欒 劍

LUAN Jian

(吉林師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林 四平 136000)

(College of Life Science, Jilin Normal University, Siping, Jilin 136000, China)

囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)運調(diào)節(jié)因子(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR)是一種定位于上皮細(xì)胞頂膜的氯離子通道，在囊性纖維化、多囊腎病、分泌性腹瀉等疾病的發(fā)病機制中，扮演重要的角色。遺傳性致死疾病囊性纖維化，是由于CFTR基因的突變造成，簡單一個基因位點的缺失就造成整個機體所有CFTR氯離子通道功能的不足，影響著呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、運動系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)的正常運作，病人平均壽命只有30余年。而當(dāng)CFTR氯離子通道功能被過度激活時，會造成多囊腎病、白血病和霍亂等嚴(yán)重的疾病癥狀。因此，自1989年CFTR基因被鑒別出來之后[1]，在學(xué)界造成巨大轟動，多個團隊接連報道了多項高水平的研究，對CFTR的認(rèn)識到達了前所未有的高度[2-5]。而能夠有效調(diào)節(jié)CFTR氯離子通道活性的調(diào)節(jié)劑(包括激活劑和抑制劑兩大類)也進入科研視野，迅速成為了科學(xué)研究和藥物研發(fā)的熱點。

自從CFTR調(diào)節(jié)劑的重要性被認(rèn)知以來，相對于高親和力高特異性的CFTR激活劑的大量涌現(xiàn)，抑制劑的發(fā)現(xiàn)和研究就顯得推進緩慢，因此，每一個抑制劑的發(fā)現(xiàn)都顯得彌足珍貴。早期的CFTR抑制劑的兩大類是芳基氨基苯甲酸鹽和磺酰脲類，這些物質(zhì)可以進入CFTR氯離子通道的空隙當(dāng)中，并通過機械性的堵塞方式，暫時性地阻止流動的一價陰離子,直到抑制劑被洗脫。芳基氨基苯甲酸中典型的有5-硝基-2-(3-苯基丙基胺)-苯甲酸(NPPB)， 有報道[6]指出，該類化合物并不是CFTR氯離子通道特異性的抑制劑，膜片鉗試驗表明是對CFTR-電壓依賴性的抑制而導(dǎo)致CFTR氯離子通道的閉鎖。早期的磺酰脲類化合物主要是作為抑菌劑在使用，其中格列本脲在更高濃度下可以抑制CFTR[7]，其作用機制是通過在CFTR氯離子通道處于開放狀態(tài)時，與孔道結(jié)合并堵塞，從而達到抑制的作用[8]。雖然以上兩類化合物可以抑制CFTR氯離子通道，但是，通常需要較高的濃度(>1×10-4mol)才能達到較好的效果[9]，根源在于非特異性抑制劑會同時使得其下游的多種離子通道和細(xì)胞膜表面轉(zhuǎn)運子都會受到影響。這些早期發(fā)現(xiàn)的CFTR氯離子通道的阻斷物是一組結(jié)構(gòu)多樣的帶陰離子的有機大分子，表明阻斷物從胞質(zhì)末端進入CFTR氯離子通道孔隙的過程幾乎沒有特異性或大小區(qū)分。此外，大多數(shù)阻斷劑的活性較低，而且由于簡單的堵塞作用機制，這些阻斷劑都是沒有專一性的。這些CFTR阻斷劑的低活性、低專一性的性質(zhì)大大限制了它們的應(yīng)用前景。此外，這些物質(zhì)中的部分還阻斷了其他類型的氯離子通道[10]，使得這類阻斷劑特別容易影響到其他不同的離子通道。顯而易見，專一性強的抑制劑無論在試驗、造模還是藥物研發(fā)方面都是極其重要的一個特性，然而，在當(dāng)時并沒有特異性的CFTR抑制劑被發(fā)現(xiàn)。

因此，對于抑制活性強、專一性高的小分子抑制劑的需求日益迫切，亟待一個全新的手段加速對潛在抑制活性的化合物進行測試和篩選。

1 CFTR小分子抑制劑的篩選策略

1.1 小分子化合物庫

天然的小分子活性化合物是當(dāng)今藥物研發(fā)的最主要來源，隨著高通量篩選技術(shù)(High Throughput Screening，HTS)的誕生和日趨完善，使得天然活性小分子的快速高效篩選成為了可能，令全球新藥的開發(fā)工作有了一個質(zhì)的飛躍?；贑FTR抑制劑在藥物發(fā)現(xiàn)和藥理研究中日趨迫切的訴求，許多CFTR門控調(diào)節(jié)劑研發(fā)的相關(guān)課題組都以ChemBridge公司(San Diego，USA)和ChemDiv公司(San Diego，USA)的小分子化合物庫為依托，在共計超過150萬小分子化合物庫中篩選目的藥物的先導(dǎo)化合物及其結(jié)構(gòu)類似物，并可以依據(jù)藥物性質(zhì)需求對化學(xué)結(jié)構(gòu)進行分析乃至定制構(gòu)建全新結(jié)構(gòu)的化合物。

