

1.4 飼養(yǎng)管理

動物飼養(yǎng)試驗在動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點實驗室進(jìn)行。試驗前清掃、沖洗欄舍，先用2%氫氧化鈉(NaOH)溶液沖洗欄舍，再用1∶200的百毒殺稀釋液噴灑豬舍，最后用福爾馬林和高錳酸鉀熏蒸數(shù)小時，凈化1周。試驗仔豬飼養(yǎng)在1.80 m×1.10 m不銹鋼飼養(yǎng)籠中，飼養(yǎng)期間豬舍溫度保持在25 ～27 ℃，每天光照12 h，自由通風(fēng)，自由采食和飲水。

1.5 樣品采集與處理

試驗期每天記錄仔豬的采食量，并分別在試驗第1天和第19天對試驗豬進(jìn)行空腹12 h稱重，計算平均日增重、平均日采食量和料重比。試驗第19天，在注射LPS或生理鹽水前12 h，禁食，注射4 h后，屠宰全部試驗豬，并取出下丘腦、垂體及腎上腺，用冰生理鹽水沖洗后置于速凍管，并立即放入液氮進(jìn)行速凍，-80 ℃凍存待測。

1.6 檢測指標(biāo)及方法

將組織樣品溶解于裝有1mL RNAiso Plus試劑(TaKaRa，寶生物工程(大連)有限公司)的離心管中，放置冰上勻漿后，按說明書進(jìn)行樣品總RNA提取。

利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計試驗所用特異性引物，并由寶生物工程(大連)有限公司合成，相關(guān)基因的引物序列見表2。

1.7 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行獨立樣本t檢驗和回歸分析。t檢驗分別用于LPS組與對照組相比較，以確定LPS刺激的效果；以及LPS組與LPS+0.5% Asn組相比較和LPS組與LPS+1.0% Asn組相比較，以確定添加Asn對LPS仔豬的影響。線性和二次曲線回歸分析，用來確定飼糧中添加不同水平(0、0.5%、1.0%)的Asn對LPS刺激仔豬的影響。統(tǒng)計數(shù)據(jù)采用平均值和均值標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)表示。以P≤0.05為差異顯著標(biāo)準(zhǔn)0.05

2 結(jié) 果

2.1 Asn對LPS刺激斷奶仔豬生長性能的影響

由表3可知，與對照組相比，LPS刺激以及飼糧中添加Asn對LPS刺激斷奶仔豬的生長性能沒有顯著影響(P>0.05)。

2.2 Asn對LPS刺激斷奶仔豬下丘腦中TLR4和NOD信號通路關(guān)鍵基因mRNA表達(dá)的影響

由表4可知，與對照組相比，LPS可以顯著提高下丘腦中TLR4、MyD88、NOD2、受體相互作用絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶2(RIP2)和NF-κB的mRNA表達(dá)量(P<0.05)。飼糧中添加Asn可以顯著降低下丘腦中NF-κB的mRNA表達(dá)量(線性，P<0.05)，有降低下丘腦中白細(xì)胞介素-1受體相關(guān)激酶1(IRAK1)的mRNA表達(dá)量的趨勢(線性，P<0.10)。

表2 基因的引物序列

表3 Asn對LPS刺激斷奶仔豬生長性能的影響

P1：對照組vs. LPS組；P2：LPS組vs. 0.5% Asn組；P3：LPS組vs. 1.0% Asn組。

P1: control group vs. LPS group;P2: LPS group vs. 0.5%Asn group;P3: LPS group vs. 1.0%Asn group.

表4 Asn對LPS刺激斷奶仔豬下丘腦中TLR4和NOD信號通路關(guān)鍵基因mRNA表達(dá)的影響

P1：對照組vs. LPS組。下表同。

P1: control group vs. LPS group. The same as below.

