李利軍，馬英輝，盧美歡

(陜西省微生物研究所，西安 710043)

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin-converting enzyme, ACE)是血管內(nèi)膜細(xì)胞的一種糖蛋白[1]，相對(duì)分子質(zhì)量為120～150 kDa[2]，通過影響腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin angiotensin system, RAS)和激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)(kallikrein-kinin system, KKS)而引起血壓升高[3]。

20世紀(jì)80年代日本就對(duì)ACE抑制肽進(jìn)行了深入的研究。近年來，食源性的ACE抑制肽也成為我國研究的熱點(diǎn)，其中大豆因蛋白質(zhì)含量高，富含人體所需的8種必需氨基酸，成為制備ACE抑制肽的優(yōu)選原料。利用戊糖片球菌發(fā)酵大豆，獲得了低分子量的大豆多肽，對(duì)ACE的抑制率達(dá)65.1%左右[4]。Naoyoshi等[5]從豆?jié){提取物中發(fā)現(xiàn)了具有ACE抑制活性的多肽。劉文穎等[6]利用酶解法從大豆低聚肽中獲得了抗氧化肽和ACE抑制肽，并對(duì)其進(jìn)行了鑒定。

本實(shí)驗(yàn)室前期研究中,從細(xì)菌型豆豉中已經(jīng)篩選到1株枯草芽孢桿菌BS90,能以大豆蛋白為底物，產(chǎn)生ACE抑制肽，相繼研究了制備高抑制活性大豆ACE抑制肽的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，在最佳條件下，培養(yǎng)40 h，大豆蛋白水解度達(dá)到89.1%，ACE抑制率達(dá)81.8%。在本實(shí)驗(yàn)中，通過微生物發(fā)酵大豆，制得中國傳統(tǒng)黃豆醬。經(jīng)過研磨、水溶，采用鹽析、超濾、柱層析對(duì)發(fā)酵制備豆醬中的混合多肽進(jìn)行分級(jí)分離，并分別測(cè)定ACE抑制活性,流程圖見圖1。

圖1 ACE抑制肽純化流程Fig.1 The purification process of ACE inhibitory peptide

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

培養(yǎng)基：斜面培養(yǎng)基：LB；液體種子培養(yǎng)基：1%大豆分離蛋白，2%葡萄糖，0.5%氯化鈉，定容于1000 mL，pH自然。

主要原料：黃豆，購于西安市紫燕食品有限公司。

主要試劑：血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)、馬尿酸(標(biāo)準(zhǔn)品)、馬尿酰-組胺-酰亮氨酸(HHL，標(biāo)準(zhǔn)品)：美國Sigma公司；L-亮氨酸(分析純)；鄰苯二甲醛(OPA，分析純)、三氯乙酸(分析純)、甲醇(分析純)、乙腈(分析純)：天津市富宇精細(xì)化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；安捷倫1260高效液相色譜儀(High Performance Liquid Chromatography, HPLC) 美國安捷倫公司；DHZ-D恒溫?fù)u床 江蘇太倉儀器設(shè)備廠；DH-250A電熱恒溫培養(yǎng)箱 北京科偉儀器公司；Sigma3K15冷凍離心機(jī) 德國Sigma公司；HD-5紫外檢測(cè)儀 上海滬西分析儀器廠有限公司；超濾儀 美國Milli Power 公司；Sephadex G-75凝膠柱(1.6 cm×75 cm)；DEAE高流速瓊脂糖微球a離子交換柱(2.6 cm×20 cm)；C18柱(4.6 mm×250 mm)。

1.3 方法

1.3.1 黃豆醬制作

將保藏菌株BS90斜面活化24 h，接種于液體種子培養(yǎng)基中，溫度35 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)18 h。

取黃豆1000 g，用自來水浸泡10 h，空去水分，入高壓滅菌鍋蒸煮：1.1～1.3 Pa滅菌20 min，自然冷卻后接種上述培養(yǎng)的液體種子，攪拌均勻入恒溫箱32 ℃培養(yǎng)42 h，檢測(cè)其水分、蛋白酶活力。然后拌15%鹽水，補(bǔ)足水分為62%，食鹽為6%，置于40 ℃發(fā)酵15天，黃豆醬制作完成。

