史楠冰， 趙 文， 劉衛(wèi)東， 魏 杰， 安 浩， 季世琛

(1. 大連海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院， 大連 116023； 2. 遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院， 大連 116023)

西藏?cái)M溞在分類(lèi)學(xué)上隸屬于甲殼綱(Crustacea)，鰓足亞綱(Branchiopoda)，雙甲目(Diplostraca)，枝角亞目(Cladocera)，溞科(Daphniidae)，擬溞屬(Daphniopsis)[1]。該種通常分布于高海拔、低溫、低鹽的貧營(yíng)養(yǎng)型鹽水體中[1]，在我國(guó)新疆、青海、西藏等地均有分布，國(guó)外則分布于俄羅斯和印度，是一種冷水性鹽水種，在枝角類(lèi)生物學(xué)研究中具獨(dú)特地位[2]。

傳統(tǒng)的枝角類(lèi)物種鑒別方法主要依靠形態(tài)學(xué)觀察，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，一些特定基因序列和分子標(biāo)記被用于物種鑒定和物種進(jìn)化關(guān)系的研究，其中包括線粒體細(xì)胞色素c氧化酶亞基I(mtCOI)序列、ITS序列以及18S rDNA序列[3]。線粒體DNA細(xì)胞色素c氧化酶亞基I(mtCOI)部分序列在動(dòng)物界的大多數(shù)門(mén)類(lèi)中具有種的特異性，被公認(rèn)為動(dòng)物的“條形碼”， 而轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacers，ITS)序列由于選擇壓力小，進(jìn)化變異速率較快，更適用于物種和種群等低階水平的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的研究[4]，這一序列多被用于真菌的分類(lèi)鑒定[5]。真核生物18S rDNA基因由于序列在進(jìn)化上極度保守，同屬異種間序列差異小，通常被認(rèn)為更適用于高階分類(lèi)水平[6]。由于核18S rDNA基因頗具保守性，可用通用引物進(jìn)行擴(kuò)增并測(cè)序，現(xiàn)已頻繁用于真核生物多樣性及進(jìn)化研究[7]。Genbank中18S序列構(gòu)成了物種覆蓋面最為廣泛的數(shù)據(jù)，而間隔區(qū)ITS序列數(shù)據(jù)相對(duì)較少，數(shù)據(jù)庫(kù)資源較為缺乏。

目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)西藏?cái)M溞生物學(xué)研究主要包括生態(tài)分布[1]、形態(tài)學(xué)描述[2]、營(yíng)養(yǎng)成分分析[8]、耗氧率排氨率測(cè)定[9]、免疫學(xué)相關(guān)[10]、金屬離子耐受性[11-13]、染色體核型[14]，以及基于RAPD技術(shù)的遺傳多樣性[15]等方面。在分子研究方面，西藏?cái)M線粒體COI部分序列、16S rDNA部分序列以及12S rDNA部分序列已有相關(guān)報(bào)道研究[16-17]，對(duì)于18S rDNA及ITS序列的研究尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。

本研究首次對(duì)西藏?cái)M溞核糖體18S rDNA部分序列和ITS2全長(zhǎng)進(jìn)行克隆測(cè)序，依據(jù)核糖體18S rDNA序列構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，這些結(jié)果為該種的分類(lèi)鑒定、進(jìn)化演變及進(jìn)一步分子生物學(xué)研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 西藏?cái)M溞采集及培養(yǎng)

西藏?cái)M溞樣本是2016年8月采自于西藏自治區(qū)那曲納木卡錯(cuò)湖(30°30′N(xiāo)，90°16′E)，馴養(yǎng)于大連海洋大學(xué)水生生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

西藏?cái)M溞家系培育： 1000 mL大燒杯滅菌海水配以純水調(diào)節(jié)鹽度至15作為培養(yǎng)用水，每個(gè)燒杯加入上述培養(yǎng)水約400 mL水。每個(gè)燒杯放入一只經(jīng)挑選的狀態(tài)良好的個(gè)體，經(jīng)孤雌生殖連續(xù)繁殖培育西藏?cái)M溞家系。以湛江等鞭金藻(Isochrysiszhanjiangensis)和鹽生杜氏藻(Dunaliellasalina)按比例1∶1做混合藻作為餌料投喂，每3天投喂1次，隨著溞體數(shù)量調(diào)整每次餌料投喂量。

