夏倩倩， 甘立軍

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 南京 210095)

高羊茅(tall fescue)是一種常用冷季型草坪草，適宜生長(zhǎng)溫度為16℃～24℃，是常用的冷季型草坪草中年綠色期最長(zhǎng)的一個(gè)草種，且因其質(zhì)地柔軟、色澤漂亮、外貌美觀而得到眾多人的喜愛(ài)。但高羊茅耐寒不耐熱，超出生長(zhǎng)最適溫度時(shí)植株的生理代謝功能會(huì)發(fā)生一系列的變化，嚴(yán)重時(shí)會(huì)致死[1]。在我國(guó)南方，夏季高溫是限制冷季型植物生長(zhǎng)和發(fā)育的最普遍的非生物因子[2]。因此，解決高羊茅在我國(guó)南方難以越夏的困難問(wèn)題迫在眉睫。

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)是一種含有4碳的非蛋白質(zhì)氨基酸，水溶性較高，存在多種分子構(gòu)象，廣泛存在于原核和真核生物中[3]。GABA是生物自由氨基酸庫(kù)的重要組成部分，參與生物體的多種代謝活動(dòng)[4]。在動(dòng)物中，GABA是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的神經(jīng)遞質(zhì)[5]。在植物中，GABA擔(dān)任著代謝物質(zhì)和信號(hào)物質(zhì)的雙重角色，參與了植物的 pH 調(diào)節(jié)、能源物質(zhì)調(diào)節(jié)、C/N 平衡調(diào)節(jié)以及防御系統(tǒng)調(diào)節(jié)[6]。鑒于前人對(duì)GABA在植物逆境上的研究結(jié)果[7-8]，以及高羊茅的不耐熱特性，本實(shí)驗(yàn)旨在探究GABA對(duì)高溫逆境下高羊茅耐熱性的影響及其調(diào)控機(jī)制，為GABA在冷季型草坪草越夏難題應(yīng)用上開(kāi)展初步探討。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

高羊茅品種為愛(ài)瑞3號(hào)，購(gòu)于江蘇省農(nóng)科院。γ-氨基丁酸純度為 98%，由Sigma公司提供。

1.2 試驗(yàn)處理方法和條件

稱取等量(0.6 g)的高羊茅種子進(jìn)行播種，自然條件(15℃～25℃)生長(zhǎng)，定期澆水(2 d/次)，試驗(yàn)于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)牌樓實(shí)驗(yàn)基地進(jìn)行。待植株長(zhǎng)到兩葉一心期(株高約10 cm)隨機(jī)選擇長(zhǎng)勢(shì)一致的健康植株進(jìn)行試驗(yàn)處理。試驗(yàn)前期共設(shè)置7個(gè)預(yù)處理組，常溫對(duì)照組(control組)、高溫脅迫對(duì)照組(HS組)、高溫脅迫GABA處理組(25、50、100、200和400 mg/L，分別記為HS+G25、HS+G50、HS+G100、HS+G200、HS+G400)。GABA預(yù)處理方法為葉面噴施法，噴施時(shí)使葉片上均勻附著細(xì)密霧珠且不聚集下滴，每盆噴液量為20 mL，每個(gè)處理8個(gè)重復(fù)，control組和HS組采用等量清水噴葉。噴施GABA 24 h后，于光照培養(yǎng)箱進(jìn)行高溫脅迫處理，高溫42℃/30℃(晝/夜)水分供應(yīng)充足。根據(jù)收集的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)類型，確定采樣時(shí)間。在高溫處理后第 0、3、6、12、24、48及第96小時(shí)分別取樣測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)、抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)的酶活性及H2O2含量。丙二醛(MDA)、可溶性糖和可溶性蛋白含量采于第8天。其他指標(biāo)則在高溫處理后第0、2、4、6和第8天分別取樣測(cè)定。所有檢測(cè)重復(fù)3次。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 重量測(cè)定

