韓德軍 夏寧 鄭雙 蔣麗艷

【摘要】 目的：探討狼毒大戟多糖（EFP-AW1）對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖及細(xì)胞因子白介素2（IL-2）和干擾素γ（IFN-γ）分泌的影響。方法：制備小鼠脾淋巴細(xì)胞，加入EFP-AW1，使終質(zhì)量濃度分別為0、25、50、100、200 mg/L，再加入Con A，培養(yǎng)60 h后，采用MTT法檢測不同質(zhì)量濃度狼毒大戟多糖EFP-AW1對Con A誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的影響；將5種不同濃度的EFP-AW1分別加入小鼠脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)體系，再加入Con A，培養(yǎng)48 h后，收集培養(yǎng)上清，ELISA法檢測不同質(zhì)量濃度EFP-AW1對小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌IL-2和IFN-γ的影響。結(jié)果：與空白組比較，50、100、200 mg/L的狼毒大戟多糖能夠促進(jìn)Con A誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)（P<0.05），并能夠提高脾淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IL-2和IFN-γ的水平（P<0.05）。結(jié)論：狼毒大戟多糖具有一定的免疫增強(qiáng)作用。

【關(guān)鍵詞】 狼毒大戟； 多糖； 脾淋巴細(xì)胞； 白介素2； 干擾素γ

【Abstract】 Objective：To observe the effect of Euphorbia Fischeriana Polysaccharide（EFP-AW1） on proliferation and production of interleukin 2（IL-2），interferon γ（IFN-γ） of splenic lymphocytes in mice.Method：Five concentrations of EFP-AW1（0，25，50，100，200 mg/L） with Con A were added to the culture system of mouse splenic lymphocytes for 60 h，the effect of EFP-AW1 at different concentrations on splenic lymphocyte proliferation were detected by MTT method.Five concentrations of EFP-AW1（0，25，50，100，200 mg/L） with Con A were added to the culture system of mouse splenic lymphocytes for 48 h，IL-2 and IFN-γ production from splenic lymphocytes were examined by ELISA.Result：Compared with the blank group，EFP-AW1 50，100 and 200 mg/L promoted Con A induced T lymphocyte proliferation（P<0.05），and elevated IL-2 and IFN-γ production from splenic lymphocytes（P<0.05）.Conclusion：EFP-AW1 has immunity-enhancing effect.

【Key words】 Euphorbia fischeriana； Polysaccharide； Lymphocyte proliferation； Interleukin 2； Interferon γ

First-authors address： Qiqihar Medical University，Qiqihar 161000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.24.007

狼毒大戟（Euphorbia fischeriana）為大戟科狼毒屬植物，俗稱貓眼草[1]。其味辛、性平、有毒，根入藥。民間用于治療腫瘤、皮膚病、結(jié)核病等[2-3]。目前關(guān)于狼毒大戟藥理作用的文獻(xiàn)報(bào)道較多，尤其是其具有一定的抗腫瘤作用[4-5]。但是對于狼毒多糖成分的分離鑒定少有報(bào)道[6-7]。本課題組從中藥狼毒大戟的干燥根中發(fā)現(xiàn)并提取了低分子多糖化合物EFP-AW1[8]，通過前期實(shí)驗(yàn)已證實(shí)其能夠抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，而這種抑制作用是通過EFP-AW1增強(qiáng)荷瘤機(jī)體的免疫監(jiān)視功能而發(fā)揮的[9]。為進(jìn)一步研究EFP-AW1對機(jī)體免疫功能的影響，本實(shí)驗(yàn)選擇小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞因子誘生實(shí)驗(yàn)，旨在為EFP-AW1的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與動(dòng)物 狼毒大戟購買于齊齊哈爾市藥材公司，經(jīng)齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院郭麗娜教授鑒定為大戟科植物狼毒大戟Euphorbia fischeriana Steud的干燥根，EFP-AW1為本實(shí)驗(yàn)室從中藥狼毒大戟中新發(fā)現(xiàn)并分離提取的低分子多糖化合物[8]，分子量為10.830 Da，純度>95%，用PBS配制。健康、清潔級ICR小鼠，購自吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，雌性，體質(zhì)量18～22 g，飼養(yǎng)環(huán)境溫度（24±1）℃，濕度（50±10）%，自由飲水采食。RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）：HyClone公司產(chǎn)品；小鼠脾淋巴細(xì)胞分離液、白細(xì)胞介素2（interleukin 2，IL-2）和干擾素γ（interferonγ，IFN-γ）ELISA檢測試劑盒：北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；伴刀豆凝集素A（concanavalin A，Con A）：美國Sigma公司；四甲基偶氮唑鹽（MTT）和二甲基亞砜（DMSO）：美國Sigma公司。酶標(biāo)儀（奧地利TECAN公司）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液的制備 頸椎脫臼處死小鼠，置于75%的乙醇中浸泡消毒；在超凈工作臺(tái)中向培養(yǎng)皿中加入4 mL淋巴細(xì)胞分離液；從燒杯中取出小鼠捋干酒精，無菌取出小鼠脾臟；取出一張200目尼龍膜在淋巴細(xì)胞分離液中浸濕，將脾臟放在尼龍膜上用注射器活塞輕輕研磨脾臟；將懸有脾臟細(xì)胞的分離液立即轉(zhuǎn)移到15 mL無菌離心管中，沿管壁緩慢加入500 μL的RPMI1640培養(yǎng)基覆蓋，室溫，800 g離心30 min；吸出中間灰白色的淋巴細(xì)胞層，再加入10 mL RPMI1640培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞，250 g離心10 min。傾倒上清液，重懸于含10%FCS的RPMI1640培養(yǎng)基中，細(xì)胞計(jì)數(shù)，備用。

