廖曉峰,于榮

(1.東華理工大學 化學與生物材料學院,南昌 330038；2.東華理工大學 水資源與環(huán)境工程學院,南昌 330038)

鰻魚是我國重要的經濟魚類，近年來由于福建、廣東、江蘇、浙江等鰻魚主產地水質惡化，很多養(yǎng)殖企業(yè)轉移到江西省，是江西省重要的出口創(chuàng)匯渠道之一。鰻魚養(yǎng)殖與加工企業(yè)在江西省各地都有，年產烤鰻數萬噸。但鰻魚加工企業(yè)都面臨大量鰻魚加工剩余的下腳料無法處理，下腳料因為江西省內沒有廠方收購，只有賣給沿海一帶收購方處理，但路途遠，該下腳料又含有高蛋白、高脂肪，外運難以保質保鮮，很多下腳料沒有得到有效、合理的利用，還會造成環(huán)境污染，浪費資源，也影響環(huán)境，因此鰻魚下腳料綜合處理問題日益迫切，目前江西省內還是空白。本項目對鰻魚下腳料進行綜合處理，生產復合氨基酸、鰻魚蛋白粉等產品，可以作為食品鮮味劑原料，也可以作為高級醬油原料。鰻魚粉含多種氨基酸，特別是鮮味氨基酸含量高，且鈣含量非常高，適合制作中老年人的強化鈣，兒童的調味品基料，例如兒童強化醬油、中老年強化醬油、強化鮮味粉、鮮味湯料、鰻魚精等產品，提高資源利用率，保護環(huán)境[1-4]。

鰻魚下腳料綜合處理研究在江西省還是一個空白，國內外對鰻魚研究主要集中在鰻魚養(yǎng)殖及加工方面?？决犐a后的下腳料由于富含高蛋白，利用蛋白質酶解技術對鰻魚下腳料進行酶解，再經過均質、噴霧干燥等工藝，生產復合氨基酸、鰻魚蛋白粉等產品，既可以為企業(yè)解決環(huán)境污染的后顧之憂，又可以為企業(yè)帶來新的經濟增長點，還可以促進就業(yè)和帶動鰻魚養(yǎng)殖及加工業(yè)的發(fā)展。

1 理論依據與實驗基礎、研究目的

鰻魚肉蛋白富含賴氨酸及精氨酸，重組胰蛋白酶是一種絲氨酸蛋白酶，可特異切割賴氨酸及精氨酸C末端肽鍵，是由重組大腸桿菌表達生產，氨基酸序列與豬胰腺來源的胰蛋白酶完全一致，重組豬胰蛋白酶具有與動物源性豬胰蛋白酶相同的酶學性質。重組胰蛋白酶分子量為24 kD，最適pH為7.0～11.0。前期實驗結果表明，重組胰蛋白酶對鰻魚蛋白水解最好，前期實驗通過幾種不同蛋白酶對鰻魚下腳料的酶解實驗結果證實胰蛋白酶酶解效率最好。實驗選用上海雅心生物技術有限公司生產的重組胰蛋白酶為酶解制劑，目的是研究酶解的最佳工藝條件及產品中蛋白質和鈣的含量測定方法。

2 材料與方法

2.1 儀器

CL-3型恒溫加熱磁力攪拌器 上海梅穎浦儀儀器有限公司；BS223S分析天平 賽多利斯電子天平儀器有限公司；UV751GD紫外分光光度計 上海元析儀器有限公司；WFX-120原子吸收分光光度計 北京百分瑞利儀器有限公司。

2.2 原料及試劑

鰻魚帶肉骨：選取新鮮無腐敗的鰻魚帶肉骨作原料，江西華誼食品有限公司提供；重組胰蛋白酶：上海雅心生物技術有限公司(要求酶活在20萬U/g以上)。

2.3 制備工藝[5]