隨機(jī)取每盆中30片大小一致的葉片，洗凈去根后用吸水紙擦干，用萬(wàn)分之一天秤測(cè)量平均值，每個(gè)處理重復(fù)3次，即為鮮重。隨后將其置于烘箱殺青10 min，之后80℃烘干至恒重后稱量即為干重。計(jì)算植株相對(duì)含水量[10]，計(jì)算公式：植株相對(duì)含水量(%)=(30株初始鮮重-30株初始干重)/(30株吸水飽和鮮重-30株初始干重)×100%。

1.3.2 相對(duì)電導(dǎo)率的測(cè)定

參考Pawtowicz的方法[11]測(cè)定相對(duì)電導(dǎo)率：取植株葉片0.4 g用去離子水沖洗2次，用濾紙吸干，然后剪至1 cm左右小段，浸入15 mL去離子水中，真空滲入0.5 h使葉片完全浸入，然后于25℃放置3 h，用DJS-120型電導(dǎo)儀測(cè)電導(dǎo)率(S1)，再用沸水煮15 min，冷卻到25℃時(shí)測(cè)總電導(dǎo)率(S2)。相對(duì)電導(dǎo)率(%)=(S1/S2)×100%。

1.3.3 丙二醛含量的測(cè)定

采用硫代巴比妥酸比色法[12]測(cè)定丙二醛含量。取試樣葉片剪碎，混勻每份稱取0.5 g，加入少量石英砂和5%的TCA試劑5 mL，研磨至勻漿，將勻漿于4000 r/min下離心10 min，其上清液為丙二醛提取液。取2 mL上清液，以蒸餾水作對(duì)照，各管加入0.67%硫代巴比妥酸溶液，在混合儀上混勻后密封，而后放入沸水浴中反應(yīng)15 min后迅速冷卻以終止反應(yīng)并離心，取上清液在532 nm、600 nm和450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值，最后以干質(zhì)量計(jì)算出丙二醛含量。

1.3.4 抗氧化物酶活性檢測(cè)

稱取葉片0.25 g，用蒸餾水清洗，擦干，剪碎后用0.05 mol/L PBS(pH 7.0，含1%的PVP)共5 mL冰浴研磨提取，在10 000 r/min下冷凍離心25 min，取上清液即為粗酶液，4℃冰箱保存?zhèn)溆?。SOD活性采用氮藍(lán)四唑(NBT)光化還原法測(cè)定[13]，以每單位時(shí)間內(nèi)抑制光化還原50%的NBT為1個(gè)酶活性單位(U)；POD活性采用愈創(chuàng)木酚法[14]檢測(cè)。APX酶活性的測(cè)定采用馮晴等[15]提供的方法進(jìn)行，以O(shè)D290每分鐘下降0.01 為一個(gè)酶活性單位(U)。

1.3.5 可溶性糖、可溶性蛋白的測(cè)定

可溶性糖含量采用蒽酮比色法測(cè)定[15]，樣品提取液進(jìn)行顯色反應(yīng)后在630 nm波長(zhǎng)下比色?？扇苄缘鞍缀繙y(cè)定根據(jù)Bradford考馬斯亮藍(lán)G-250方法測(cè)定，樣品提取液經(jīng)考馬斯亮藍(lán)G-250蛋白試劑反應(yīng)后，于595 nm波長(zhǎng)下比色測(cè)定，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線查得待測(cè)樣品中蛋白質(zhì)的含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理和分析

用GraphPad 5、Excel2003及PhotoShop等進(jìn)行作圖及數(shù)據(jù)分析，用Spass16.0進(jìn)行差異顯著性分析。多重比較采用Duncan′s法(P≤0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源GABA對(duì)高溫脅迫下高羊茅生長(zhǎng)的影響

高溫脅迫8 d各組高羊茅生長(zhǎng)狀況如圖1所示。在高溫條件下(42℃/30℃)，未經(jīng)GABA處理的HS組高羊茅已經(jīng)明顯出現(xiàn)葉子發(fā)黃、干枯，甚至死亡的現(xiàn)象。而噴施不同濃度GABA的高羊茅則出現(xiàn)了對(duì)高溫脅迫有不同程度的耐受現(xiàn)象。其中以100 mg/L的GABA處理效果最佳，其幼苗存活率較高、色澤較鮮艷、葉片挺直。