1.2 西藏?cái)M溞總DNA提取和目的基因PCR擴(kuò)增

實(shí)驗(yàn)前一天停止投喂，將家系導(dǎo)入新配置的鹽度為15的海水中，饑餓處理24 h，每個(gè)家系分別挑取10～20個(gè)西藏?cái)M溞個(gè)體，用于基因組DNA提取，按照海洋動(dòng)物基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN生化科技有限公司)的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行DNA抽提，所得DNA用50～60 μL滅菌水最終洗脫。提取出的基因組DNA于-20℃保存。另挑取4只個(gè)體較大，游泳活潑的個(gè)體，提取單只西藏?cái)M溞的基因組DNA用于擴(kuò)增ITS2序列。

經(jīng)文獻(xiàn)查詢獲得擴(kuò)增西藏?cái)M溞18S和ITS2序列通用引物, 引物由上海生工生物有限公司合成。擴(kuò)增引物序列分別為：18SF(AYCTGGTTGATCCTGCCAGT),18SR(CCTTGTTACGACTTTTACTTCCTC),ITS2F(GGTCGATGATGAACGAACAGAGAT),ITS2R(GGTAGTCTCATCTAAACTGAGGTCAGA)。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)使用50 μL體系，各組分含量按照LATaq酶(TaKaRa 大連)說(shuō)明書(shū)配置。PCR擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性3min；94℃變性30 s；56℃退火30 s；72℃延伸3 min，設(shè)32～34個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將目標(biāo)條帶進(jìn)行切膠純化(TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit)。純化產(chǎn)物經(jīng)連接PMD19-T(TaKaRa 大連)、轉(zhuǎn)化E.coliDH5α(TaKaRa 大連)、培養(yǎng)、篩選及驗(yàn)證后，克隆菌液送上海生工生物公司測(cè)序。

1.3 西藏?cái)M溞核糖體18S序列和ITS2序列測(cè)定與系統(tǒng)發(fā)育分析

18S rDNA序列同源性通過(guò)BLASTn在NCBI檢索相似序列并用于系統(tǒng)發(fā)育分析，所選序列如下：與西藏?cái)M溞同屬不同種的方角擬溞Daphniopsisquadrangula，同科不同屬的大型溞Daphniamagna、蚤狀溞Daphniapulex、喜馬拉雅低額溞Simocephalushimalayensis、平突船卵溞Scapholeberismucronata，同目不同科的彎額刺尾溞Acantholeberiscurvirostris、Bythotrephescederstroemi、Pseudochydorusglobosus；和西藏?cái)M溞同綱不同目無(wú)甲目的Parartemiaminuta、Linderiellasantarosae，外族群為蝦夷扇貝Mizuhopectenyessoensis。本文選用的12個(gè)物種的核糖體18S基因序列GenBank登錄號(hào)見(jiàn)表1。

表1 構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)所用12個(gè)物種18S rDNA基因序列及GenBank登錄號(hào)

用ClustalW軟件對(duì)西藏?cái)M溞18S序列及建樹(shù)所需18S序列進(jìn)行多序列比對(duì)。應(yīng)用MEGA5.0軟件計(jì)算各物種18S rDNA間的遺傳距離。根據(jù)12個(gè)物種的18S rDNA對(duì)結(jié)果，構(gòu)建西藏?cái)M溞的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，并在此基礎(chǔ)上分析西藏?cái)M溞的進(jìn)化分類(lèi)地位。使用ModelTest 確定計(jì)算遺傳距離和建樹(shù)的最佳模型。經(jīng)檢驗(yàn)基于西藏?cái)M溞18S rDNA構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)的最佳模型是Kimura雙參數(shù)模型(kimura,1980)，采用最大似然法(ML)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，用自舉檢驗(yàn)(bootstraptest)估計(jì)各分支節(jié)點(diǎn)的置信度，自舉數(shù)據(jù)集為1000次重復(fù)，使用離散Gamma分布來(lái)模擬各站點(diǎn)之間的進(jìn)化速率差異[5個(gè)類(lèi)別(+G，參數(shù)=0.2416)]。