1.3.2 ACE抑制肽粗品制備

稱取黃豆醬50 g,用500蒸餾水溶解、過濾，得到ACE抑制肽粗品。

1.3.3 ACE抑制肽的分離純化

將ACE抑制肽粗品進(jìn)行8000 r/min 離心5 min，取上清液，30 ℃磁力攪拌，緩緩加入50%硫酸銨，溶解后置于4 ℃進(jìn)行蛋白沉淀過夜。10000 r/min離心10 min，棄上清液，沉淀用pH為7.4的緩沖液(Tris-HCl)溶解，置于4 ℃透析過夜。取出后進(jìn)行8000 r/min離心5 min，對(duì)上清液進(jìn)行超濾，超濾膜依次采用30，10，3，1 k，超濾后進(jìn)行超濾管濃縮，高效液相色譜測(cè)定各個(gè)組分的活性，將活性最好的組分進(jìn)行后期的色譜柱分離。

DEAE高流速瓊脂糖微球a離子交換柱分離：平衡液為雙蒸水，用NaCl(0.1～0.8 mol/L)、緩沖液進(jìn)行線性梯度洗脫，洗脫速度為 1.0 mL/min，上樣量為8 mL，在 280 nm 下收集各峰，檢測(cè)活性，收集活性最高的組分備用。

Sephadex G-75 凝膠柱分離純化：洗脫液為Tris-HCl，洗脫速度為 0.1 mL/min，上樣量為20 mL，在280 nm下收集各峰，檢測(cè)活性，收集活性最高的組分于冰箱冷凍保存。

1.3.4 檢測(cè)方法

1.3.4.1 蛋白酶活力測(cè)定

按SB/T 10317—1999《蛋白酶活力測(cè)定法》執(zhí)行。

1.3.4.2 水分測(cè)定

按GB/T 5009.3-2003執(zhí)行。

1.3.4.3 氨基酸態(tài)氮、總酸、NaCl測(cè)定

按GB/T 5009.40—2000規(guī)定執(zhí)行。

1.3.4.4 ACE活性檢測(cè)方法[7]

發(fā)酵液中ACE抑制活性測(cè)定采用高效液相色譜法，其檢測(cè)條件：C18色譜柱(4.6 mm×250 mm)；檢測(cè)波長228 nm；柱溫20 ℃；流動(dòng)相：水∶甲醇為40∶60(均含0.1%甲酸，V/V)；流速0.8 mL/min；進(jìn)樣量10 μL。

馬尿酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：分別配制馬尿酸濃度為0.05，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，過0.22 μm的濾膜后，采用高效液相色譜法檢測(cè)馬尿酸含量，以峰面積(y)為縱坐標(biāo)，馬尿酸濃度(x)為橫坐標(biāo)繪制馬尿酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品中馬尿酸的測(cè)定： 50 μL HHL溶液、20 μL發(fā)酵上清液、50 μL ACE溶液，于37 ℃恒溫水浴中反應(yīng)30 min，加入120 μL 乙腈終止反應(yīng)，振蕩10 s，離心10 min，取上清液10 μL過0.22 μm的濾膜，待測(cè)。以緩沖液替代反應(yīng)體系中的發(fā)酵上清液為空白對(duì)照組。

2 結(jié)果與分析

2.1 中性蛋白酶活力測(cè)定結(jié)果

中性蛋白酶活力測(cè)定結(jié)果見表1。

表1 中性蛋白酶活力測(cè)定結(jié)果Table 1 Determination of neutral protease activity

由表1 可知，曲料生長過程中，水分逐漸遞減，蛋白酶活力前期隨著菌絲生長，酶活力增加，在培養(yǎng)28～32 h時(shí)達(dá)到最高，之后水分遞減，酶活力也隨之下降。

2.2 黃豆醬理化指標(biāo)測(cè)定

黃豆醬理化指標(biāo)測(cè)定見表2。

表2 黃豆醬理化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果Table 2 Physical and chemical indexes test results of soybean paste

由表2可知，所制作豆醬符合國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 24399—2009。

2.3 ACE抑制肽液相測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 馬尿酸標(biāo)品液相色譜圖與標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The HPLC and standard curve of hippuric acid

由圖2可知，馬尿酸的RT=6.472 min，峰面積與馬尿酸濃度曲線擬合相關(guān)系數(shù)R2=1.0，說明該保留時(shí)間處的峰面積能夠反映馬尿酸的濃度大小。

2.4 超濾結(jié)果

將對(duì)硫酸銨沉淀、透析后的混合多肽進(jìn)行超濾，依次分別使用30，10，3 k超濾膜進(jìn)行超濾。超濾后，將混合多肽分子量分為4段：>30 k，30～10 k，10～3 k，<3 k。多肽含量和ACE抑制活性見圖3。