2.2 外源GABA對(duì)高溫脅迫下高羊茅干鮮重和相對(duì)含水量的影響

高溫脅迫下高羊茅干重、鮮重和相對(duì)含水量如圖2所示。在高溫(42℃/30℃)脅迫過(guò)程中，從第2天開(kāi)始HS組幼苗株干重和鮮重隨高溫脅迫時(shí)間的增長(zhǎng)而持續(xù)下降。而采用不同濃度的GABA(25、50、100、200和400 mg/L)預(yù)處理后，各GABA處理組高羊茅幼苗株相對(duì)于HS組其干重和鮮重下降幅度有所緩解。且從第2天后，HS+G100組高羊茅幼苗株干重和鮮重均顯著高于其他GABA處理組(P<0.05)。高溫脅迫至第8天時(shí)，HS組及不同濃度的GABA(25、50、100、200和400 mg/L)處理組干重較control組分別下降33.11%、29.99%、25.81%、20.45%、25.56%和24.87%，差異顯著(P<0.05)，鮮重較control組分別下降了86.73%、57.04%、51.51%、28.72%、37.64%和35.13%，差異顯著(P<0.05)。另外，高溫脅迫0～6 d，與control組比較，各高溫脅迫組之間的幼苗相對(duì)含水量有降低趨勢(shì)，但無(wú)顯著性差異(P>0.05)。但高溫脅迫至第8天時(shí)，HS組幼苗的相對(duì)含水量較control組下降了32.50%，差異顯著(P<0.05)。而HS+(G25、G50、G100、G200、G400)各處理組的相對(duì)含水量較control分別下降了8.12%、5.44%、2.84%、3.53%和3.52%，但無(wú)顯著性差異(P>0.05)，其中100 mg/L的GABA處理組高羊茅幼苗株相對(duì)含水量相對(duì)于control組下降百分比最小。

圖1 GABA對(duì)高溫脅迫下高羊茅生長(zhǎng)的影響

圖2 GABA對(duì)高溫脅迫下高羊茅干鮮重和相對(duì)含水量的影響

2.3 外源GABA對(duì)高溫脅迫下高羊茅幼苗中丙二醛(MDA)含量的影響

高溫脅迫條件下高羊茅幼苗中MDA含量如圖3所示。高溫脅迫至第 8 天，HS組高羊茅幼苗中MDA大量積累，其含量為(23.55±1.39)μmol/g，顯著高于control組(6.97±0.47)μmol/g(P<0.05)。與此同時(shí)，經(jīng)過(guò)不同濃度的GABA預(yù)處理的HS+(G25、G50、G100、G200、G400)各組幼苗中的MDA含量分別為

(16.85±1.26)μmol/g、(13.41±1.23)μmol/g、(7.02±0.75)μmol/g、(8.24±0.39)μmol/g和(8.51±0.26)μmol/g，其中HS+G100、HS+G200和HS+G400組與HS組比較MDA含量顯著降低(P<0.05)。

與control比較，*：P<0.05；與HS比較，#:P<0.05

圖3 GABA對(duì)高溫脅迫下高羊茅葉片丙二醛含量的影響

Fig 3 Effects of GABA on MDA content in
tall fescue seedlings under heat stress

2.4 外源GABA對(duì)高溫脅迫下高羊茅幼苗可溶性糖和可溶性蛋白的影響

由圖 4-A可見(jiàn)，高溫脅迫至第8天，常溫條件下的control組幼苗體內(nèi)可溶性糖含量為(8.25±0.90)mg/g，而高溫脅迫條件下HS組幼苗體內(nèi)可溶性糖含量為(18.21±1.06)mg/g，HS組可溶性糖含量顯著高于control組(P<0.05)。經(jīng)過(guò)不同濃度GABA預(yù)處理的HS+G(25、50、100、200、400)各組幼苗體內(nèi)可溶性糖含量分別為(12.36±0.61)mg/g、(11.67±0.84)mg/g、(9.74±0.56)mg/g、(12.34±0.55)mg/g和(12.43±0.92)mg/g，與HS組比較呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，其中100 mg/L的GABA處理組幼苗體內(nèi)可溶性糖含量與HS組比較差異顯著(P<0.05)。如圖4-B所示，高溫脅迫條件下HS組幼苗體內(nèi)可溶性蛋白含量為(7.39±0.54)mg/g顯著低于control組(12.48±0.69)mg/g(P<0.05)。經(jīng)過(guò)不同濃度GABA預(yù)處理后，HS+G(25、50、100、200、400)各組幼苗體內(nèi)可溶性蛋白含量升高，但與HS組比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

