姚新原，溫賢浩，憲 瑩，朱 進，肖劍文，3

1重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院血液腫瘤中心；2兒童發(fā)育疾病研究教育部重點實驗室；3兒科學(xué)重慶市重點實驗室，重慶 400014

T細胞性淋巴母細胞淋巴瘤（T-LBL）和T細胞性急性淋巴細胞白血?。═-ALL）均是起源于不成熟前體T淋巴細胞的惡性腫瘤，一般以骨髓原始及幼稚淋巴細胞≥25%診斷T-ALL，而＜25%或骨髓未受累診斷T-LBL[1]。各種理化、遺傳因素引發(fā)的DNA損傷所導(dǎo)致的體細胞突變是T-LBL發(fā)病的重要因素及腫瘤細胞的特異性標記，文獻報道體細胞突變的腫瘤標記（如NOTCH1、FBXW7等）與T-ALL及T-LBL預(yù)后相關(guān)[2-3]。既往多采用PCR擴增后一代測序（Sanger測序）技術(shù)檢測腫瘤基因突變，但檢測到的基因突變種類且靈敏度不高[2]。全外顯子組是致病突變最為集中的區(qū)域，因此在T-LBL患兒樣本中開展全外顯子測序（WES）檢測腫瘤細胞存在的基因突變，可以一次性檢測到目前全部已知的腫瘤基因突變，也可用于定期隨訪其治療后特異性腫瘤基因突變水平和殘留病灶監(jiān)測[4]，對于T-LBL治療具有重大指導(dǎo)意義。但如果采用常規(guī)的Sanger測序技術(shù)進行WES測序費用高且耗時長，根本不能應(yīng)用于臨床診療。二代測序技術(shù)（NGS）大幅度提高了外顯子組測序的速度和測序量而檢測費用顯著降低，使得腫瘤患者組織標本的常規(guī)WES檢測成為可能[5]。

T-ALL患兒可采集骨髓標本提取基因組DNA進行NGS測序檢查，而T-LBL病理標本多采用福爾馬林固定后石蠟包埋保存，故難以獲得新鮮腫瘤組織提取基因組DNA進行NGS檢測，尤其是已經(jīng)保存較長時間的樣本基因組DNA存在不同程度的降解，更是增加了檢測難度。本研究從10例T-LBL患兒石蠟包埋組織切片中提取基因組DNA，進行基于NGS技術(shù)的全外顯子組測序并用于探索T-LBL患兒的體細胞突變，為進一步研究應(yīng)用WES測序檢測腫瘤基因突變打下基礎(chǔ)?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究納入2013年3月～2017年6月在重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院血液科住院治療的10例T-LBL患兒作為研究對象，其中男性6例，女性4例，年齡82.70±12.27月。10例患兒均行淋巴結(jié)活檢確診。納入標準：（1）診斷時年齡均＜18歲；（2）按照WHO-2008造血及淋巴組織腫瘤診斷標準完善檢查且符合T-LBL診斷[6]。排除標準：（1）骨髓原始及幼稚淋巴細胞比例≥25%；（2）既往接受過抗腫瘤治療：（3）繼發(fā)性腫瘤患兒。所有淋巴結(jié)活檢標本均經(jīng)過福爾馬林固定后石蠟包埋、室溫存放。

1.2 方法

1.2.1 石蠟包埋組織處理 每例石臘固定標本均連續(xù)切片5～10張，厚度為5 μm。二甲苯脫蠟2次（40 ℃水浴，時間12～24 h）后無水乙醇漂洗2次，離心5 min去上清液并真空干燥。加入1000 μg/mL蛋白酶K細胞裂解液（50 ℃水浴，12～24 h）處理后收集細胞，PBS洗滌并離心，300目尼龍網(wǎng)過濾后收集細胞懸液。

上述步驟所得細胞懸液利用基因組DNA提取試劑盒（QIAamp DNA Blood MiniKit，Qiagen）提取樣本DNA，方法參考試劑盒說明書。所提取DNA使用紫外分光光度計測定A260及A280，A260/A280值1.6～1.8為合格樣本，-20 ℃保存基因組DNA樣本。

1.2.2 全外顯子組測序 全外顯子組測序委托上海新培晶醫(yī)學(xué)檢驗所完成。每例患兒取15～20 μg基因組DNA樣本，采用超聲打斷儀（Covaris s2，Massachusetts，USA）將基因組DNA隨機打斷成主代200 bp左右片段，取1 μg提純的DNA片段進行末端修復(fù)并連接上標記性接頭，構(gòu)建DNA測序文庫。按照illumina標準建庫方法行3步酶促反應(yīng)形成樣本文庫[7]。

