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多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)脫髓鞘為特點(diǎn)的自身免疫性疾病，多發(fā)于青壯年，急性或亞急性起病，可出現(xiàn)感覺異常、視覺障礙、運(yùn)動(dòng)障礙、疲勞、疼痛和認(rèn)知障礙等多種臨床表現(xiàn)[1-2]。由遺傳和環(huán)境等多種因素引起，其中人類白細(xì)胞抗原(HLA)多態(tài)性是一個(gè)最重要的遺傳因素。HLA基因位于6號(hào)染色體短臂上6p21.3區(qū)，由一系列緊密連鎖的基因座組成，在抗原呈遞、免疫應(yīng)答中起著重要的作用。目前研究較多的是DQB1、DPB1、DRB1等Ⅱ類基因，主要集中于HLA第二外顯子，具有高度的多態(tài)性，與多發(fā)性硬化疾病的易感性密切相關(guān)[3-4]。本研究通過高分辨分型的方法檢測(cè)HLA-DQB1、HLA-DPB1等位基因多態(tài)性在內(nèi)蒙古自治區(qū)蒙古族、漢族人群多發(fā)性硬化病人中的分布情況，探討蒙古族、漢族人群MS病人HLA-DQB1、DPB1等位基因多態(tài)性的特點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年3月—2017年3月在我院及合作醫(yī)院就診的蒙古族MS病人26例、漢族MS病人43例，分別納入蒙古族MS組、漢族MS組。蒙古族MS組，男10例，女16例；年齡28歲～45歲(35.4歲±6.3歲)；病程1年～12年(4.3年±1.2年)。漢族MS組，男14例，女29例；年齡26歲～49歲(35.9歲±6.9歲)；病程2年～11年(4.6年±1.5年)。另選43名健康體檢者為對(duì)照組，其中男17名，女26名，年齡25歲～46歲(36.2歲±6.5歲)。蒙古族MS組、漢族MS組病人年齡、性別比例等一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。所有病人均符合2010年的MacDonald臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，排除其他與組織相容性抗原有關(guān)的疾病。

1.2 方法 基因組DNA的提?。翰捎帽椒?氯仿抽提外周血中的基因組DNA，步驟如下：①采集病人外周血，加入5倍體積的三蒸水裂解8 min，離心，棄去上清；②加入DNA細(xì)胞裂解液；③加入蛋白酶K，65 ℃水浴30 min；④加入苯酚/氯仿/異戊醇混合液，劇烈震蕩，離心，將上清移至新的離心管中；⑤添加預(yù)冷的無水乙醇，離心，棄上清；⑥用預(yù)冷的75%乙醇洗滌沉淀，干燥，用三蒸水溶解。

等位基因HLA-DQB1、HLA-DPB1測(cè)序：參照AlleleSEQR DQB1定型試劑盒(美國Atria Genetics公司)采用SBT法對(duì)HLA-DQB1、HLA-DPB1進(jìn)行高分辨率分型，步驟如下：①聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，8 μL HLA-DQB1/HLA-DPB1引物混合物，2μL基因組DNA，0.1 μL Amplitaq Gold酶。HLA-DQB1基因擴(kuò)增條件為預(yù)變性95 ℃，10 min；95 ℃，20 s；60 ℃，30 s；72 ℃，2 min，36個(gè)循環(huán)；HLA-DPB1基因擴(kuò)增條件為預(yù)變性95 ℃，10 min；95 ℃，20 s；59 ℃，30 s；72 ℃，2 min，36個(gè)循環(huán)。②PCR產(chǎn)物純化，將PCR產(chǎn)物用ddH2O稀釋3倍后，加入3 μL ExoSAP-IT，37 ℃孵育15 min后，80 ℃孵育15 min。③反應(yīng)結(jié)束后，自動(dòng)測(cè)序儀(ABI3100)測(cè)序。

基因分型：根據(jù)測(cè)序所得核苷酸序列，與HLA數(shù)據(jù)庫最新公布的HLA-DQB1、HLA-DPB1等位基因序列進(jìn)行比對(duì)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。直接計(jì)數(shù)法計(jì)算基因頻率(%)，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，當(dāng)理論數(shù)<5時(shí)采用Fisher精確概率法檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 DQB1等位基因頻率 檢測(cè)到13個(gè)DQB1等位基因片段，漢族MS組HLA-DQB1*0302基因頻率明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，HLA-DQB1*0602基因頻率明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，但蒙古族MS組、漢族MS組HLA-DQB1*0302、HLA-DQB1*0602基因頻率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 3組DQB1等位基因頻率比較 例(%)

