孔 一 蘇 欣 鄭小燕

(1中南大學湘雅二醫(yī)院皮膚與性病科,2心血管內(nèi)科 長沙 410012)

多項研究已明確肥胖與動脈粥樣硬化密切相關[1]。肥胖是脂肪細胞肥大和增生共同作用的結(jié)果,過多能量攝入可誘導脂肪組織中存在的脂肪間充質(zhì)干細胞(adipose mesenchymal stem cell,AMSC)分化為成熟脂肪細胞,加重肥胖發(fā)生發(fā)展[2]。誘導細胞死亡的DFF45樣效應因子C (cell death-inducing DNA fragmentation factor 45-like effector C,CIDEC)屬CIDE家族成員,研究發(fā)現(xiàn)沉默CIDEC基因可使AMSC喪失成脂分化能力[3-4]。而相關機制研究表明:CIDEC通過作用于AMSC成脂分化早期關鍵調(diào)控因子CCAAT/增強子結(jié)合蛋白β(CCAAT/enhancer binding protein beta,C/EBPβ),促進后者表達,啟動脂肪細胞特異性基因表達,最終完成AMSC向成熟脂肪細胞轉(zhuǎn)變[5]。

載脂蛋白A5(apolipoprotein A5,ApoA5)是2001年新發(fā)現(xiàn)的一種載脂蛋白,也是三酰甘油(triglyceride,TG)代謝的重要調(diào)控因子。我們前期研究發(fā)現(xiàn)肥胖患者血漿ApoA5蛋白質(zhì)水平降低與體重指數(shù)(body mass index,BMI)呈負相關[6],提示ApoA5可能參與肥胖的病理生理過程。ApoA5進入成熟脂肪細胞后,可顯著下調(diào)CIDEC蛋白質(zhì)水平,同時降低細胞內(nèi)TG含量[7]。結(jié)合前期研究結(jié)果,我們提出假說:ApoA5通過下調(diào)CIDEC表達,繼而影響C/EBPβ激活,從而抑制AMSC成脂分化。

材 料 和 方 法

組織來源經(jīng)中南大學湘雅二醫(yī)院倫理委員會批準[(2013)倫審第(研067)號]及患者知情同意后,獲取進行腹部外科手術(shù)患者的皮下組織。所選患者平均年齡為(40.6±13.6)歲,男女比例∶1,平均BMI為(21.4±7.6)kg/m2,均無糖尿病及嚴重的系統(tǒng)性疾病。

材料來源DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、Ⅰ型膠原酶、0.25%胰蛋白酶溶液等試劑購于美國Gibco公司;促分化試劑、ApoA5一抗、CIDEC一抗等抗體購于美國Sigma公司;人ApoA5蛋白質(zhì)購于湖南遠泰生物有限公司;PCR引物合成試劑盒、油紅O吸光度檢測試劑盒、TG定量檢測試劑盒等購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

人AMSC分離、培養(yǎng)及誘導成脂分化于超凈工作臺中用眼科剪剔除脂肪組織中肉眼可見的血管和結(jié)締組織,并用PBS液反復沖洗,移入小玻璃瓶中,加入等體積的0.1% Ⅰ 型膠原酶,搖勻后于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中消化30 min,隨后移入15 mL離心管,1 500×g離心10 min,棄去懸浮組織,沉淀即為AMSC。以含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng),待細胞生長至80%匯合后進行傳代。選擇生長良好的第3代細胞接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。待生長至完全匯合時,以含胰島素(10 μg/mL)、地塞米松(1 μmol/L)、IBMX (0.5 mmol/L)的誘導劑誘導細胞分化。

細胞干預及收獲將同一6孔板的細胞分為實驗組(3孔)和對照組(3孔),實驗組于誘導開始時加入600、1 200 ng/mL ApoA5進行干預,直至第14天;對照組不加ApoA5。分別于誘導第7、14天收獲細胞。

