李欣欣 張大偉 張靜 周沾 楊雪嬌 蘇春陽 孫平

【摘要】 目的：檢測乳腺癌組織內(nèi)TNFR1的表達，并分析與臨床病理因素的相關(guān)性。方法：選取2015年9月-2016年1月牡丹江腫瘤醫(yī)院乳腺外科手術(shù)切除的30例乳腺癌標(biāo)本為試驗組，距離腫瘤邊緣1 cm處的癌旁組織為對照組。應(yīng)用Real-time PCR和免疫組織化學(xué)技術(shù)分別檢測TNFR1 mRNA和蛋白的表達。結(jié)果：Real-time PCR檢測顯示，試驗組TNFR1 mRNA的表達量為（0.07±0.03），高于對照組的（0.03±0.01），比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；免疫組織化學(xué)染色顯示，試驗組TNFR1蛋白呈棕黃色，主要分布于細胞質(zhì)內(nèi)，呈彌漫性或局灶性分布，對照組TNFR1蛋白表達不明顯；試驗組TNFR1蛋白表達為（145.36±3.46），明顯高于對照組的（119.69±14.28），比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；乳腺癌內(nèi)TNFR1蛋白的表達與患者年齡、腫瘤大小均無關(guān)（P>0.05），而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期均密切相關(guān)（P<0.05）。結(jié)論：乳腺癌內(nèi)TNFR1的表達可作為判斷乳腺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的重要標(biāo)記物。

【關(guān)鍵詞】 乳腺癌； TNFR1； 臨床病理因素

【Abstract】 Objective：To detect TNFR1 expression in breast cancer tissues and analyze its correlation with clinicopathological factors.Method：A total of 30 breast cancer specimens from breast surgery in Mudanjiang Cancer Hospital from September 2015 to January 2016 were selected as experimental group，and the adjacent tissues 1 cm from the edge of the tumor as control group.TNFR1 mRNA and protein expression were detected by Real-time PCR and immunohistological staining respectively.Result：Real-time PCR detection showed that the expression of TNFR1 mRNA in experimental group was（0.07±0.03），which was higher than （0.03±0.01） in control group，the difference was statistically significant（P<0.05）.Immunohistochemical staining showed that the TNFR1 protein in experimental group was brown and yellow，mainly distributed in the cytoplasm，showing diffuse or focal distribution，and the expression of TNFR1 protein in control group was not obvious.The expression of TNFR1 protein in experimental group was（145.36±3.46），which was significantly higher than （119.69±14.28） in control group，the differences was statistically significant（P<0.05）.The expression of TNFR1 protein in breast cancer was not associated with age and tumor size（P>0.05），but was closely related to lymph node metastasis and clinical stage（P<0.05）.Conclusion：The expression of TNFR1 in breast cancer can be used as an important marker for the recurrence and metastasis of breast cancer.

【Key words】 Breast cancer； TNFR1； Clinicopathological factor

First-authors address：Mudanjiang Medical University，Mudanjiang 157011，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.24.009

腫瘤壞死因子受體1（Tumor necrosis factor receptor 1，TNFR1）是分子量為55 kD的Ⅰ型跨膜受體，與腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）結(jié)合后可介導(dǎo)炎癥、細胞增殖、凋亡等多種生物學(xué)效應(yīng)[1-3]。TNFR1不僅存在于巨噬細胞、單核細胞等正常細胞表面，也存在于血液系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等多種腫瘤細胞表面[4-6]，但乳腺癌內(nèi)TNFR1的表達及臨床意義尚不明確。本研究將采用Real-time PCR和免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測乳腺癌和癌旁組織內(nèi)TNFR1 mRNA和蛋白質(zhì)的表達，并從蛋白水平探討TNFR1的表達與乳腺癌臨床病理因素的相關(guān)性，為進一步明確乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展機制提供依據(jù)。現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年9月-2016年1月牡丹江腫瘤醫(yī)院（筆者在該醫(yī)院實習(xí)）乳腺外科手術(shù)切除的30例乳腺癌標(biāo)本為試驗組，另取距離腫瘤邊緣1 cm處的癌旁組織為對照組。兩組中每例標(biāo)本各取兩處分別放入液氮罐內(nèi)冷凍用于Real-time PCR技術(shù)檢測以及放入10%的福爾馬林溶液內(nèi)固定用于免疫組織化學(xué)染色。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)臨床病理診斷明確癌組織和癌旁組織成分。排除標(biāo)準(zhǔn)：顯微鏡下排除壞死組織?；颊呔鶠榕?，平均年齡（55.00±10.34）歲；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移18例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移12例；根據(jù)WHO TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，確定乳腺癌患者的臨床分期；患者術(shù)前均未接受任何放、化療治療，術(shù)后病理證實均為乳腺癌；患者均對本研究知情同意，且本研究已經(jīng)院倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑 鼠抗人TNFR1抗體購自美國Santa Cruz公司；Trizol試劑、RT-PCR試劑盒、2×SYBR Premix Ex Taq均購自美國Invitrogen公司；SABC免疫組化染色試劑盒、DAB均購自武漢博士德生物工程有限公司。PCR引物由上海博亞生物工程公司合成。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化SABC法 一抗TNFR1工作濃度（1︰800），DAB顯色，染色步驟按試劑盒說明書進行。細胞膜或細胞質(zhì)呈棕黃色染色為陽性。應(yīng)用彩色病理圖像分析系統(tǒng)測定隨機選取的5個高倍視野內(nèi)TNFR1蛋白的相對表達量，取平均值灰度值（Mean gray value，MGV）作為代表值。

