王野影， 白志周， 熊 勇， 張明明， 粟海軍

(1. 貴州師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 植物生理與發(fā)育調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 貴陽 550025; 2. 貴州大學(xué)生物多樣性與自然保護(hù)研究中心, 貴陽 550001)

黑頸鶴(Grusnigricollis)和灰鶴(Grusgrus)隸屬于鶴科(Gruidae)，冠鶴亞科(Balearicinae)，鶴屬(Grus)。黑頸鶴作為大型飛行涉禽，活動范圍極其廣泛。在中國，黑頸鶴主要在新疆東昆侖-阿爾金山地區(qū)[1]、四川若爾蓋濕地國家級自然保護(hù)區(qū)[2]、貴州草海國家級自然保護(hù)區(qū)[3]、西藏日喀則地區(qū)[4]、云南大山包黑頸鶴自然保護(hù)區(qū)[5]等地繁殖或越冬?；寅Q是大型涉禽，在我國大部分地區(qū)均可看到。黑頸鶴和灰鶴的食性、鳴叫行為、取食范圍[6]、生理指標(biāo)均相近[7]，而且經(jīng)筆者觀察，草海黑頸鶴和灰鶴存在混群生活的現(xiàn)象，然而它們的遺傳差異目前不得而知。

線粒體DNA是細(xì)胞核外的遺傳物質(zhì)，是可以在基因組水平上研究的分子標(biāo)記，具有母系遺傳的特點(diǎn)，其分子量小、結(jié)構(gòu)簡單、無內(nèi)含子、種內(nèi)幾乎無重排、進(jìn)化速度快、無組內(nèi)特異性等特點(diǎn)，是研究動物遺傳分化的有力工具[8]。本研究測定了黑頸鶴和灰鶴部分個體的線粒體COI基因，結(jié)合GenBank數(shù)據(jù)庫中的黑頸鶴和灰鶴的線粒體COI基因及基因組序列，對黑頸鶴和灰鶴分別從多個體的COI基因及單個體的線粒體基因組進(jìn)行比較分析，探討其遺傳差異。

1 材料與方法

1.1 材料

于2016年1月從貴州草海國家級自然保護(hù)區(qū)獲得了8份黑頸鶴糞便和4份灰鶴糞便。糞便樣品均來自于黑頸鶴和灰鶴的覓食地。利用遠(yuǎn)距離觀察法，待黑頸鶴或灰鶴取食離開后，采用無菌手套進(jìn)行糞便收集，收集時為避免樣品重復(fù)，收集的糞便間距均大于2 m，全部實(shí)驗(yàn)樣品都浸泡在含無水乙醇的EP管中，冰袋冷藏，立即運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，并于-20°C冰箱冷凍保存。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

實(shí)驗(yàn)采用糞便基因組DNA 提取試劑盒(Stool Genomic DNA Kit，康為世紀(jì))進(jìn)行糞便的DNA提取，提取方法參閱試劑盒所帶說明書，由于此試劑盒提取的DNA濃度很低，為了提高濃度，在初始時糞便盡量稱取0.3 g，結(jié)束時，加30 μL水溶解DNA，于4℃冰箱保存待用。

1.2.2 PCR擴(kuò)增及測序

參考GenBank中鶴屬鳥類的COI序列，使用Primer primier 5.0軟件設(shè)計簡并引物，用于從提取的糞便DNA中擴(kuò)增黑頸鶴和灰鶴的COI基因。引物序列如表1，引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。采用普通PCR進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s，50℃復(fù)性30 s，72℃延伸1 min，重復(fù)30個循環(huán)；72℃再延伸8 min。反應(yīng)體系為25 μL，包括：TaqPCR Master Mix (2×，blue dye)12.5 μL，上下游引物各1 μL(10 μmol/L)，模板1 μL (10～100 ng/μL)，加ddH2O補(bǔ)足。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接送此公司進(jìn)行單向測序，測序引物選擇5348F或6085R均可。