分光光度計測定細胞內(nèi)油紅O吸光度及TG含量將細胞按油紅O染色試劑盒處理后,測量492 nm處的吸光度(D)值,計算油紅O吸光度;用TG定量檢測試劑盒處理后,測定D570值,計算TG水平。

Real-timePCR檢測成脂分化標志物mRNA表達水平分別制備實驗組和對照組的細胞總RNA,按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,并分別合成成脂分化標志物基因aP2和FAS的引物。配制PCR反應體系,用ABI PRISM 7300軟件進行實時熒光定量PCR并分析結(jié)果,記錄各基因擴增Ct值。

激光共聚焦觀察ApoA5與CIDEC的共定位現(xiàn)象誘導AMSC成脂分化,用Alexa Fluor 488熒光染料標記ApoA5 (ApoA5-488),將ApoA5-488與促分化14天細胞于37 ℃孵育4 h,PBS洗滌3遍,4%多聚甲醛固定細胞,進行免疫熒光檢測:加入CIDEC一抗孵育后,再加入相應的熒光二抗,利用激光共聚焦成像系統(tǒng)觀察ApoA5在AMSC內(nèi)的分布情況以及與CIDEC是否存在共定位的現(xiàn)象。

Westernblot檢測CIDEC與C/EBPβ蛋白質(zhì)水平取50 μg各組細胞總蛋白質(zhì),6%不連續(xù)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離,60 V恒壓電流下轉(zhuǎn)移4 h,電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。將PVDF膜轉(zhuǎn)移至含有封閉液的平皿中,室溫下脫色搖床上搖動1 h。將不同的一抗(鼠抗人ApoA5、CIDEC、C/EBPβ等)用含5% BSA的PBST稀釋至適當濃度(∶1 000～∶5 000)。從封閉液中取出PVDF膜,室溫下將PVDF膜于稀釋的一抗中脫色,搖床上漂洗。將辣根過氧化物酶標記的二抗(兔抗鼠)稀釋至∶1 000,室溫下將PVDF膜于稀釋的二抗中孵育2 h,回收二抗,室溫下用PBST漂洗。用DAB顯色法于膜上顯色。將定影后的膠片采用凝膠成像系統(tǒng)掃描分析結(jié)果,通過Quantity ONE圖像分析軟件進行灰度值分析。將所測得各目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參蛋白(β-actin)條帶灰度值的比值作為該蛋白的相對表達量。

結(jié) 果

ApoA5對AMSC成脂分化的影響通過分光光度計檢測油紅O吸光度(圖1)。干預至第7天,600和1 200 ng/mL ApoA5干預的細胞油紅O吸光度與對照組相比,分別下降17%和20% (P<0.05);干預至14天,600和1 200 ng/mL ApoA5干預的細胞油紅O吸光度與對照組相比,分別下降22%和37% (P<0.05)。

ApoA5 could decrease the oil red O absorbance in a dose-dependence manner.(1)vs.the control group,P<0.05.

圖1分光光度法檢測油紅O吸光度
Fig1TheoilredOabsorbancedetectedby
spectrophotometricmethod

ApoA5對AMSC中TG含量的影響通過TG定量檢測試劑盒檢測ApoA5干預后細胞內(nèi)TG含量變化(圖2)。干預至第7天,600和1 200 ng/mL ApoA5使TG含量降低達26%和54% (P<0.05);干預至14天,降低達38%和57% (P<0.05)。

ApoA5對脂肪酸結(jié)合蛋白基因(aP2)及脂肪酸合酶基因(FAS)mRNA表達水平的影響通過real-time PCR檢測發(fā)現(xiàn),干預至第7天,600和1 200 ng/mL ApoA5使aP2 mRNA水平降低達21%和41% (P<0.05);干預至第14天,降低達34%和52%(P<0.05,圖3);干預至第7天,600和1 200 ng/mL ApoA5使FASmRNA水平降低達23%和42% (P<0.05);干預至第14天,降低達39%和52%(P<0.05,圖4)。

ApoA5 could decrease the intracellular TG concentration in a dose-dependence manner.(1)vs.the control group,P<0.05.