圖3 不同分子量區(qū)間的多肽含量與ACE抑制率Fig.3 The polypeptide content and ACE inhibitory rates of different molecular weight intervals

由圖3可知，10 k以上組分的多肽含量相對(duì)較多，但ACE抑制活性隨著分子量的增大逐漸減小，各組分ACE抑制率分別為22.8%，57.2%，98.2%，78.88%。經(jīng)超濾分級(jí)去除了部分沒有 ACE抑制活性的長肽段，使 ACE 抑制肽主要富集在10 k以下分子量區(qū)間，3～10 k分子量的ACE抑制率最大，3 k以下組分的ACE抑制活性也在75%以上，從本結(jié)果來看，具有ACE抑制活性的多肽主要為短肽和中短肽，并非水解度越高，ACE抑制活性也越高。這與文獻(xiàn)[8-11]報(bào)道的ACE抑制肽主要集中在3 k以下的組分有差別，這有待于進(jìn)一步的研究。將收集的3～10 k分子量組分繼續(xù)進(jìn)行DEAE瓊脂糖微球交換柱的分離。

2.5 DEAE高流速瓊脂糖微球a離子交換柱

圖4 3～10k組分的離子交換色譜圖Fig.4 Ion exchange chromatogram of 3～10 k components

由圖4可知，多肽3～10 k組分上樣量20 mL后，分別使用0.1～0.8 mol/L的氯化鈉進(jìn)行洗脫，流速為1.0 mL/min, 1號(hào)峰為0.1 mol/L氯化鈉洗脫，最大吸光值為0.25，是3～10 k混合多肽中的最大組分，ACE抑制率也是最高的(見圖5)。組分IV采用0.5 mol/L的氯化鈉洗脫后，組分的ACE活性也達(dá)到16.8%。但由于組分洗脫后未經(jīng)過濃縮，所以ACE抑制率都相對(duì)較低。但可以確定，采用0.1 mol/L氯化鈉洗脫組分I具有相對(duì)較高的ACE抑制活性，并對(duì)組分I進(jìn)行下一步的凝膠柱分離。

圖5 離子交換柱洗脫組分的ACE抑制活性Fig.5 ACE inhibitory activity of ion exchange column elution components

2.6 Sephadex G-75 凝膠柱分離純化

圖6 組分DI的凝膠色譜圖Fig.6 The gel chromatogram of DI components

由圖6可知，組分DI經(jīng)過G-75凝膠層析后，獲得4個(gè)峰。對(duì)收集的各組分進(jìn)行ACE抑制活性測(cè)定。見圖7。組分DGIII的ACE抑制活性是最高的，抑制率為13.62%/40 μL。并對(duì)組分DGIII進(jìn)行凍干濃縮后，ACE抑制活性為(98.3±1.24)%，IC50為0.08 mg/mL。

圖7 凝膠色譜分離各組分的ACE抑制活性Fig.7 The ACE inhibitory activity of each component separated by gel chromatography

3 結(jié)論與展望

以大豆為底物，采用微生物發(fā)酵法制備中國傳統(tǒng)黃豆醬，經(jīng)過研磨、提取獲得具有ACE抑制活性的多肽，通過超濾發(fā)現(xiàn)，分子量區(qū)間3～10 k的多肽ACE活性抑制率最高；并對(duì)其組分依次進(jìn)行了DEAE瓊脂糖微球a的柱層析和Sephadex G-75 凝膠柱分離，從而獲得了組分DGIII為純化后的ACE抑制肽，進(jìn)行濃縮凍干后，測(cè)得ACE活性抑制率為(98.3±1.24)%，IC50為0.08 mg/mL，高于文獻(xiàn)報(bào)道的ACE抑制率[12-14]?，F(xiàn)有的文獻(xiàn)都已證實(shí)ACE抑制肽為一類小分子量多肽，但繁瑣的分離純化步驟耗時(shí)耗力，成本較高。但如果能夠直接食用，則比較簡(jiǎn)單。由此來看，開發(fā)具有降壓作用的食品，黃豆醬無疑是最好的產(chǎn)品，需要注意的是黃豆醬中的食鹽一般都比較高，也是為了保證產(chǎn)品質(zhì)量，避免黃豆醬變質(zhì)。因而開發(fā)具有降壓作用的黃豆醬應(yīng)降低食鹽含量，既可以減少NaCl對(duì)生物活性物質(zhì)的抑制作用，還可以方便群眾增加攝食的需求。