表1 黑頸鶴和灰鶴COI基因引物設(shè)計序列

1.2.3 序列分析

首先使用BioEdit v7.0.5(http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/page2.html)對測序所得峰圖文件進(jìn)行檢驗(yàn)，保證使用的序列均為單峰。結(jié)合從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載的黑頸鶴和灰鶴的COI序列，整理成一個Fasta文件。后使用MEGA7.0[9]軟件對此文件進(jìn)行堿基組成(Base composition)及遺傳距離分析：采用p-距離法重復(fù)1000次，分析黑頸鶴和灰鶴的種間遺傳距離；采用Kimura 2-參數(shù)模型重復(fù)1000次，分別分析黑頸鶴和灰鶴的種內(nèi)遺傳距離；對黑頸鶴和灰鶴的線粒體基因組進(jìn)行核苷酸組成，蛋白編碼基因核苷酸組成的比較分析。使用DnaSPv6[10]軟件進(jìn)行黑頸鶴和灰鶴的COI的變異位點(diǎn) (Variable sites)、簡約信息位點(diǎn) (Parsimony informative sites)、單倍型及單倍型多樣性的分析，對線粒體基因組各段基因進(jìn)行變異位點(diǎn)分析及比例計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列組成分析

本實(shí)驗(yàn)共獲得黑頸鶴COI基因8條，灰鶴COI基因4條，從GenBank數(shù)據(jù)庫下載黑頸鶴COI基因3條、線粒體基因組序列1條(FJ769851.1)，灰鶴COI基因5條、線粒體基因組序列1條(FJ769849.1)，序列詳細(xì)信息參見表2。從表2中的采集地可以看出，黑頸鶴和灰鶴的COI基因序列可能來自不同種群(遷徙鳥類，無法確定)。手動將參差不齊的序列取齊，共獲得COI基因序列片段長度637 bp，其中，黑頸鶴序列中 A+T 含量為 51.20%，G+C 含量為 48.80%；而灰鶴序列中 A+T 含量為 51.80%，G+C 含量為 48.20%；說明二者的COI序列轉(zhuǎn)換與顛換的發(fā)生率近似，而這種存在AT偏好性的現(xiàn)象也同樣發(fā)生在其他脊椎動物中[14]。利用DnaSPv6軟件分析發(fā)現(xiàn)，黑頸鶴的變異位點(diǎn)和簡約信息位點(diǎn)均為0，單倍型為1，單倍型多樣性為0，核苷酸多樣性為0，說明COI基因并不適用于黑頸鶴種群間的差異分析；灰鶴的變異位點(diǎn)為1，簡約信息位點(diǎn)為0，單倍型為2，單倍型多樣性為0.032 47，核苷酸多樣性為0.000 39，說明灰鶴種群間的COI基因有輕微變異，但此基因仍不適用于灰鶴種群內(nèi)的遺傳差異分析。然而，黑頸鶴和灰鶴COI序列間的變異位點(diǎn)為11個，簡約信息位點(diǎn)為10，所以COI適用于作為黑頸鶴和灰鶴種間分析的分子標(biāo)記。基于11只黑頸鶴和9只灰鶴的COI基因，共計20條序列，計算的種間遺傳距離為0.016；黑頸鶴和灰鶴的種內(nèi)遺傳距離均為0，說明黑頸鶴和灰鶴的種內(nèi)交流頻繁且變異小。