與control比較，*：P<0.05；與HS比較，#:P<0.05

圖4 GABA對(duì)高溫脅迫下高羊茅可溶性糖(A)、
可溶性蛋白(B)含量的影響

Fig 4 Effects of GABA on soluble sugar (A) and soluble protein (B)
contents in tall fescue seedlings under heat stress

2.5 外源GABA對(duì)高溫脅迫下高羊茅幼苗相對(duì)電導(dǎo)率的影響

高溫脅迫下高羊茅幼苗相對(duì)電導(dǎo)率如圖5所示。高溫脅迫至第2天后，與control組比較，HS組幼苗葉片外滲液的相對(duì)電導(dǎo)率持續(xù)升高，差異顯著(P<0.05)。采用100 mg/L的GABA預(yù)處理后，在高溫脅迫下HS+G100組幼苗葉片外滲液的相對(duì)電導(dǎo)率較HS組增速放緩。高溫脅迫至第8天，HS與HS+G100幼苗葉片外滲液的相對(duì)電導(dǎo)率相對(duì)于control組升高197.18%和154.62%，差異顯著(P<0.05)。

圖 5 GABA對(duì)高溫脅迫下高羊茅葉片相對(duì)電導(dǎo)率的影響

2.6 外源GABA對(duì)高溫脅迫下高羊茅幼苗H2O2含量及抗氧化酶活性的影響

高溫脅迫下高羊茅幼苗H2O2含量如圖6-A所示，高溫脅迫可使高羊茅幼苗H2O2含量在短時(shí)間內(nèi)急劇升高。高溫脅迫至第3小時(shí)，HS組和HS+100組幼苗內(nèi)H2O2含量分別為(4.11±0.29)μmol/g和(3.10±0.22)μmol/g，顯著高于control組(0.98±0.07)μmol/g (P<0.05)。隨后又迅速下降，6 h后始終保持較高水平。高溫脅迫至第96小時(shí)，HS和HS+G100組的H2O2含量分別為control的2.16和1.69倍，且各時(shí)間點(diǎn)HS+G100組幼苗H2O2含量始終低于HS組。

高溫脅迫下高羊茅幼苗內(nèi)抗氧化酶SOD、POD和APX活性如圖6-B、D所示。隨著高溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，HS和HS+G100幼苗內(nèi)抗氧化酶SOD、POD和APX活性出現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，6 h達(dá)到峰值。高溫脅迫至第6小時(shí)后，HS組和HS+G100幼苗內(nèi)抗氧化酶SOD、POD和APX活性開(kāi)始下降，且HS組下降幅度高于HS+G100組。

圖6 GABA對(duì)高溫脅迫下高羊茅H2O2含量及抗氧化酶活性的影響

3 討論

高溫是制約冷季型草生長(zhǎng)和發(fā)育的最主要生態(tài)因素。目前，全球溫室效應(yīng)較為嚴(yán)重，許多冷季型草的生長(zhǎng)都受到限制，即使環(huán)境中水分充足也常因細(xì)胞保水功能受限而脫水，產(chǎn)生一系列的代謝失衡[16]。當(dāng)環(huán)境溫度高于30℃時(shí)，容易引起草坪草生長(zhǎng)緩慢，葉片萎蔫，葉色泛黃。本研究結(jié)果顯示，在水分充足的條件下，高溫(42℃/30℃)脅迫不僅可以導(dǎo)致高羊茅葉片泛黃和枯萎，還能造成高羊茅生物量(干重、鮮重和相對(duì)含水量)顯著降低。而經(jīng)過(guò)不同濃度的GABA(25、50、100、200和400 mg/L)預(yù)處理可以緩解高溫對(duì)高羊茅的傷害以及抑制高羊茅生物量的降低，其中100 mg/L GABA預(yù)處理效果最佳。說(shuō)明，GABA具有提高高羊茅耐熱性的潛能。

