丁 銘 秦兆宇 丁 琛,3 賀福初,2,4

(1復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院 上海 200032; 2國(guó)家蛋白質(zhì)科學(xué)中心 北京 102206; 3復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院遺傳工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海 200438;4蛋白質(zhì)組學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-北京放射醫(yī)學(xué)研究所 北京 102206)

核受體是一類在生物體內(nèi)廣泛分布的、配體依賴的轉(zhuǎn)錄因子超家族,成員眾多,可分為3類:類固醇激素受體、非類固醇激素受體和孤兒受體。核受體與相應(yīng)的配體及其輔調(diào)節(jié)因子相互作用,調(diào)控基因的協(xié)調(diào)表達(dá),從而涉及到如控制胚胎發(fā)育、細(xì)胞生命活動(dòng)和穩(wěn)態(tài)等重要的生理功能。除了正常的生理功能外,核受體家族成員還參與眾多疾病,如癌癥、糖尿病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、哮喘及激素抵抗綜合征等。目前已知的人體核受體共有48個(gè),其中25個(gè)為孤兒受體[1],其內(nèi)源性配體及功能尚不明確。

我們?cè)谇捌诠ぷ髦泻Y選出多個(gè)孤兒受體與肺癌發(fā)生相關(guān),其中包括NR2F2 (chicken ovalbumin upstream promoter transcription factorⅡ)。NR2F2在生命體內(nèi)多個(gè)組織器官中廣泛存在,在胃、小腸、結(jié)腸中有較高的表達(dá)[2],在乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌以及肺癌等多種腫瘤組織中也廣泛存在[3]。NR2F2參與神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育、視覺(jué)細(xì)胞以及血球細(xì)胞的生成。NR2F2的表達(dá)與小鼠出生早期胚胎發(fā)育相關(guān),NR2F2缺乏的幼鼠會(huì)出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育紊亂、出生缺陷或出生致死現(xiàn)象;還有研究表明NR2F2對(duì)于心血管的形成及心血管相關(guān)疾病起到至關(guān)重要的作用[4]。NR2F2在多種生命活動(dòng)中起重要作用,但其具體功能以及參與調(diào)控的靶基因尚不明確。

本研究利用我們前期開發(fā)的轉(zhuǎn)錄因子快速鑒定模型(catTFREontips,TOT)技術(shù)[5],首先快速鑒定出活性受NR2F2影響的下游內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子;然后通過(guò)RNA-seq和全蛋白質(zhì)譜(protein profiling-MS)檢測(cè),進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)NR2F2直接或間接調(diào)控的下游靶基因,并利用實(shí)時(shí)定量PCR (real time quantitative PCR,qPCR)和Western blot對(duì)上述基因進(jìn)行驗(yàn)證,以期探索NR2F2的具體功能。

材 料 和 方 法

主要試劑與材料HEK293T、A549細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。RPMI 1640和1X(10-040-CVR)購(gòu)自美國(guó)Corning公司,Xba1快切酶(FD0685)、Nhe1快切酶(FD0973)和蛋白質(zhì)預(yù)染標(biāo)志物(SM0671)購(gòu)自美國(guó)Fermentas公司,PrimeScript?RT試劑盒(DRR037A)和SYBR?PremixExTaqTM(DRR041A)購(gòu)自日本Takara公司,TransZolUP(ET111-01)購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司,BCA蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒(P0012)和一抗稀釋液(P0023D)購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。

質(zhì)粒構(gòu)建NR2F2質(zhì)粒來(lái)自于美國(guó)貝勒醫(yī)學(xué)院,將Flag-NR2F2質(zhì)粒連接到慢病毒載體pCDH-puro上,軟件設(shè)計(jì)引物序列:正義鏈,5’-TGCTCT-AGAACCACCATGGATTACAAGGAT-3’;反義鏈,5’-ATAGTTTAGCGGCCGCTTATTGAATT-GCCATATACG-3’。

過(guò)表達(dá)穩(wěn)定株的構(gòu)建轉(zhuǎn)染前一天準(zhǔn)備293T細(xì)胞,轉(zhuǎn)染1 h前換為無(wú)血清的培養(yǎng)基6 mL,取2支離心管(1.5 mL)各加入Opti-MEM培養(yǎng)基600 μL,其中一支加入4 μg pCDH-Flag-NR2F2、1 μg pSD和3 μg psPAX2,另一支加入4 μg pCDH-puro、1 μg pSD和3 μg psPAX2,再加入待轉(zhuǎn)染質(zhì)粒和24 μL PEI轉(zhuǎn)染試劑。混勻后靜置20 min,滴加到培養(yǎng)皿中,4～6 h后換為正常培養(yǎng)基,48 h后取病毒上清,感染A549細(xì)胞。