序列捕獲采用羅氏全外顯子液相芯片（NimbleGen SeqCap EZ Exome V3 芯片，Roche，64 M）并按照供應(yīng)商提供的標準實驗流程進行[8]，混合后的文庫在42 ℃條件下雜交16～20 h。然后進行洗脫、純化后PCR擴增即得到序列捕獲后的產(chǎn)物，上機測序（Illumina HiSeq ×10），平均測序深度150～200×。

1.2.3 全外顯子組數(shù)據(jù)處理和生物信息學(xué)分析 用Illumina Pipeline software（version1.3.4）讀出原始測序數(shù)據(jù)，首先進行包括圖像識別、堿基識別、過濾接頭序列和檢測可能的樣本污染等基本數(shù)據(jù)處理，然后進行生物信息學(xué)分析。生物信息學(xué)及突變分析方法為：GATK、SAMTools、SIFT、PolyPhen2、LRT、Mutation-Taster等。主要步驟包括：處理后數(shù)據(jù)與參考基因組比對，找到單一比對到基因組上數(shù)據(jù)序列，將其與外顯子組區(qū)域再比對，隨后進行目標區(qū)域中單堿基深度分布和覆蓋度均一性分析。突變數(shù)據(jù)庫來源包括：1000 Genomes Project、dbSNP、ClinVar、ESP6500、ExAc、Ensembl、HGMD、UCSC等。同時應(yīng)用SIFT在線預(yù)測工具（http://sift.icvi.org/）和Polyphen-2軟件預(yù)測突變對蛋白質(zhì)功能的影響。

對于發(fā)現(xiàn)的突變位點結(jié)合文獻[2，9-12]及軟件分析結(jié)果，將突變區(qū)分為以下4類：（1）文獻報道與疾病明確相關(guān)的突變位點；（2）與疾病可能相關(guān)的突變位點；（3）意義不明確的變異位點；（4）無致病性變異位點。（1）+（2）兩類突變被認為是致病基因候選突變位點。

1.2.4 致病突變位點Sanger測序 測序所得致病候選突變位點，通過http://www.ncbi.nih.gov/查詢到相應(yīng)基因的GeneBank外顯子序列、采用Gene Tool軟件對每個候選突變區(qū)域進行引物設(shè)計，引物由生工生物工程股份（上海）有限公司合成。以基因組DNA為模板，擴增目的DNA片段，所得的PCR產(chǎn)物經(jīng)過純化及鑒定后，加入BigDye? Terminator v3.1（ABI）進行PCR擴增并上機測序，與GeneBank數(shù)據(jù)庫提供的mRNA標準序列比對，進行突變位點鑒定。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

10例患兒測序結(jié)果的突變數(shù)、與疾病相關(guān)突變數(shù)、測序深度使用SPSS 19.0進行列表分析，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差表示，中位水平采用中位數(shù)（范圍）表示。

2 結(jié)果

2.1 DNA提取

10例石蠟包埋組織樣本切片厚度5 μm且每例組織樣品切片5張以上，每張切片經(jīng)基因組DNA提取，均成功提取到基因組DNA。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，所獲得的基因組DNA樣本均質(zhì)量良好，且數(shù)量足夠完成本研究、留取標本復(fù)核及建立組織樣本庫為后續(xù)研究做準備。

2.2 外顯子組測序結(jié)果

采用羅氏全外顯子液相芯片對10例T-LBL患兒進行外顯子組捕獲及測序，總體測序深度為182.73±69.89，中位測序深度165.19（89.52～347.28）。測序輸出的原始數(shù)據(jù)與參考數(shù)據(jù)庫中的外顯子基因組序列進行比對，得到與致病相關(guān)的突變位點序列。通過序列比對分析發(fā)現(xiàn)10例患兒每例均有突變，例均突變數(shù)34.20±9.90，10例患兒中位突變數(shù)32（20～48）。每例患兒均發(fā)現(xiàn)潛在致病突變（表1），例均疾病相關(guān)突變2.30±1.06，10例患兒疾病相關(guān)突變中位數(shù)2（1-5）。上述疾病相關(guān)突變涉及基因合計16種，其中文獻報道[9-12]與疾病明確相關(guān)的突變基因共10種，包括：JAK3、FBXW7、ETV6、CDKN1B、NOTCH1、BCOR、DMBT1、NF1、PHF6和KMT2D，與疾病可能相關(guān)的突變基因[13-15]共6種，包括：TSC1、CDH1、FLG、SMARCA4、RASA2和USH2A。所有致病突變經(jīng)過Sanger測序驗證均確實存在于患兒基因組。