1.2.2 小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 按1.2.1方法制備的小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液，按5×105/100 μL/孔加入96孔培養(yǎng)板，將細(xì)胞分為五組，空白組用完全培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，其余各組分別加入不同質(zhì)量濃度的狼毒大戟多糖100 μL，使狼毒大戟多糖終質(zhì)量濃度分別為25、50、100、200 mg/L，各組再加入Con A使其終濃度為5 mg/L，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。置于37 ℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60 h后，各孔加入5 mg/L的MTT溶液20 μL，繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)。離心，棄上清，加入150 μL DMSO，振蕩溶解結(jié)晶，在570 nm波長處測定吸光度（A570 nm）值。

1.2.3 小鼠脾淋巴細(xì)胞IL-2和IFN-γ水平的測定 按1.2.1的方法制備的小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液，按5×106 mL/孔加入24孔培養(yǎng)板，空白組細(xì)胞用完全培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，其余各組分別加入不同質(zhì)量濃度的狼毒大戟多糖，使狼毒大戟多糖終濃度分別為25、50、100、200 mg/L，再加入Con A使其終濃度為5 mg/L，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。于37 ℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，離心，收集培養(yǎng)上清，

-20 ℃保存，用于測定IL-2、IFN-γ的含量，檢測方法參照IL-2、IFN-γ ELISA試劑盒說明書。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，進(jìn)行單因素方差（ANOVA）分析和t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EFP-AW1對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響 與空白組比較，25 mg/L的EFP-AW1對Con A誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)無明顯影響。50、100、200 mg/L的EFP-AW1均能夠促進(jìn)Con A誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)（t=2.404、3.207、4.528，P<0.05），見表1。

2.2 EFP-AW1對小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌IL-2的影響 與空白對照組比較，25 mg/L的EFP-AW1對小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌IL-2無明顯影響。50、100、200 mg/L的EFP-AW1均能夠促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌IL-2（t=2.325、5.181、4.183，P<0.05），見表1。

2.3 EFP-AW1對小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ的影響 與對照組比較，25 mg/L組的EFP-AW1對小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ無明顯影響。50、100、200 mg/L的EFP-AW1均能夠促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ（t=2.704、4.017、4.336，P<0.05），見表1。

3 討論

多糖是自然界最重要的三種生物大分子之一，廣泛存在于動(dòng)物、植物以及微生物的組織中，具有抗腫瘤、抗病毒、抗輻射等多種重要的生理功能，尤其對機(jī)體免疫功能，發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[10-11]。多糖是中藥的一類重要成分，研究證明，中藥多糖在提高免疫力方面有著較強(qiáng)的活性[12-13]，對機(jī)體先天性免疫和獲得性免疫均具有調(diào)節(jié)作用，已成為目前中藥多糖藥理研究的熱點(diǎn)。脾臟是機(jī)體重要的免疫器官之一，是機(jī)體進(jìn)行體液免疫和細(xì)胞免疫的重要場所[14]。本研究以脾細(xì)胞為研究對象，觀察狼毒大戟多糖對小鼠脾淋巴細(xì)胞的作用，探討其對機(jī)體免疫功能的影響。

淋巴細(xì)胞是機(jī)體進(jìn)行免疫應(yīng)答的重要細(xì)胞，在有絲分裂原的刺激下可以發(fā)生增殖?；罨腡、B淋巴細(xì)胞是機(jī)體發(fā)揮免疫功能的重要因素，T淋巴細(xì)胞參與機(jī)體的細(xì)胞免疫應(yīng)答，B淋巴細(xì)胞能分泌多種抗體，參與機(jī)體的體液免疫應(yīng)答[15]。Con A是T淋巴細(xì)胞的有絲分裂原，LPS是B淋巴細(xì)胞的有絲分裂原。淋巴細(xì)胞增殖能力的強(qiáng)弱影響機(jī)體的免疫狀態(tài)。Con A誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞的增殖能力常用于檢測細(xì)胞免疫水平[16-17]。本實(shí)驗(yàn)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的MTT結(jié)果顯示，50、100、200 mg/L的EFP-AW1均能夠顯著促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖，與空白組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其作用呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，表明EFP-AW1能夠增強(qiáng)細(xì)胞免疫，從而提高機(jī)體免疫功能。

細(xì)胞因子是由免疫細(xì)胞和某些非免疫細(xì)胞活化后合成的具有調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的低分子可溶性蛋白質(zhì)[18-19]。檢測細(xì)胞因子對闡明機(jī)體免疫應(yīng)答具有重要意義。Th細(xì)胞前體在抗原刺激下，分化為中間階段的Th0，Th0在不同細(xì)胞因子作用下，選擇性地向Th1或Th2細(xì)胞分化。Th1細(xì)胞偏向于分泌IL-2、IFN-γ、TNF等細(xì)胞因子，可促進(jìn)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，Th2細(xì)胞偏向于分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10等細(xì)胞因子，與體液免疫應(yīng)答相關(guān)[20-21]。實(shí)驗(yàn)中筆者選擇了IL-2和IFN-γ進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，50、100、200 mg/L的EFP-AW1均可顯著提高細(xì)胞因子IL-2和IFN-γ的分泌，與空白組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。由此說明合適劑量的EFP-AW1能夠促進(jìn)機(jī)體的Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答。

綜上所述，狼毒大戟多糖EFP-AW1對機(jī)體細(xì)胞免疫功能具有促進(jìn)作用，對體液免疫功能的影響還有待于進(jìn)一步研究。

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