Westernblot待細(xì)胞長(zhǎng)到90%的匯合度時(shí),用SDS裂解液提取全蛋白質(zhì),用BCA法測(cè)蛋白質(zhì)濃度,配置10%的SDS-PAGE凝膠,電泳后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜,一抗稀釋液稀釋,4 ℃孵育過(guò)夜,二抗(2%奶粉溶液稀釋)室溫孵育1 h,用ECL發(fā)光試劑孵育,Las4000儀器掃膜獲取蛋白條帶。

catTFREontip收集細(xì)胞與提取核蛋白:pCDH-NR2F2過(guò)表達(dá)組與pCDH對(duì)照組各準(zhǔn)備兩皿細(xì)胞,胰酶消化收集,細(xì)胞沉淀用低滲溶液重懸,冰置30 min,液氮速凍,-80 ℃冷凍。制備TFRE-easy Tip:分別向T400槍頭中加入乙腈100 μL,靜置1 min,200×g離心1 min。分別向T400槍頭中加入BC200溶液100 μL,200×g離心2 min。DNA和M280磁珠結(jié)合:每個(gè)樣品取20 μL M280磁珠,分別加入0.5 pmol/L (1 μg) TFREDNA,置于4 ℃垂直混勻30 min。加載磁珠:將磁珠用少量體積的BC200重懸并轉(zhuǎn)移至T400槍頭中,分別加入約50 μg核蛋白,并與磁珠充分混勻。冰上靜置10 min后500×g離心,每5 min將離心沉淀的核蛋白重新加入T400槍頭中,并充分混勻磁珠。在去除非特異蛋白質(zhì)之后轉(zhuǎn)移磁珠到新的T400槍頭中。磁珠上酶解:加入胰酶溶液,37 ℃靜置1 h。乙腈洗脫:使用100 μL 50%乙腈(含有0.1%甲酸)洗脫,混勻后振搖5 min,300×g離心3 min,合并2次洗脫液,置于真空干燥儀抽干。將干燥后的肽段重新溶解到0.1%甲酸溶液中,溶解后樣品在QExactivePlus質(zhì)譜儀(美國(guó)ThermoFisher公司)上進(jìn)行分離和質(zhì)譜檢測(cè)。利用MaxQuant對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定量,蛋白質(zhì)和肽段水平錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discover rate,FDR)小于0.01。

全蛋白質(zhì)譜測(cè)定樣品裂解:樣品[(1～1.5)×106個(gè)細(xì)胞]中加入100 μL 8 mol/L尿素裂解液,置于冰上裂解15 min,超聲后用Bradford法定量蛋白質(zhì),取10 μg蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行還原烷基化。FASP酶解:將裂解液加入超濾膜,裝入套管,600 r/min渦旋1 min;裝入套管,14 000×g離心15 min,棄廢液;分別加200μL 8 mol/L尿素裂解液,600 r/min渦旋1 min,14 000×g離心15 min,棄廢液;然后加入200 μL 50mmol/L碳酸氫銨溶液,14 000×g離心15 min,棄廢液;加入胰蛋白酶,37 ℃消化4～6 h。酶解完成后14 000×g離心10 min,收集溶液。將樣本濃縮合并至新離心管中,真空干燥。sRP:將抽干的樣品梯度洗脫到對(duì)應(yīng)的1.5 mL EP管中(表1),置于真空干燥儀抽干,進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。干燥后的肽段重新溶解到0.1%甲酸溶液中,溶解后樣品在QExactivePlus質(zhì)譜儀上進(jìn)行分離和質(zhì)譜檢測(cè)。利用MaxQuant對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定量,蛋白質(zhì)和肽段水平FDR<0.01。

表1 樣品洗脫梯度Tab 1 Gradient of sample solution

RNA-seq對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組各一皿細(xì)胞,1×PBS清洗后分別加入1 mL Trizol試劑,轉(zhuǎn)移到1.5 mL EP管中,吹打混勻,靜置30 min,保存于-8 ℃,由華大基因公司進(jìn)行RNA-seq實(shí)驗(yàn)。

RT-qPCR用Trizol試劑提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄以后進(jìn)行RT-qPCR,上、下游的引物序列見(jiàn)表2。