2.3.1 工藝流程

鰻魚帶肉骨→預處理→凈鰻魚帶肉骨→烘干→干鰻魚帶肉骨→粉碎、均質→鰻魚肉骨粉→水提→鰻魚肉骨粉料液→酶解→酶解液→均質→噴霧干燥→成品。

2.3.2 工藝過程

2.3.2.1 預處理

鰻魚帶肉骨經篩選、整理后,于50 ℃溫水浸泡30 min，去除雜質，清水洗凈，瀝干待用。

2.3.2.2 烘干

預處理后的原料置于干燥箱中干燥，干燥溫度為80 ℃，時間5～6 h。

2.3.2.3 粉碎、均質

干燥好的原料粉碎，粉碎后再加入10倍的蒸餾水調勻，高壓均質機均質，得到鰻魚骨粉料液。

2.3.2.4 酶解

均質后的料液放入酶解器中，預熱至45 ℃后恒溫，用20%的氫氧化鈉調節(jié)pH至7.0～9.0左右，再按2%～5%投料量將重組胰蛋白酶投入(添加胰蛋白酶的目的是利用胰蛋白酶將鰻魚肉蛋白水解成氨基酸，得到高含鈣的復合氨基酸混合液，再經均質、噴霧干燥等工藝生產蛋白鈣及蛋白粉產品，通過前期實驗研究表明胰蛋白酶對鰻魚肉的酶解效率高)，攪拌20 min，然后加熱至60～80 ℃(10 min),使原料酶解。

2.3.2.5 噴霧干燥

將均質后的酶解液經過噴霧干燥，得到產品。

2.3.2.6 蛋白質含量的測定[6]

將酶解液在波長為215 nm和225 nm的紫外分光光度計下分別測定其吸光值，計算蛋白質提取率。

本次實驗采用215 nm和225 nm的吸收差法測定蛋白質，用215 nm和250 nm外光吸收差值與單一波長測定相比，可減少誤差。

蛋白質濃度(mg/mL)=0.144×(A215-A225)。

測定區(qū)間：20～100 μg蛋白質/mL。

蛋白質提取率(%)=原料中蛋白質含量/酶解液中蛋白質含量×100/100。

3 結果分析

3.1 單因素實驗對酶解結果的影響[7-11]

3.1.1 加酶量的影響

稱取原料20 g，加入10倍水研磨，后按2%，3%，4%，5%投料量將胰蛋白酶投入，按2.3.2.4的方法酶解，45 ℃恒溫,反應時間為60 min,將pH調節(jié)到8.0的條件下進行酶解，結果見表1。

表1 加酶量對酶解過程的影響Table 1 The effect of enzyme dosage on the enzymatic hydrolysis process

由表1可知，隨著加酶量的增加，蛋白質的提取率下降，在加酶量為2%時蛋白質的提取率最高，加入過量的酶可能導致蛋白質降解。經測定，原料中蛋白質平均含量為32.42%，但在原料預處理過程中蛋白質有所損失，胰蛋白酶是一種絲氨酸蛋白酶，可特異切割賴氨酸及精氨酸C末端肽鍵，故胰蛋白酶在對蛋白質酶解過程中酶解不完全，不能完全酶解原料中的蛋白質，造成蛋白質提取率不是很高，但能滿足生產要求。

3.1.2 溫度的影響

稱取原料20 g，加入10倍水研磨，按3.1.1的最佳結果按2%投料量將重組胰蛋白酶投入，按2.3.2.4的方法酶解，恒溫40，45，50，55 ℃,反應時間為30 min,將pH調節(jié)到8.0的條件下進行酶解，結果見表2。

表2 溫度對酶解過程的影響Table 2 The effect of temperature on the enzymatic hydrolysis process

由表2可知，重組胰蛋白酶活性溫度范圍是40～45 ℃，比一般的酶活性溫度要高，當溫度為45 ℃時，蛋白質的提取率最大，溫度再升高，酶分子結構發(fā)生變化，分子間碰撞加劇，導致酶分子結構破壞，蛋白質的提取率下降。

3.1.3 時間的影響

稱取原料20 g，加入10倍水研磨，按2%投料量將胰蛋白酶投入，按2.3.2.4的方法酶解，恒溫45 ℃(3.1.2的最佳結果),反應時間為1，2，3，4 h,將pH調節(jié)到8.0的條件下進行酶解，結果見表3。

表3 反應時間對酶解過程的影響Table 3 The effect of reaction time on the enzymatic hydrolysis process

由表3可知，當反應時間達到3 h時酶解基本完全，此時的提取率最高。反應時間過長，可能導致水解蛋白質變性分解，當反應時間達到3 h時最佳。

3.1.4 pH值的影響

稱取原料20 g，加入10倍水研磨，后按3.1.1的最佳結果按2%投料量將重組胰蛋白酶投入，按3.1.2的方法恒溫45 ℃(3.1.2的最佳結果),反應時間為3 h(3.1.3的最佳結果),將pH調節(jié)到6.0，7.0，8.0的條件下進行酶解，結果見表4。