ITS2區(qū)域的邊界是通過(guò)BLASTN與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的其他種類(lèi)的ITS2序列比對(duì)來(lái)確定的。保守序列的邊界如果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的rDNA序列的邊界是100%相似的，它就被認(rèn)定為是代表5.8S、18S和28S基因側(cè)翼區(qū)，以此來(lái)確定ITS2序列邊界[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列信息與核酸組成

本研究所得西藏?cái)M溞家系18S rDNA和ITS2序列及3個(gè)西藏?cái)M溞個(gè)體ITS2序列的GenBank登錄號(hào)、核酸組成及序列長(zhǎng)度見(jiàn)表2。

表2西藏?cái)M溞18S rDNA、ITS2序列組成及長(zhǎng)度

2.2 西藏?cái)M溞核糖體18S序列與擬溞屬、溞屬18S序列差異分析

本研究獲得的西藏?cái)M溞18S rDNA序列和以往研究結(jié)果一致，具有高度保守性，同一屬的生物種間差異較小。西藏?cái)M溞18S序列與擬溞屬的方角擬溞和溞屬的大型溞經(jīng)ClustalW比對(duì)，手動(dòng)去除兩端序列，至兩端對(duì)齊，得到長(zhǎng)度為611 bp的可分析序列。結(jié)果如圖1所示，“.”表示保守位點(diǎn)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：西藏?cái)M溞18S序列與方角擬溞序列共有540個(gè)保守位點(diǎn)，46個(gè)可變位點(diǎn)，25個(gè)插入缺失位點(diǎn)；和大型溞 18S序列共有506個(gè)保守位點(diǎn)，36個(gè)可變位點(diǎn)，69個(gè)插入缺失位點(diǎn)。

表3 由Kimura雙參數(shù)模型計(jì)算的12個(gè)物種18S rDNA序列間遺傳距離

注：左下角數(shù)據(jù)表示兩兩之間的遺傳距離

2.3 12個(gè)物種核糖體18S序列間遺傳距離分析

18S rDNA各序列之間的遺傳距離用MEGA5.0軟件，用核苷酸序列來(lái)計(jì)算距離矩陣，應(yīng)用Kimura雙參數(shù)模型計(jì)算出的12種生物18S rDNA序列間的遺傳距離見(jiàn)表3。由表3可知與西藏?cái)M溞親緣關(guān)系最近的是擬溞屬的方角擬溞，其次為溞屬的大型溞和蚤狀溞。

2.4 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析

根據(jù)核糖體18S序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)如圖2所示， 12個(gè)物種聚集形成兩大分支 ， 2個(gè)無(wú)甲目的物種P.minuta、L.santarosae聚集形成一大分支，9個(gè)雙甲目的物種聚集成一大分支，西藏?cái)M溞聚集在該分支上。

圖1 3種枝角類(lèi)核糖體18S rDNA序列變異位點(diǎn)

從進(jìn)化樹(shù)可以看出西藏?cái)M溞和擬溞屬的方角擬溞親緣關(guān)系最近，以92%置信度聚集在同一分支，這表明西藏?cái)M溞應(yīng)與方角擬溞歸于同一屬；大型溞和蚤狀溞聚集在一起，單獨(dú)形成一個(gè)分支與西藏?cái)M溞所在分支平行，再次證實(shí)了西藏?cái)M溞在分類(lèi)學(xué)上不歸屬于溞屬。平突船卵溞和喜馬拉雅低額溞分別單獨(dú)形成一個(gè)分支，并與西藏?cái)M溞所在分支平行，這與傳統(tǒng)分類(lèi)學(xué)上歸屬于溞科(Daphniidae)一致；彎額刺尾溞和P.globosus聚集形成一個(gè)分支遠(yuǎn)離西藏?cái)M溞所在分支；B.cederstroemi單獨(dú)成一分支，歸屬于同一目雙甲目，這與傳統(tǒng)分類(lèi)學(xué)結(jié)果一致(圖2)。