1.3.2 Real-time PCR檢測 按照試劑盒說明書操作，Trizol法分別提取乳腺癌組織和癌旁組織總RNA，RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄cDNA，SYBR Premix Ex Taq試劑盒用于Real-time PCR定量檢測。引物序列如下，TNFR1：5-GCCAGGAGAAACAGAACAC-3，（forward），5-CCGTTGGTAGCGATACATTA-3，（reverse）；U6作為內(nèi)參序列為：5-GTGCTCGCTTCGGCAGCACAT-3，（forward） and 5-TACCTTGCGAAGTGCTTAAAC-3，（reverse）。每個樣品重復(fù)三次，采用2-ΔΔCT法對TNFR1 mRNA表達進行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS 15.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示，組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌組織內(nèi)TNFR1 mRNA的表達 以GAPDH為內(nèi)參，通過Real-time PCR檢測30例乳腺癌組織和癌旁組織內(nèi)TNFR1 mRNA的表達差異，按2-ΔΔCT量化分析試驗組TNFR1 mRNA的表達量為（0.07±0.03），是對照組表達量（0.03±0.01）的2.34倍，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

2.2 乳腺癌組織內(nèi)TNFR1蛋白的表達 光鏡下觀察乳腺癌內(nèi)TNFR1蛋白免疫組化SABC染色呈棕黃色，主要分布于細胞質(zhì)內(nèi)，呈彌漫性或局灶性分布；癌旁組織TNFR1蛋白表達不明顯（圖1）；試驗組TNFR1蛋白表達為（145.36±3.46），呈高表達，明顯高于對照組的（119.69±14.28），比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

2.3 乳腺癌組織內(nèi)TNFR1蛋白的表達與臨床病理因素的關(guān)系 乳腺癌內(nèi)TNFR1蛋白的表達與患者年齡、腫瘤大小均無關(guān)（P>0.05），而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期密切均相關(guān)（P<0.05）。見表3。

3 討論

乳腺癌是威脅女性健康的主要惡性腫瘤之一，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是多數(shù)患者死亡的主要原因，因此有效控制淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移對改善乳腺癌患者預(yù)后尤為重要[7-10]。

TNF-α最主要的生物學(xué)活性就是通過與TNFR1受體結(jié)合發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。大量研究證實腫瘤組織內(nèi)TNFR1的表達與腫瘤進展、分化、轉(zhuǎn)移等臨床病理因素密切相關(guān)，可作為推斷腫瘤預(yù)后的獨立因素[11-15]。文獻[16]采用免疫組化法檢測胃癌組織、癌旁組織和正常胃黏膜內(nèi)TNFR1的表達，結(jié)果證實胃癌組織內(nèi)TNFR1的表達均比癌旁組織及正常黏膜顯著增高，并且胃癌組織內(nèi)TNFR1的表達與腫瘤分化程度有關(guān)。同樣，Hosono等[17]、Takahashi等[18]對大腸癌的研究也顯示TNFR1的表達與腫瘤的分化程度及分期有關(guān)，而與其他臨床病理因素?zé)o關(guān)。而且研究發(fā)現(xiàn)，TNFR1表達與慢性髓性白血病的惡性程度也存在一定內(nèi)在聯(lián)系[19-20]。但關(guān)于乳腺癌內(nèi)TNFR1的表達及臨床意義的研究目前還未見詳盡報道，因此檢測乳腺癌組織內(nèi)TNFR1的表達并分析與臨床病理因素的相關(guān)性具有十分重要的意義。

本研究首先采用Real-time PCR和免疫組化技術(shù)分別從基因和蛋白水平檢測了乳腺癌和癌旁組織內(nèi)TNFR1的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳腺癌內(nèi)

TNFR1 mRNA和蛋白質(zhì)的表達水平均明顯高于癌旁組織（P<0.05），這意味著TNFR1在乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，高表達的TNFR1可能介導(dǎo)了TNF-α對腫瘤細胞的殺傷作用。接下來本研究進一步分析了乳腺癌內(nèi)TNFR1蛋白表達水平與患者年齡、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期等病理因素的相關(guān)性，結(jié)果顯示，乳腺癌內(nèi)TNFR1的表達與患者年齡、腫瘤大小等因素均無關(guān)（P>0.05），而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期密切均相關(guān)（P<0.05）。淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移者TNFR1蛋白表達水平明顯高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，表明TNFR1的表達高低可能與乳腺癌的惡性程度相關(guān)。腫瘤惡性程度越高，TNFR1表達水平越低，意味著腫瘤細胞越容易逃避TNF-α的毒性作用。同樣，Ⅰ、Ⅱ期乳腺癌患者TNFR1的表達水平明顯高于Ⅲ、Ⅳ期，這進一步證明腫瘤形成初期機體就刺激腫瘤細胞表面表達更多的TNFR1，以抑制腫瘤的進展和轉(zhuǎn)移。由此可見，檢測TNFR1可作為預(yù)測乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移趨勢的重要標(biāo)記物。

綜上所述，TNFR1在乳腺癌內(nèi)呈高表達，并可能在乳腺癌的發(fā)生及發(fā)展進程中發(fā)揮重要作用，可作為判斷乳腺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的重要標(biāo)記物，但有關(guān)乳腺癌內(nèi)TNFR1如何發(fā)揮作用的相關(guān)機制還有待進一步研究。

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