2.3 Asn對LPS刺激斷奶仔豬垂體中TLR4和NOD信號通路關(guān)鍵基因mRNA表達(dá)的影響

由表5可知，與對照組相比，LPS可以顯著提高垂體中TLR4、MyD88、NOD1、NOD2、RIP2、NF-κB和TNF-α的mRNA表達(dá)量(P<0.05)。飼糧中添加Asn可以顯著降低垂體中腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TRAF6)的mRNA表達(dá)量(二次，P<0.05)，提高了垂體中NOD1的mRNA表達(dá)量(線性，P<0.10；二次，P<0.05)。

2.4 Asn對LPS刺激斷奶仔豬腎上腺中TLR4和NOD信號通路關(guān)鍵基因mRNA表達(dá)的影響

由表6可知，與對照組相比，LPS可以顯著提高腎上腺中TLR4、MyD88、IRAK1、NOD2、RIP2、NF-κB和TNF-α的mRNA表達(dá)量(P<0.05)。飼糧中添加Asn有降低腎上腺中TLR4和NOD2的mRNA表達(dá)量的趨勢(線性，P<0.10)，顯著增加了腎上腺中RIP2的mRNA表達(dá)量(線性，P<0.05；二次，P<0.05)。

表5 Asn對LPS刺激斷奶仔豬垂體中TLR4和NOD信號通路關(guān)鍵基因mRNA表達(dá)的影響

表6 Asn對LPS刺激斷奶仔豬腎上腺中TLR4和NOD信號通路關(guān)鍵基因mRNA表達(dá)的影響

3 討 論

免疫應(yīng)激在養(yǎng)豬生產(chǎn)中普遍存在，是導(dǎo)致豬生長抑制的重要因素之一，給養(yǎng)豬生產(chǎn)造成很大的經(jīng)濟(jì)損失。免疫應(yīng)激是由于飼養(yǎng)環(huán)境中的病原體或非病原體(如細(xì)菌、病毒和內(nèi)毒素等)或疫苗接種等應(yīng)激豬的免疫系統(tǒng)所致[14]。在免疫應(yīng)激高度激活狀態(tài)下，會導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子過量分泌，從而產(chǎn)生免疫應(yīng)激問題。傳統(tǒng)的觀點認(rèn)為，炎性細(xì)胞因子主要由免疫系統(tǒng)產(chǎn)生。然而近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)、胃腸道、肝臟、肌肉和脂肪等組織也能分泌炎性細(xì)胞因子[15-17]。這些細(xì)胞因子通過對靶組織的直接作用或通過作用于神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)，引起動物一系列行為和代謝上的改變，最終導(dǎo)致動物生長遲緩和胴體品質(zhì)下降[14]。因此，采取一定措施適度調(diào)節(jié)應(yīng)激動物過度的免疫反應(yīng)，尤其是炎性細(xì)胞因子的過量產(chǎn)生對緩解免疫應(yīng)激有重要作用。

近年來，通過營養(yǎng)調(diào)控來緩解免疫應(yīng)激已成為動物營養(yǎng)學(xué)的重要研究方向。國內(nèi)外學(xué)者和項目組在這方面進(jìn)行了一系列的研究，發(fā)現(xiàn)n-3多不飽和脂肪酸(PUFA)、Arg和共軛亞油酸等營養(yǎng)素均可緩解豬的免疫應(yīng)激[15-19]。然而，由于免疫應(yīng)激的調(diào)控機(jī)制尚不清楚，使得營養(yǎng)調(diào)控措施針對性不強。