表4 pH值對酶解過程的影響Table 4 The effect of pH on the enzymatic hydrolysis process

由表4可知，pH值在8.0時蛋白質的提取率最大，隨著pH值再增大，重組胰蛋白酶結構會發(fā)生改變，導致重組胰蛋白酶活性減小。

3.2 正交實驗

正交實驗因素水平見表5，正交實驗結果見表6。

表5 實驗因素水平表Table 5 Table of experimental factors and levels

表6 正交實驗結果Table 6 The experimental results

由表6可知，極差值R為因素A(0.25)，B(0.33)，C(0.26)，故影響蛋白質提取量的因素的主次關系為B(反應溫度)>C(pH值)>A(反應時間)。比較這9次實驗的結果， 第5次實驗的蛋白質的提取率29.7%最大，因此A2B2C3是最好的搭配。

3.3 酶解液鈣含量的測定

方法:石墨爐火焰原子吸收分光光度法。

儀器：WFX-200石墨爐火焰原子分光光度儀，北京百分瑞利儀器有限公司。

3.3.1 原理

樣品經濕法消化后，導入原子吸收分光光度計中，經火焰原子化后，吸收422.7 nm處的共振線，其吸收量與含量成正比，與標準系列比較定量。

3.3.2 主要試劑

混合酸消化液：硝酸與高氯酸比為4∶1。

2%氧化鑭溶液：稱取25 g氧化鑭(純度>99.99%)，加75 mL鹽酸于1000 mL容量瓶中，加去離子水稀釋至刻度。

鈣標準溶液：精確稱取1.2486 g碳酸鈣(純度>99.99%),加50 mL去離子水，加鹽酸溶解，移入1000 mL容量瓶中，加2%氧化鑭稀釋至刻度。貯存于聚乙烯瓶內，4 ℃保存。此溶液每毫升相當于500 μg鈣。

鈣標準使用液：鈣標準使用液的配制見表7。

表7 鈣標準使用液配制Table 7 The preparation of calcium standard liquid

鈣標準使用液配制后，貯存于聚乙烯瓶內，4 ℃保存。

3.3.3 測定

將鈣標準使用液分別配制不同濃度系列的標準稀釋液(見表8)，測定操作參數見表9。

表8 不同濃度系列標準稀釋液的配制方法Table 8 The preparation method of different concentration series of standard diluent

表9 測定操作參數Table 9 Measurement of operating parameters

3.3.4 標準曲線

以各濃度系列標準溶液與對應的吸光度繪制標準曲線,鈣離子的標準曲線見表10和圖1。

表10 鈣離子標準曲線Table 10 The standard curve of calcium ion

圖1 鈣離子的標準曲線Fig.1 The standard curve of calcium ion

由圖1可知，線性相關系數為0.9996。測定樣品液及空白液A,由標準曲線查出濃度值(c及c0)，再按下式計算。

式中：X為樣品中元素的含量，mg/100 g；c為測定用樣品中元素的濃度，μg/mL；c0為試劑空白液中元素的濃度，μg/mL；V為樣品定容體積，mL；f為稀釋倍數；m為樣品質量。

3.3.5 樣品中鈣離子含量的測定

將酶解液定容至50 mL，從中取1 mL稀釋至10 mL，用原子吸收法測定鈣離子，所得數據見表11。

表11 鈣離子含量的測定Table 11 The determination of calcium ion content

由表11可知，數據計算可以得出鈣的平均含量為47.98 μg/mL。

4 結論

采用鰻魚帶肉骨作為原料，預處理后用胰蛋白酶水解法提取生物蛋白鈣。實驗結果表明：酶解的最佳條件是在pH為8.0、溫度為45 ℃、加酶量為2%、酶解時間為3 h的條件下進行實驗。利用紫外分光光度法在215 nm和225 nm的差值下測定產品中蛋白質的含量，用石墨爐原子吸收法測定產品中鈣的含量，產品蛋白質含量可達29.7%，鈣的含量為4.79%。

鰻魚骨是一種廉價的可再生資源, 從鰻魚骨中提取復合氨基酸有較大的經濟價值。產品中蛋白質含量可達27.5%～35%左右，鈣的含量也非常高，并且是生物鈣，有利人體的吸收。產品可以作為食品鮮味劑原料，也可以作為高級醬油原料，含多種氨基酸，特別是鮮味氨基酸含量高，且鈣含量非常高，適合制作中老年人的強化鈣、兒童的調味品基料，例如兒童強化醬油、中老年強化醬油、強化鮮味粉、鮮味湯料、鰻魚精等產品。