圖2分光光度法檢測細胞內(nèi)TG含量
Fig2TGconcentrationdetectedby
spectrophotometricmethod

ApoA5 could decrease the intracellular mRNA expression level ofaP2 in a dose-dependence manner.(1)vs.the control group,P<0.05.

圖3real-timePCR檢測細胞內(nèi)aP2基因表達水平
Fig3TheintracellularmRNAexpressionlevelof
aP2detectedbyreal-timePCR

ApoA5 could decrease the intracellular mRNA expression level ofFASin a dose-dependence manner.(1)vs.the control group,P<0.05.

圖4real-timePCR檢測細胞內(nèi)FAS基因表達水平
Fig4TheintracellularmRNAexpressionlevelof
FASdetectedbyreal-timePCR

激光共聚焦觀察ApoA5與CIDEC共定位情況通過激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn):脂肪細胞內(nèi)ApoA5-488 (綠色熒光)與CIDEC (紅色熒光)分布一致,說明ApoA5和CIDEC共定位于脂肪細胞脂滴表面(圖5)。

ApoA5對CIDECmRNA和蛋白質(zhì)水平的影響通過real-time PCR檢測發(fā)現(xiàn)(圖6),干預至第7天,600和1 200 ng/mL ApoA5使CIDECmRNA表達水平降低達25%和51% (P<0.05);干預至第14天,降低達32%和60% (P<0.05)。通過Western blot檢測及Quantity ONE圖像分析軟件進行灰度值分析發(fā)現(xiàn),ApoA5可顯著降低CIDEC蛋白質(zhì)水平,降低程度與ApoA5濃度呈正相關(圖7)。

ApoA5 CIDEC Merge ApoA5 and the red fluorescence CIDEC,which stimulated the green fluorescence,were located on the surface of the lipid droplets,and the yellow fluorescence appeared after fusion,indicating that ApoA5 and CIDEC were distributed within the cells.

圖5激光共聚焦顯微鏡觀察CIDEC在脂肪細胞內(nèi)的定位
Fig5ThelocalizationofCIDECinadiposecellsobservedbylaserconfocalmicroscope

ApoA5對C/EBPβmRNA和蛋白質(zhì)水平的影響通過real-time PCR檢測發(fā)現(xiàn),干預至第7天,600和1 200 ng/mL ApoA5使C/EBPβmRNA表達水平降低達23%和50% (P<0.05);干預至第14天,降低達43%和64% (P<0.05,圖8)。通過Western blot檢測及Quantity ONE圖像分析軟件進行灰度值分析發(fā)現(xiàn),ApoA5可顯著降低C/EBPβ蛋白質(zhì)水平,降低程度與ApoA5濃度呈正相關(圖9)。

ApoA5 could decrease the intracellular mRNA expression level ofCIDECin a dose-dependence manner.(1)vs. the control group,P<0.05.

圖6real-timePCR檢測細胞內(nèi)CIDEC基因表達水平
Fig6TheintracellularmRNAexpressionlevelof
CIDECdetectedbyreal-timePCR

討 論

ApoA5蛋白是TG代謝的調(diào)控因子[6]。缺乏ApoA5蛋白質(zhì)將導致血漿中TG濃度升高,ApoA5蛋白質(zhì)可降低血漿TG濃度,且ApoA5還參與調(diào)節(jié)細胞內(nèi)TG的代謝[7];FAS蛋白質(zhì)是生物體內(nèi)源性脂肪合成過程的關鍵酶,動物實驗發(fā)現(xiàn),體內(nèi)缺乏FAS基因的小鼠明顯更能抵制肥胖[8];aP2蛋白質(zhì)能協(xié)助將動物組織細胞內(nèi)的脂肪酸運至TG合成部位,從而促進脂肪細胞中TG沉積,因此上述基因表達水平能反映AMSC成脂分化程度[9]。與之一致的是,本實驗觀察到ApoA5可降低人AMSC成脂分化過程中脂滴油紅O吸光度、TG含量,并能顯著降低成脂分化指標FAS和aP2的mRNA表達水平,因此我們認為ApoA5可抑制AMSC成脂分化。

A:Western blot detected the protein level of CIDEC;B:Quantity ONE image analysis software analyzed the gray value of strip.(1)vs.the control group,P<0.05.