LC-MS/MS質(zhì)譜待測(cè)樣品通過(guò)NanoLC-MS/MS納升液相高分辨質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)(Easy-nLC1000液相/QExactivePlus高分辨質(zhì)譜儀/Nano-flex ESI離子源,美國(guó)ThermoFisher公司)進(jìn)行分離和檢測(cè)。液相自制預(yù)柱360 μm×2 cm,自制分析柱150 nm×10 cm,填料均為C18 (1.9 μm,120 A),(德國(guó)Dr.Maisch公司)。質(zhì)譜上樣:10 μL上樣緩沖液(5%甲醇+0.2%甲酸)溶解待測(cè)樣品,加入上樣孔中,自動(dòng)進(jìn)樣。

生物信息學(xué)分析利用IBQA (intensity based absolute protein quantification)方法定量計(jì)算蛋白質(zhì)豐度并進(jìn)行FOT(fraction of total protein)校正(將IBAQ值轉(zhuǎn)換為占個(gè)組IBAQ總值的比例),通過(guò)計(jì)算實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的FOT比值(fold-change)篩選顯著性差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。對(duì)于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(質(zhì)控FPKM>1),我們通過(guò)計(jì)算實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的fold-change來(lái)篩選顯著性差異表達(dá)的基因。最后通過(guò)R、DAVID6.8等軟件進(jìn)行分析和繪圖。

表2 RT-qPCR引物Tab 2 RT-qPCR primer

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用Graphpad 5.0軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理,采用雙側(cè)t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

結(jié)合多維蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)NR2F2進(jìn)行功能研究通過(guò)TOT實(shí)驗(yàn)對(duì)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合活性進(jìn)行檢測(cè),尋找NR2F2調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子;篩選顯著性變化的轉(zhuǎn)錄因子,通過(guò)RNA-seq和全蛋白質(zhì)譜來(lái)尋找這些轉(zhuǎn)錄因子下游靶基因,以此深入闡述NR2F2具體功能(圖1A)。我們選用人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549構(gòu)建過(guò)表達(dá)穩(wěn)定株,通過(guò)免疫熒光實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證pCDH-Flag-NR2F2能夠在細(xì)胞核內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)(圖1B)。以空質(zhì)粒pCDH為陰性對(duì)照,pCDH-NR2F2為過(guò)表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞株分別進(jìn)行RT-qPCR和Western blot進(jìn)行過(guò)表達(dá)效率的驗(yàn)證,均證明pCDH-NR2F2組能夠顯著過(guò)表達(dá)目標(biāo)基因(圖1C、1D)。

蛋白質(zhì)非標(biāo)定量質(zhì)譜分析及數(shù)據(jù)可靠性分析以空質(zhì)粒pCDH為陰性對(duì)照,過(guò)表達(dá)pCDH-NR2F2的穩(wěn)定株細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組,分別進(jìn)行TOT-MS和全蛋白質(zhì)譜,上述實(shí)驗(yàn)均完成3次生物學(xué)重復(fù),結(jié)果顯示相關(guān)性較高(r=0.9,圖2A)。同時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的細(xì)胞進(jìn)行RNA-seq,通過(guò)計(jì)算log2(fold-change)數(shù)值展示出轉(zhuǎn)錄組與蛋白質(zhì)組的分布密度(圖2B),顯示轉(zhuǎn)錄組與蛋白質(zhì)組之間的差異性。在完成TOT、全蛋白質(zhì)譜和RNA-seq之后,結(jié)合三維蛋白質(zhì)組學(xué)的數(shù)據(jù)進(jìn)行整合分析(圖2C):通過(guò)TOT數(shù)據(jù)尋找差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子;利用CELLNET網(wǎng)站(http://cahanlab.org/macellnet.html)從轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組的結(jié)果中尋找上述轉(zhuǎn)錄因子對(duì)應(yīng)的差異表達(dá)靶基因;通過(guò)對(duì)這些顯著差異表達(dá)的基因進(jìn)行功能聚類,尋找NR2F2調(diào)控的下游靶基因及信號(hào)通路。