2.5 西藏?cái)M溞家系與個(gè)體間ITS2序列差異分析

西藏?cái)M溞家系與3個(gè)個(gè)體間ITS2序列通過(guò)ClustalW比對(duì)，手動(dòng)對(duì)齊后獲得長(zhǎng)度為1212 bp可分析序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)西藏?cái)M溞個(gè)體間ITS2序列存在堿基和長(zhǎng)度差異見(jiàn)表4。4個(gè)序列中共有1176個(gè)保守位點(diǎn)，存在多個(gè)變異位點(diǎn)，其中AG 的替換突出，其次是T與C的替換，另外在3個(gè)個(gè)體序列中，361～366 bp位置出現(xiàn)TTGTGG片段缺失，874～879 bp位置上一致出現(xiàn)了GCAGCA片段的缺失。

圖2 基于核糖體18S序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

4043160207316359360361～366367381419448536KY849847AAGAGGGTTGTGGTGCAGKY849848AAAGGGG-TATGGKY849849GAGAAGG-TGTAGKY849850AGGAG----GTAA542605625632650713874～8799419741028102910471092KY849847--CT-AGCAGCATGAAAGKY849848AATTTA-T-A-AGKY849849--T-TA-TGA-AAKY849850--T--G-GG---G

注：表中“-”代表該位點(diǎn)堿基缺失

2.6 ITS2序列長(zhǎng)度多態(tài)性

西藏?cái)M溞家系和3個(gè)個(gè)體ITS2序列，和經(jīng)BLASTN在線比較獲得GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的相近物種的ITS2序列(GenBank中未找到擬溞屬的ITS2序列信息)，與西藏?cái)M溞同科不同屬的頭盔溞Daphniagaleata、僧帽溞Daphniacucullata，與西藏?cái)M溞同目不同科的長(zhǎng)額象鼻溞Eubosminalongicornis、長(zhǎng)角象鼻溞Eubosminacrassicornis、鄉(xiāng)蚌蟲(chóng)Eulimnadiatexana，不同綱的人疥螨Sarcoptesscabiei、皮刺螨Dermanyssusgallinae、真桑小新綏螨Neoseiulusmakuwa。相關(guān)物種的ITS2序列信息及長(zhǎng)度見(jiàn)表5，由表可看出ITS2序列長(zhǎng)度在同種不同個(gè)體之間存在一定差異，西藏?cái)M溞與頭盔溞D.galeataITS2 序列長(zhǎng)度差160 bp左右，與僧帽溞D.cucullataITS2差異明顯，與長(zhǎng)額象鼻溞E.longicornisITS2差異更大，這一現(xiàn)象是由于ITS區(qū)的選擇壓力小，變異速率更快導(dǎo)致的。

3 討論

西藏?cái)M溞由Sars[24]對(duì)亞洲中部的枝角類(lèi)調(diào)查中首次發(fā)現(xiàn)的，并將其歸屬于擬溞屬并命名為西藏?cái)M溞，而Wagler[19]卻將該溞歸屬于溞屬，命名為西藏溞Daphniatibetana，由此出現(xiàn)這種枝角類(lèi)分類(lèi)學(xué)上的爭(zhēng)論。趙文等[16]通過(guò)對(duì)4個(gè)品系西藏?cái)M溞的線粒體12SrDNA基因序列分析，揭示了該種與溞屬在線粒體12SrDNA分子上的差異，并結(jié)合傳統(tǒng)分類(lèi)學(xué)上的差異，證明了西藏?cái)M溞應(yīng)歸屬于擬溞屬。但是，線粒體基因遵循嚴(yán)格的母系遺傳，其所含信息不能說(shuō)明雙親的進(jìn)化歷程，而控制大部分生物性狀的核基因則含有更豐富的進(jìn)化信息[20]。Kuriiwa等[21]研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，從核DNA篩選的合適標(biāo)記能夠提供父系起源信息，揭示雜交現(xiàn)象，從而更全面的體現(xiàn)物種系統(tǒng)進(jìn)化歷程。本研究獲得的西藏?cái)M溞18S rDNA和ITS2序列經(jīng)分析再次證明了，西藏?cái)M溞在分類(lèi)水平上更靠近擬溞屬而非溞屬，這與趙文等的研究結(jié)果一致。