表2黑頸鶴和灰鶴的COI基因和線粒體基因組的GenBank檢索號及序列來源

2.2 比較線粒體基因組分析

黑頸鶴的線粒體基因組序列長度為16 646 bp，灰鶴的為16 649 bp，包含13個蛋白編碼基因，22個tRNA基因，2個rRNA基因和一個控制區(qū)。通過對兩種鶴的線粒體基因組基因組成和各基因的變異位點(diǎn)及其所占比例(表3)發(fā)現(xiàn)：兩種鶴的線粒體基因排列順序均與鳥類典型的線粒體基因排列順序一致[15]；除16SrRNA基因片段長度有2 bp的差異外，其余基因均等長。各基因中變異位點(diǎn)所占比例高于線粒體基因組變異位點(diǎn)比例(0.020 31)的基因有控制區(qū)ND1(0.020 70)、ND2 (0.024 98)、tRNATyr(0.028 17)、ATP8(0.028 74)、ATP6(0.026 32)、ND3(0.025 57)、ND4(0.021 93)、tRNASer(0.030 30)、ND5(0.030 85)、Cytb(0.028 00)、CR(0.046 28)和ND6(0.024 90)。其中，CR、tRNASer、tRNATyr、Cytb的變異位點(diǎn)比例較高，但tRNASer和tRNATyr片段較短，所含信息量較少，不足以提供足夠的信息位點(diǎn)，因此，本研究認(rèn)為CR和Cytb可作為區(qū)分黑頸鶴和灰鶴的分子標(biāo)記。

表3 黑頸鶴和灰鶴線粒體基因組比較

3 討論

3.1 遺傳差異分析

遺傳多樣性是物種保持進(jìn)化潛能的基礎(chǔ)[16]，研究物種的遺傳多樣性對瀕危物種的保護(hù)、保護(hù)等級及優(yōu)先保護(hù)單元的確定具有極為重要的意義。其中，遺傳變異作為保護(hù)遺傳學(xué)研究的重要內(nèi)容，從一定程度上可反映遺傳多樣性。本研究中，黑頸鶴COI基因的核苷酸多樣性和單倍型多樣性均為0，灰鶴COI基因的核苷酸多樣性和單倍型多樣性比黑頸鶴偏高，兩種鶴的遺傳多樣性都處于極低水平，各種群均未出現(xiàn)遺傳分化，說明需要對這兩種鶴加大保護(hù)力度，以降低滅絕風(fēng)險。

3.2 分子標(biāo)記選擇

合適的分子標(biāo)記在物種鑒定、種群遺傳學(xué)和系統(tǒng)進(jìn)化研究中至關(guān)重要[17]。在黑頸鶴和灰鶴的線粒體全基因組的37個基因中有12個基因的變異位點(diǎn)所占比例高于全線粒體基因組，說明除線粒體基因組外，還有其他基因可作為黑頸鶴和灰鶴系統(tǒng)發(fā)育位置的分子標(biāo)記。COI作為分子標(biāo)記常用于昆蟲的分子系統(tǒng)學(xué)中，鳥類分類學(xué)研究中應(yīng)用較少，被認(rèn)為適用于分析科內(nèi)屬間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系[18]，在本研究中COI基因的變異位點(diǎn)所占比例僅為0.009 66，僅高于12SrRNA(0.008 26)、COII(0.007 31)和幾個變異位點(diǎn)所占比例為0的tRNA基因，但仍可以區(qū)分黑頸鶴和灰鶴?？刂茀^(qū)CR又稱D-loop區(qū)，由于所受選擇壓力較小，進(jìn)化速率相對較快，被認(rèn)為是線粒體基因組中堿基替換和長度變異最大的區(qū)域[19]，黑頸鶴和灰鶴的CR基因均符合這一規(guī)律。Cytb基因被廣泛應(yīng)用于鳥類系統(tǒng)學(xué)研究中，在黑頸鶴和灰鶴的蛋白編碼基因中，Cytb的變異位點(diǎn)所占比例僅次于CR。在今后的研究中可考慮將這兩個基因作為潛在的分子標(biāo)記用于有效區(qū)分黑頸鶴和灰鶴，而且研究已證實(shí)CR可用于區(qū)分灰鶴、丹頂鶴和白頭鶴的不同種群[20]，Cytb是否可用于區(qū)分其它鶴屬鳥類、鶴類種群還需進(jìn)行深入分析。