轉(zhuǎn)錄因子-DNA結(jié)合活性的改變及功能分析整合3次TOT實(shí)驗(yàn)結(jié)果,共鑒定出2 891個(gè)蛋白質(zhì),其中519個(gè)為轉(zhuǎn)錄因子(unique peptide>1,1%FDR);篩選3次生物學(xué)重復(fù)中至少出現(xiàn)2次的轉(zhuǎn)錄因子,計(jì)算其iBAQ定量值并進(jìn)行FOT校準(zhǔn),進(jìn)一步篩選fold-change>1.5或<0.67的轉(zhuǎn)錄因子(表3)。上述TFs與DNA的結(jié)合活性可能受到NR2F2的調(diào)控。對(duì)這些差異性表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行GO/KEGG功能聚類分析,發(fā)現(xiàn)NR2F2能夠上調(diào)NF-κB信號(hào)通路和TNF信號(hào)通路等免疫調(diào)控相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子,同時(shí)下調(diào)細(xì)胞周期和TGF-β信號(hào)通路等相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(圖3A),與TGF-β相關(guān)的SMAD家族成員SMAD2/4/5的轉(zhuǎn)錄活性亦受到顯著下調(diào)。

下游靶基因功能分析利用CELLNET網(wǎng)站的轉(zhuǎn)錄因子-靶基因數(shù)據(jù)庫(kù),匹配到上述顯著性變化轉(zhuǎn)錄因子(fold-change>1.5或<0.67)的靶基因,同時(shí)與RNA-seq(FPKM>1,fold-change>1.5或<0.67)和全蛋白質(zhì)譜(fold-change>3或<0.33)的結(jié)果進(jìn)行比較,獲得可能直接或間接受NR2F2調(diào)控的高可信度的下游轉(zhuǎn)錄因子功能聚類分析(圖3B)發(fā)現(xiàn),這些靶基因多被富集到Toll-like通路、T/B cell通路等免疫信號(hào)通路(圖3C)。NF-κB家族功能性亞單位NF-κB2、RELB也都發(fā)生顯著上調(diào)。此外,細(xì)胞周期、P53信號(hào)通路和AMPK信號(hào)通路等均受到顯著下調(diào)(圖3D)?；谝陨辖Y(jié)果,能夠預(yù)測(cè)NR2F2參與免疫以及細(xì)胞周期等功能調(diào)控。

NR2F2對(duì)NF-κB以及細(xì)胞周期信號(hào)通路的調(diào)控作用過(guò)表達(dá)NR2F2之后,多種免疫信號(hào)通路相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子及其下游靶基因顯著上調(diào)(如NF-κB2、RELB),同時(shí)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子調(diào)控、細(xì)胞發(fā)育和腫瘤調(diào)控等多種信號(hào)通路相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子及其靶基因也會(huì)發(fā)生顯著上調(diào)(圖4A)。但與細(xì)胞周期信號(hào)通路相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子及其靶基因發(fā)生顯著下調(diào)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)果,我們?cè)贜R2F2穩(wěn)定株中對(duì)部分靶基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了RT-PCR檢測(cè),結(jié)果證實(shí)NF-κB2、RELB發(fā)生顯著上調(diào)(P<0.05,圖4B)。同時(shí)發(fā)現(xiàn),細(xì)胞周期相關(guān)分子CCND3(cyclinD3)、CDKN1A(P21)均發(fā)生顯著下調(diào)(P<0.05,圖4C),TP53也發(fā)生顯著下調(diào);通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)上述轉(zhuǎn)錄因子在蛋白質(zhì)水平也發(fā)生顯著變化(圖4D)。上述結(jié)果證明NR2F2可能通過(guò)上調(diào)NF-κB2、RELB參與細(xì)胞免疫,同時(shí)通過(guò)下調(diào)CCND3(cyclinD3)、CDKN1A(P21)及TP53等參與細(xì)胞周期相關(guān)的功能調(diào)控。

A:Experiment workflow (over-expression,TOT,RNA-seq and protein profiling-MS);B:Immunofluorescence showed exogenous NR2F2 can be successfully expressed in the nucleus;C and D:Over-expression effects verified by Westren blot and RT-qPCR.(1)P<0.01.

圖1結(jié)合多維蛋白質(zhì)組學(xué)手段對(duì)NR2F2進(jìn)行功能研究
Fig1FunctionsofNR2F2revealedbymulti-dimensionalproteomics

討 論

NR2F2在腦、神經(jīng)及心臟中表達(dá)水平較高,其在神經(jīng)發(fā)育、心血管發(fā)育中起重要作用。NR2F2調(diào)控多種發(fā)育相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子,敲低NR2F2導(dǎo)致心臟房室隔發(fā)育不全[6];胚胎期間,NR2F2在靜脈中高表達(dá),在早期軀干發(fā)育過(guò)程中,Notch信號(hào)通路通過(guò)調(diào)控NR2F2的表達(dá)影響靜脈分化[7];NR2F2在心臟收縮和心臟舒張的過(guò)程中也起重要作用[8];它還能參與部分缺血性損傷修復(fù)[9],與先天性心臟缺失有一定關(guān)系[4]。