Toll樣受體(TLRs)屬于模式識別受體(pattern recognition receptors，PRR)家族，可通過識別病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)，在抗菌和激活機(jī)體固有免疫反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[20-21]。TLRs家族中的TLR4可以識別LPS進(jìn)而介導(dǎo)機(jī)體的炎癥反應(yīng)，主要是通過TLR4傳遞由MyD88、IRAK1和TRAF6級聯(lián)傳遞的信號，并最終觸發(fā)NF-κB的激活，活化的NF-κB刺激炎性基因的表達(dá)，促進(jìn)促炎性細(xì)胞因子生成等。近年來發(fā)現(xiàn)，許多疾病的發(fā)病機(jī)制與TLRs信號通路的過度激活密切相關(guān)[22]。TLR4信號通路的激活也是導(dǎo)致豬免疫應(yīng)激的重要原因[15-18]。因此，有效抑制TLR4信號通路，對緩解仔豬免疫應(yīng)激具有很重要的實際意義。在本試驗中，與對照組相比，LPS提高了下丘腦、垂體、腎上腺中TLR4、MyD88、NF-κB的mRNA表達(dá)量及腎上腺中IRAK1的mRNA表達(dá)量，表明LPS刺激導(dǎo)致了下丘腦、垂體和腎上腺TLR4信號通路的激活。而飼糧中添加Asn降低了下丘腦中IRAK1、腎上腺中TLR4和垂體中TRAF6的mRNA表達(dá)量，這說明Asn可能抑制了腎上腺TLR4上游信號通路，但對下丘腦和垂體，則是抑制了其TLR4下游信號通路。有研究表明，Arg能緩解LPS刺激導(dǎo)致的斷奶仔豬肝臟中TLR4的mRNA表達(dá)量增加[23]，而Asn是作為一種Arg家族氨基酸，其在體內(nèi)可以通過脫氨基和轉(zhuǎn)氨基等一系列作用途徑生成Arg[2]，因此，我們推測Asn可能在體內(nèi)通過轉(zhuǎn)化為Arg后，抑制HPA軸TLR4及其下游相關(guān)基因的表達(dá)，從而緩解LPS刺激導(dǎo)致的HPA軸炎癥反應(yīng)。此外，本試驗結(jié)果表明，飼糧中添加Asn對垂體中TRAF6的mRNA表達(dá)量呈現(xiàn)二次趨勢，即添加0.5%的Asn比添加1.0%的Asn可以更好地抑制垂體中TLR4受體信號通路下游基因的表達(dá)。先前的研究表明，Asn可以通過降低肝臟中TLR4、IRAK1、TRAF6、NOD1、NOD2的mRNA表達(dá)量，從而緩解了LPS誘導(dǎo)的肝臟受損[24]，并改善了LPS誘導(dǎo)的損傷腸道的完整性[25]。因此，本研究結(jié)果表明，Asn可能通過降低IRAK1、TLR4和TRAF6的mRNA表達(dá)量，從而緩解了LPS誘導(dǎo)的HPA軸的炎癥反應(yīng)。

除了TLR4信號通路之外，另一個PRR家族，即核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域蛋白(NODs)，在識別PAMPs和調(diào)節(jié)宿主天然免疫反應(yīng)中也起著關(guān)鍵作用[20-21]，但目前對NOD的研究，主要集中在NOD1和NOD2。與TLR4類似，NOD1和NOD2也可以通過銜接分子RIP2激活NF-κB，導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子基因mRNA的轉(zhuǎn)錄上調(diào)[21]。為了防止NOD信號通路的過度激活，使機(jī)體維持相對穩(wěn)態(tài)，機(jī)體也存在NOD1和NOD2的負(fù)調(diào)控因子，適時終止NOD信號通路。目前已發(fā)現(xiàn)許多NOD1和NOD2的負(fù)調(diào)控因子，如Erbb2互作蛋白(ERBB2IP)和矢車菊苷β1(ACAP1)等[26-27]。在本試驗中，與對照組相比，LPS刺激提高了下丘腦中NOD2、RIPK2、NF-κB，垂體中NOD1、NOD2、RIP2、NF-κB，腎上腺中NOD2、RIPK2、NF-κB的mRNA表達(dá)量，表明LPS刺激導(dǎo)致了NOD信號通路的激活。而飼糧中添加Asn降低了腎上腺中NOD2和下丘腦中NF-κB的mRNA表達(dá)量。但飼糧中添加Asn也同時提高了腎上腺中RIP2的mRNA表達(dá)量，且飼糧中添加Asn還有提高腎上腺中NF-κB的mRNA表達(dá)量的趨勢。皮定安[28]研究發(fā)現(xiàn)，LPS刺激降低了肝臟ACAP1的mRNA表達(dá)量。這表明，LPS刺激造成過度炎癥反應(yīng)的同時會降低部分負(fù)調(diào)控因子的表達(dá)。同理，飼糧中Asn的添加水平過高也可能會抑制NOD信號通路中的負(fù)調(diào)控因子的表達(dá)，從而導(dǎo)致NF-κB的mRNA表達(dá)量升高。RIP2是NODs信號通路上游因子，是NOD1和NOD2與下游因子NF-κB之間的銜接因子。在本研究中，飼糧中添加Asn雖然提高了腎上腺中RIP2的mRNA表達(dá)量，但對下游因子NF-κB的mRNA表達(dá)量基本沒有影響。

4 結(jié) 論

Asn雖然對LPS刺激仔豬的生長性能沒有產(chǎn)生顯著影響，但其可通過降低下丘腦中NF-κB 的mRNA表達(dá)量而對下丘腦TLR4信號通路具有一定的抑制作用。