表5 ITS2序列信息及長(zhǎng)度

18S rDNA分子常作為真核生物分子標(biāo)記用于解釋物種水平關(guān)系和高階橈足類(lèi)系統(tǒng)發(fā)生的分析[22]。18S rDNA序列可以很便捷地解析物種屬之間進(jìn)化關(guān)系，但是，由于核糖體RNA基因的分子進(jìn)化的總體速率慢，導(dǎo)致物種關(guān)系之間較低的置信度，不能有效解決屬內(nèi)的進(jìn)化關(guān)系[23]。

本研究通過(guò)ClustalW多序列比對(duì)和遺傳距離計(jì)算，遺傳距離比較發(fā)現(xiàn)西藏?cái)M溞和擬溞屬的方角擬溞之間的遺傳距離最小。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示，相對(duì)于溞屬的大型溞的18S序列，西藏?cái)M溞的18S序列和同屬的方角擬溞18S序列同源性更高，親緣關(guān)系更近。核糖體18S基因進(jìn)化是緩慢的，不同目物種之間的遺傳距離幾乎是同目不同科物種之間的2倍。

第二轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS2位于5.8S和28S rRNA之間，由于不加入成熟核糖體加工，受到的選擇壓力更小，比編碼區(qū)進(jìn)化速度快，具有種內(nèi)變異小種間變異大的特性，常作為種類(lèi)鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析的分子標(biāo)記[24]。徐敏[25]在分析7種枝角類(lèi)ITS2序列時(shí)，發(fā)現(xiàn)ITS2基因存在種內(nèi)差異，透明溞5個(gè)個(gè)體的平均相似度為96.8%，存在堿基和長(zhǎng)度差異。由于該特性，ITS區(qū)適合于相近種和同種的不同地理種群及不同品系的研究。范鳳娟[26]對(duì)來(lái)自不同地區(qū)的55個(gè)象鼻溞個(gè)體的核基因ITS區(qū)進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以甘肅的炳靈湖、四川的雅安和貴州為分界線呈現(xiàn)明顯的地理分化現(xiàn)象。在菌類(lèi)的分類(lèi)鑒定研究中，ITS序列常作為一些種和亞種的鑒別標(biāo)記[27]。

本研究獲得的西藏?cái)M溞ITS2序列符合真核生物rDNA內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)種內(nèi)變異小而種間變異大的特性，即使是個(gè)體間ITS2序列也存在堿基和長(zhǎng)度差異。ITS2區(qū)域內(nèi)含多個(gè)變異位點(diǎn)而導(dǎo)致該區(qū)域在種群和物種水平上進(jìn)化速率非常迅速，不同種序列之間存在明顯的長(zhǎng)度多態(tài)性[28]。本研究獲得的西藏?cái)M溞ITS2序列和同科不同屬的頭盔溞序列在長(zhǎng)度差了560 bp左右，和不同科不同目的物種序列長(zhǎng)度差異更大。

由于ITS2序列的可變性導(dǎo)致該區(qū)種間的同源性低，不適合屬、科等高階分類(lèi)階元的進(jìn)化分析，而適應(yīng)于低分類(lèi)階元的分析。該區(qū)域富含的變異和位點(diǎn)信息，在物種的遺傳多樣性研究，系統(tǒng)分類(lèi)領(lǐng)域、種和亞種的鑒別標(biāo)記等方面具有廣闊應(yīng)用前景。