研究表明NR2F2的下調(diào)還能抑制成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化進(jìn)程[10]。并且在神經(jīng)干細(xì)胞分化過(guò)程中激活中樞神經(jīng)相關(guān)的調(diào)控基因,在神經(jīng)發(fā)育過(guò)程中,NR2F2常作為早期神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的標(biāo)志物[11]。在小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞中,NR2F2能上調(diào)或下調(diào)一些下游靶基因,如Ccl2、Lcn2、Chgb等[12]。同時(shí)NR2F2還能通過(guò)調(diào)控激素受體來(lái)調(diào)控滋養(yǎng)層的發(fā)育。研究表明,NR2F2能調(diào)控激素的分泌,例如敲低NR2F2導(dǎo)致雄性小鼠睪丸的缺失[13];NR2F2能通過(guò)調(diào)控雌激素受體的表達(dá)來(lái)調(diào)控腎素、高血壓蛋白酶原的表達(dá)[14];它還通過(guò)調(diào)控孕酮旁分泌信號(hào)通路來(lái)調(diào)控子宮基質(zhì)基因的表達(dá),在正常子宮高表達(dá),在子宮內(nèi)膜異位的患者中低表達(dá)[15]。

A:The left depicted the correlation between the 3 biological replicates in the control and over-expression groups in the TFRE experiment,the right one depicted the correlation between the three biological replicates in protein profiling experiment;B:The correlation between the quantified proteome and transcriptome changes of gene product after NR2F2 over-expression is shown as a density scatterplot.The abscissa is the quantitative value of FPKM log2 (fold-change) (OE/control) and the ordinate is the quantitative value of IBAQ log2 (fold-change) (OE/control);C:The workflow of bioinformatics analysis.

圖2 蛋白質(zhì)非標(biāo)定量質(zhì)譜分析及數(shù)據(jù)可靠性分析Fig 2 Protein label-free quantitation mass spectrometry analysis and reliability analysis of data

(續(xù)表3)

ZNF56839.923 725 65NOC4L0.560 841 077NPAS238.737 937 32USF20.546 450 232RFXANK38.074 993 56BATF30.542 585 219ZNF69135.473 407 91TCF200.535 364 725ZNF57429.334 441 79MEF2D0.532 419 262BNC228.941 397 67SP10.528 644 935RUNX127.096 687 44ZFX0.501 259 995CEBPD23.508 901 17PRDM100.498 854 44ZNF14221.081 902 18ZNF3840.498 520 561MNX117.326 784 23RBL10.473 415 631ZNF27714.325 794 26CDC5L0.470 167 586NOC3L14.162 596 23NR0B10.446 067 353MEIS313.396 864 6SMARCC10.440 841 74ATF612.680 530 27FOXK20.438 189 23ZNF63911.024 568 52ZNF1480.431 581 19ZNF64410.955 692 41SP30.421 759 54ZNF3118.818 207 961SMARCE10.399 737 081CLOCK8.086 776 359DMAP10.382 927 449MYNN6.814 762 519NFYB0.377 947 182ZNF4626.501 869 196KLF160.376 397 137HMG20B5.725 960 508RXRA0.344 385 108MLX3.723 472 84ZNF2810.318 014 34DNAJC13.519 318 314ZNF7400.312 795 93ERF2.924 407 439AHCTF10.307 023 69MLXIP2.707 903 301C17orf490.300 712 791NFAT52.494 693 722MTA20.295 886 006STAT22.350 461 302DNAJC10.266 410 262DOT1L2.332 342 494BPTF0.266 213 378PPARG2.323 510 968CUX10.265 309 996STAT12.289 439 083EP4000.264 007 11NFKB22.171 317 223MAZ0.256 503 284HNF1A2.149 364 661ZBTB7A0.250 638 697FOXK10.239 871 816ELF10.239 815 543MTA10.200 178 305ZBTB200.189 641 983BBX0.170 861 87ZZZ30.157 122 025ZBED10.143 521 659ADNP0.117 172 001ZNF1430.108 283 398MYBL20.103 039 666ERF0.084 013 081STAT20.082 657 248RREB10.081 287 78TP530.081 176 277GATAD2B0.075 883 866SIX40.064 688 107CHD60.063 389 145ZNF2170.062 703 166TFDP20.055 106 69FOXJ30.051 144 696