表1 10例T-LBL患者疾病相關(guān)基因突變

3 討論

T-LBL是兒童期非霍奇金淋巴瘤的常見亞型，DNA損傷導(dǎo)致的體細胞突變是包括T-LBL在內(nèi)的惡性腫瘤細胞特異的分子生物學(xué)標記[16]。初診時確定腫瘤細胞特異性標記可以指導(dǎo)治療方案選擇及判斷預(yù)后，如FBXW7陽性T-LBL預(yù)后較差，可能需要采用異基因造血干細胞移植在內(nèi)的強化治療方案[2]。本研究中10例患兒經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)多種腫瘤相關(guān)基因變異，其中JAK3[16]，NOTCH1[2]，ETV6[16]等基因均報道與血液系統(tǒng)腫瘤發(fā)生相關(guān)，而FBXW7則是T-LBL中常見與預(yù)后密切相關(guān)且對臨床診療方案具有指導(dǎo)意義的基因。

U-淋巴瘤經(jīng)過治療后體內(nèi)仍剩余有腫瘤細胞，即微小擴散病灶[17]，治療后微小擴散病灶水平為判斷治療反應(yīng)、危險度分級以及指導(dǎo)進一步化療、指導(dǎo)造血干細胞移植指征選擇等提供了一個客觀直接的量化指標，是淋巴瘤獨立的預(yù)后因素[18]，既往主要采用CT、PET-CT等影像學(xué)檢測方法評估淋巴瘤微小擴散病灶水平，但其靈敏度及特異性均較低[19]，如果病初確定T-LBL標志性的腫瘤突變，治療后采集外周血檢測循環(huán)腫瘤DNA，可以為指導(dǎo)治療提供更加靈敏可靠的監(jiān)測手段[20]。本研究隊列中10例患兒均發(fā)現(xiàn)疾病潛在相關(guān)突變，平均為2.30（1～5）個，提示基因組疾病相關(guān)突變對于微小擴散病灶分析具有潛在價值。但本文未對患兒正常組織進行測序分析，尚不能分辨上述潛在突變系遺傳突變還是體細胞突變，隨訪過程中需要對正常組織測序以進一步確定上述變異是否為腫瘤細胞特異性改變，明確其微小擴散病灶監(jiān)測價值。

有研究認為T-LBL和T-ALL系相同疾病的不同表現(xiàn)，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)超過20種腫瘤標記與T-LBL/TALL發(fā)病及預(yù)后有關(guān)[9-12]。診斷為T-ALL的患者骨髓中存在大量腫瘤細胞，采集骨髓液提取基因組DNA可進行測序分析，但目前國內(nèi)診斷為T-LBL患者病理標本多采用福爾馬林固定后行石蠟包埋，故難以獲得保存良好的新鮮腫瘤組織，隨著保存時間的延長，基因組DNA不斷破壞，限制了腫瘤細胞突變的檢測[21]。本研究對一個10例T-LBL的包埋樣本進行了WES分析，分析結(jié)果表明樣本可以用于測序分析，且能夠達到理想的測序深度用于后續(xù)基因組數(shù)據(jù)分析。同時，測序結(jié)果表明所有患兒均具有腫瘤相關(guān)基因突變，人均2.30個，較常見B細胞類群淋巴瘤為少，而與兒童白血病接近，NOTCH1，PHF-6以及FBXW7等基因也為T-ALL常見突變基因，均提示該類樣本W(wǎng)ES分析的可靠性較高，具有臨床應(yīng)用價值。

T-LBL體細胞突變類型較多，傳統(tǒng)的基因突變檢測系采用Sanger測序法逐一檢測致病突變，該方法耗時費力、費用較高，且不能發(fā)現(xiàn)新的致病突變[22]。多數(shù)腫瘤的致病突變集中在僅占全基因組不到2%的各基因外顯子編碼區(qū)序列，對編碼區(qū)序列檢測即為WES[23]。隨著新一代測序技術(shù)NGS的發(fā)展，WES測序效率得到顯著提高測序成本不斷下降[24-25]，為采用NGS對T-LBL進行WES檢測提供了可能。本研究中發(fā)現(xiàn)的基因變異，除了常見于T-LBL的突變基因NOTCH1，F(xiàn)BXW7，PHF6等以外，更是發(fā)現(xiàn)多種腫瘤相關(guān)基因突變，且均為錯義、移碼等突變類型，具有功能意義，對于臨床有重要提示作用。

本研究在國內(nèi)首次采用石蠟包埋的T-LBL病理組織提取基因組DNA，并使用NGS技術(shù)對10例TLBL患兒行WES測序，建立了標準的檢測方案。通過生物信息學(xué)對WES測序結(jié)果進行分析并確定致病突變位點后，采用Sanger測序進行復(fù)核，結(jié)果顯示本研究采用的檢測方案可以高效的檢測出T-LBL致病位點，為進一步研究T-LBL發(fā)病機制及治療打下基礎(chǔ)。