2.2 DPB1等位基因頻率 檢測(cè)到12個(gè)DPB1等位基因片段，蒙古族MS組、漢族MS組HLA-DPB1*0501基因頻率明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，蒙古族MS組、漢族MS組HLA-DPB1*0501基因頻率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表2。

表2 3組DPB1等位基因頻率比較 例(%)

3 討 論

目前MS發(fā)病機(jī)制尚不明確，與遺傳、環(huán)境、免疫等多種因素有關(guān)，以急性、亞急性起病為主，急性發(fā)作期外周血中輔助性T細(xì)胞和抑制性T細(xì)胞出現(xiàn)異常，說明MS疾病與免疫因素有關(guān)[5]。在所有的遺傳因素中，HLA與MS關(guān)聯(lián)最為密切。HLA是一個(gè)復(fù)雜的遺傳多態(tài)性系統(tǒng)，包括Ⅰ類、Ⅱ類、Ⅲ類區(qū)域，Ⅰ類、Ⅱ類區(qū)域是具有高度多態(tài)性的區(qū)域，可產(chǎn)生不同的基因型組合或單倍型。Ⅰ類區(qū)域包括A、B、C等HLA位點(diǎn)，Ⅱ類區(qū)域主要包括DP、DQ、DR等亞區(qū)。HLA-Ⅰ類基因編碼的蛋白主要作用是向CD8+T淋巴細(xì)胞呈遞抗原，制約特異性T淋巴細(xì)胞的效應(yīng)功能。HLA-Ⅱ類基因編碼的蛋白主要作用是向CD4+T淋巴細(xì)胞呈遞抗原，制約輔助性T淋巴細(xì)胞的識(shí)別功能。

研究發(fā)現(xiàn)，我國南方漢族人群MS與HLA-DQB1*0502相關(guān)，與HLA-DQB1的0601和0602無關(guān)[6]，且MS易感基因可能存在性別差異，可能與男性激素的保護(hù)作用有關(guān)。Field等[7]發(fā)現(xiàn)與MS疾病獨(dú)立相關(guān)的HLA-DRB1*1501、HLA-DRB1*0301等7個(gè)SNPs，HLA-DPB1位于常見的Ⅱ類基因HLA-DRB1、DQA1和DQB1的著絲粒上，在重組時(shí)與DQA1和DQB1等基因分離，并且不受DRB1、DQA1和DQB1基因調(diào)節(jié)的影響。HLA等位基因頻率在不同地域和種族中的分布具有很大的差異，可能與遺傳背景、地理環(huán)境有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)了13個(gè)DQB1和12個(gè)DPB1等位基因片段，其中起主要作用的是HLA-DPB1*0501、HLA-DQB1*0602、HLA-DQB1*0302三個(gè)等位基因位點(diǎn)。Fernández等[8]發(fā)現(xiàn)，等位基因DQB1*0602與MS病人明顯相關(guān)，這與本研究結(jié)果相似，說明HLA-DQB1*0602可能是MS病人的易患基因。本研究還發(fā)現(xiàn)蒙古族、漢族MS病人HLA-DQB1*0302基因頻率明顯低于對(duì)照組，說明HLA-DQB1*0302可能是MS的抵抗基因。日本MS病人與DPB1*0301關(guān)系密切[9]，此外還發(fā)現(xiàn)攜帶DPB1*0501基因的人群對(duì)自身免疫性疾病的易感性高，包括早發(fā)的甲狀腺炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、1型糖尿病等。本研究共發(fā)現(xiàn)了12個(gè)DPB1等位基因片段，蒙古族、漢族MS病人HLA-DPB1*0501等位基因頻率明顯高于對(duì)照組，說明HLA-DPB1*0501可能是MS的易患基因。吳曉牧等[10]發(fā)現(xiàn)南方漢人 MS 可能與HLA-DPB1*2101有關(guān)，與HLA-DPB1*0501無關(guān)，與本研究結(jié)果不同。

本研究通過高分辨分型的方法探討了內(nèi)蒙古地區(qū)蒙古族、漢族MS病人與HLA-DQB1、DPB1等位基因多態(tài)性的關(guān)系，蒙古族、漢族人群多發(fā)性硬化可能與人類白細(xì)胞抗原HLA-DQB1*0302、HLA-DQB1*0602和HLA-DPB1*0501有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)蒙古族、漢族MS病人的DQB1、DPB1多態(tài)性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，推測(cè)起主要作用的是遺傳因素，地理環(huán)境可能有一定影響。