MDA作為膜脂過(guò)氧化損傷的最終產(chǎn)物，其累積量會(huì)隨外界傷害程度的加大而不斷增大[17]。植物細(xì)胞的膜系統(tǒng)是高溫脅迫下受害的主要部位，高溫脅迫往往會(huì)導(dǎo)致冷季型草坪草產(chǎn)生嚴(yán)重的氧化脅迫現(xiàn)象，造成草坪草細(xì)胞膜嚴(yán)重受損，嚴(yán)重影響草坪質(zhì)量[16]。本研究結(jié)果顯示，高溫脅迫至第8天，可導(dǎo)致高羊茅幼苗MDA含量顯著累積，然而葉片噴施GABA可減少高羊茅幼苗體內(nèi)MDA的積累。楊麗文等[18]研究也發(fā)現(xiàn)添加外源GABA可顯著降低低氧脅迫下甜瓜幼苗葉片內(nèi)MDA含量。說(shuō)明，GABA可能是通過(guò)降低機(jī)體氧化損傷來(lái)提高高羊茅的耐熱性。

大量研究表明[19-20]，逆境條件下機(jī)體會(huì)產(chǎn)生大量的氧自由基(例如H2O2)，進(jìn)而引發(fā)膜脂過(guò)氧化作用而造成膜系統(tǒng)的傷害。同時(shí)，機(jī)體內(nèi)也存在一套清除氧自由基的防御體系，而超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)和抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)正是這一類防御體系中的重要成員。在本研究中，選擇100 mg/L GABA預(yù)處理的高羊茅幼苗作為研究對(duì)象，檢測(cè)了短時(shí)間高溫脅迫下幼苗體內(nèi) H2O2及SOD、POD和APX的含量。結(jié)果顯示，隨著高溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，高羊茅幼苗體內(nèi)H2O2含量均出現(xiàn)先升高后降低，再升高的現(xiàn)象，而SOD、POD和APX的含量則均出現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[21]。其中100 mg/L GABA預(yù)處理可降低高羊茅幼苗體內(nèi)H2O2含量以及提高抗氧化酶SOD、POD和APX的含量。高羊茅幼苗體內(nèi)H2O2含量在第6小時(shí)突然降低，以及SOD、POD和APX的含量第6小時(shí)達(dá)到峰值，可能是由于高溫脅迫導(dǎo)致機(jī)體防御體系被激活，隨后由于高溫脅迫持續(xù)，高羊茅幼苗體內(nèi)不斷產(chǎn)生氧自由基，導(dǎo)致氧化能力不斷增強(qiáng)，抗氧化能力則不斷減弱。

在高溫逆境下，植物體內(nèi)氧自由基不斷積累，導(dǎo)致植物細(xì)胞膜遭受破壞，膜通透性增大，細(xì)胞內(nèi)的電解質(zhì)外滲，導(dǎo)致植物細(xì)胞浸提液的電導(dǎo)率增大[22]。本研究結(jié)果顯示，持續(xù)高溫脅迫可導(dǎo)致高羊茅幼苗葉片外滲液的相對(duì)電導(dǎo)率持續(xù)升高，這一結(jié)果與高溫脅迫下高羊茅幼苗體內(nèi)MDA含量和H2O2含量不斷升高而相吻合。葉片噴灑100 mg/L GABA預(yù)處理降低高羊茅幼苗葉片外滲液的相對(duì)電導(dǎo)率，充分說(shuō)明GABA預(yù)處理可以提高高溫條件下高羊茅幼苗的耐熱性。另外，GABA還可提高高溫條件下高羊茅幼苗體內(nèi)可溶性蛋白含量和降低可溶性糖含量。

綜上，目前的研究表明GABA能改善高溫脅迫下高羊茅草坪草的存活率、色澤等生長(zhǎng)狀況，并通過(guò)以上生理生化調(diào)節(jié)在總體水平上提高高羊茅草坪草的耐熱性，100 mg/L是較佳的噴施濃度。然而，要確定GABA葉噴處理是否可以廣泛的普及，還需進(jìn)行進(jìn)一步的探究和大田試驗(yàn)。