(續(xù)表3)

GATAD2A0.049 993 403ZBTB400.048 236 218MTA30.045 776 393GATAD10.042 329 079ZNF240.027 838 461SMAD40.026 622 923ZNF1460.024 245 678RFX50.023 597 564NR2C10.022 142 84SMAD20.020 478 522TOX40.017 652 834TGIF10.016 159 982ZNF2070.015 770 867FOXP10.011 576 512SPIB0.008 762 001MNT0.008 532 663E2F30.007 659 906

A:The heat-map for dynamic of transcription factors patterns[1.5

圖3轉(zhuǎn)錄因子-DNA結(jié)合活性的改變及功能分析
Fig3ChangeofTFs-DNAbindingactivityandfunctionalanalysis

A:TFs and downstream TGs were regulated by NR2F2;B:Validation of downstream TGs by RT-qPCR;C:Validation of downstream TGs by Western blot.(1)P<0.01.

圖4NR2F2調(diào)控的下游靶基因功能分析
Fig4FunctionalanalysisofdownstreamtargetgenesregulatedbyNR2F2

多項(xiàng)研究表明NR2F2參與腫瘤的發(fā)生[16]。在乳腺癌中,高表達(dá)NR2F2能降低生存期,同時(shí)抑制EMT發(fā)生[17];在結(jié)直腸癌中,miR-382通過(guò)調(diào)控NR2F2表達(dá),從而抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲[18];在子宮肌瘤中和卵巢癌中,NR2F2也表達(dá)異常[19];在胃癌、食管癌中,NR2F2高表達(dá),并與cadherin-11表達(dá)相關(guān)[20]。

綜上所述,NR2F2作為核受體家族成員之一,對(duì)多種生命活動(dòng)起到重要的作用,但其具體功能及其調(diào)控的靶基因尚不明確。本研究利用本實(shí)驗(yàn)室的優(yōu)勢(shì)技術(shù)TOT夠快速直接篩選出顯著表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子;同時(shí)整合轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組等多維蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù),篩選出NR2F2調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子及其下游靶基因;利用RT-qPCR等技術(shù)對(duì)上述潛在分子和通路進(jìn)行驗(yàn)證,系統(tǒng)闡述NR2F2的功能。本研究發(fā)現(xiàn)NR2F2能下調(diào)TGF-β信號(hào)通路相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子,抑制SMAD7的表達(dá)[21],并且與SMAD4發(fā)生相互作用,這些可能與促進(jìn)腫瘤的發(fā)生相關(guān)。進(jìn)一步對(duì)NR2F2調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子分析發(fā)現(xiàn),NR2F2能調(diào)控多個(gè)免疫信號(hào)通路和細(xì)胞周期相關(guān)信號(hào)通路,后期對(duì)下游靶基因的研究也證實(shí)這一點(diǎn)。NF-κB信號(hào)通路參與細(xì)胞的多種生命活動(dòng),NR2F2對(duì)NF-κB的調(diào)控至關(guān)重要,可以利用刺激等手段處理細(xì)胞繼續(xù)研究NR2F2調(diào)控NF-κB信號(hào)通路的機(jī)制。NR2F2對(duì)于細(xì)胞周期的調(diào)控同時(shí)提示該分子能夠調(diào)控腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng),本研究顯示其通過(guò)下調(diào)CCND3(cyclinD3)、CDKN1A(P21)及TP53等參與細(xì)胞周期相關(guān)的功能調(diào)控。此外,本研究所得數(shù)據(jù)顯示NR2F2過(guò)表達(dá)能夠顯著上調(diào)NR2F1(數(shù)據(jù)待發(fā)表)。NR2F2與NR2F1屬于同一家族成員,其結(jié)構(gòu)類似,而NR2F1能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞沉默[22],因此后期還可以驗(yàn)證NR2F2是否通過(guò)與NR2F1協(xié)同作用共同誘導(dǎo)細(xì)胞周期發(fā)生改變。

我們研究孤兒受體功能的方法整合了多維蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù),有別于傳統(tǒng)生物學(xué)研究方法,對(duì)預(yù)測(cè)的可能性結(jié)果進(jìn)行生物學(xué)驗(yàn)證。該方法能夠快速便捷找到目標(biāo)蛋白質(zhì)的下游靶基因、相互作用的蛋白質(zhì)及其調(diào)控的信號(hào)通路,具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。