圖7ApoA5對脂肪細胞CIDEC蛋白表達的影響
Fig7TheeffectofApoA5onintracellularproteinexpressionlevelofCIDEC

ApoA5 could decrease the intracellular mRNA expression level ofC/EBPβin a dose-dependence manner.(1)vs.the control group,P<0.05.

圖8real-timePCR檢測細胞內(nèi)C/EBPβ基因表達水平
Fig8TheintracellularmRNAexpressionlevelof
C/EBPβdetectedbyreal-timePCR

CIDEC蛋白質(zhì)(在小鼠稱為FSP27)是一種新的脂滴相關蛋白質(zhì)。動物研究發(fā)現(xiàn),FSP27基因敲除小鼠能抵制高脂飲食誘導的肥胖,來源于這種小鼠的脂肪細胞內(nèi)TG含量顯著減少[10]。體外實驗中將脂肪細胞CIDEC基因敲除后,脂肪細胞在基礎和刺激狀態(tài)下的脂解活性顯著增強,細胞內(nèi)TG含量下降[11]。上述改變提示:CIDEC/FSP27基因功能缺失的脂肪細胞部分表型發(fā)生了由能量儲存向能量消耗的轉(zhuǎn)化,同時并不增加其他組織的脂質(zhì)負荷。本研究發(fā)現(xiàn),ApoA5可呈劑量依賴性降低細胞內(nèi)CIDEC mRNA和蛋白質(zhì)水平,下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子C/EBPβmRNA表達,從而發(fā)揮抑制AMSC成脂分化的作用。結(jié)合前期研究結(jié)果,我們推測:ApoA5通過下調(diào)CIDEC的表達,從而抑制脂肪細胞增生與肥大。

A:Western blot detected the protein level of C/EBPβ;B:Quantity ONE image analysis software analyzed the gray value of strip.(1)vs.the control group,P<0.05.

圖9ApoA5對脂肪細胞C/EBPβ蛋白表達的影響
Fig9TheeffectofApoA5onintracellularproteinexpressionlevelofC/EBPβ

對于ApoA5下調(diào)CIDEC mRNA及蛋白質(zhì)水平的機制,目前已有分析顯示:小鼠FSP27基因5’端上游存在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的結(jié)合位點,如C/EBP、PPAR和SREBP-1等。當上述轉(zhuǎn)錄因子與FSP27 mRNA結(jié)合之后,可促進后者表達[12]。因此,人CIDECmRNA可能也受上述因子轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。前文提到,CIDEC進入細胞核之后,將促進C/EBPβmRNA的表達,而后者又可促進CIDECmRNA表達。由此推測,ApoA5可能通過抑制這條正反饋的調(diào)節(jié)通路來降低CIDEC表達。以上推測需要進一步研究來證實。

本研究驗證了ApoA5能夠抑制AMSC成脂分化過程中TG含量,下調(diào)成脂分化相關因子aP2和FASmRNA表達水平,說明ApoA5具有抑制AMSC成脂分化的作用。ApoA5呈環(huán)狀圍繞在脂滴周圍,與CIDEC共同定位于脂滴表面;在成脂分化過程中,ApoA5可下調(diào)CIDEC mRNA及蛋白質(zhì)水平,抑制CIDEC下游C/EBPβ等成脂分化早期關鍵因子的mRNA表達,從而抑制AMSC成脂分化。