1.2 細(xì)胞系構(gòu)建

Verkman課題組[11]創(chuàng)造性地構(gòu)建了穩(wěn)定遺傳的表達人源CFTR基因和H148Q基因的FRT細(xì)胞系，并以此為依托進行CFTR特異性抑制劑的高通量篩選；這種細(xì)胞系是以人的野生型CFTR基因和對鹵族元素敏感的綠色熒光蛋白(H148Q)基因穩(wěn)定共轉(zhuǎn)染的wt-CFTR-H148Q-FRT細(xì)胞系；從報道的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)來看，構(gòu)建成功的細(xì)胞系可以至少穩(wěn)定傳代15次而不降低YFP-H148Q熒光效能。

1.3 高通量篩選

將穩(wěn)定表達野生型CFTR-YFP-H148Q的細(xì)胞系鋪板培養(yǎng)。空白對照組加入50 μL saline；陰性對照組加入50 μL 3種混合的激活劑；陽性對照組加入50 μL 混合的激活劑加2×10-5mol CFTRinh-172；樣品組在各孔中加入50 μL 混合的激活劑，于培養(yǎng)箱孵育5 min，再加入0.5 μL的待測化合物。通過配備有HQ500 / 20X激發(fā)和HQ535 / 30M發(fā)射濾光片(Chroma Technology)的Fluostar酶標(biāo)儀(BMG LabTechnologies)記錄單個孔內(nèi)的熒光數(shù)據(jù)變化[圖1(a)]。細(xì)胞表面的CFTR氯離子通道被混合的激活劑預(yù)先處理而活化，通道處于開放狀態(tài)，鹵族元素離子可以自由出入。由于細(xì)胞系表達的綠色熒光蛋白(H148Q)對鹵族元素敏感，當(dāng)鹵族元素離子經(jīng)由開放的CFTR氯離子通道進入細(xì)胞后，會使熒光猝滅。當(dāng)Fluostar酶標(biāo)儀向各個孔道逐一注入NaI溶液時，如果待測化合物能夠抑制CFTR氯離子通道的活性，將會關(guān)閉離子通道，則I-進入胞內(nèi)的量會大幅下降，而監(jiān)測結(jié)果該孔的熒光信號減弱的程度明顯低于對照組[圖1(b)]。分析單通道熒光值的數(shù)據(jù)，可以高效篩選出具有抑制CFTR氯離子通道活性的小分子化合物。

2 噻唑烷酮小分子CFTR抑制劑

2.1 噻唑烷酮CFTR抑制劑的發(fā)現(xiàn)

2002年，Verkman課題組[13]依托于ChemBridge (San Diego，USA)大型的化合物庫對50 000種構(gòu)象各異的小分子化合物進行高通量篩選，最終得到6種2-thioxo-4-thiazolidinone化學(xué)結(jié)構(gòu)的CFTR小分子抑制劑[圖1(c)]。在所有直接篩選獲得的化合物中以噻唑烷酮3-[(3-三氟甲基)苯基]-5-[(4-羧基苯基)亞甲基]-2-硫代-4-噻唑烷酮(CFTRinh-172)的活性最高。對CFTRinh-172的活性分析數(shù)據(jù)如下：① 在熒光細(xì)胞試驗中3×10-4mol的CFTRinh-172對CFTR介導(dǎo)的短路電流在2 min內(nèi)達到最大值；② 以與電壓無關(guān)的方式抑制CFTR；③ 其抑制活性具有可逆性；④ 在細(xì)胞培養(yǎng)和小鼠模型中，CFTRinh-172在高濃度下沒有表現(xiàn)出毒害性；⑤ CFTRinh-172的抑制作用具有高度的專一性，在完全抑制CFTR的濃度下，不能阻止細(xì)胞cAMP升高，不能抑制非CFTR Cl-通道或其他相關(guān)轉(zhuǎn)運蛋白；⑥ 在6 min內(nèi)，小鼠單次腹腔注射CFTRinh-172(250 μg/kg)可顯著減少小腸中超過90%的霍亂毒素誘導(dǎo)的腸道液體分泌[13]。CFTRinh-172被報道之后，因其活性好專一性高引起本領(lǐng)域科學(xué)家的廣泛興趣，CFTRinh-172構(gòu)象和活性的種種特點陸續(xù)被揭示，被譽為CFTR小分子抑制劑的金標(biāo)準(zhǔn)，目前，依然是CFTR領(lǐng)域科研試驗的標(biāo)準(zhǔn)參照物。

A. 自動高通量篩選的原理圖[12]B. 高通量篩選的流程[13]C. 上部為 2-thioxo-4-thiazolidinone CFTR抑制劑的化學(xué)構(gòu)架，底部為6種有最好的CFTR抑制活性的結(jié)構(gòu)類似物[13]

圖1 高通量篩選CFTR氯離子通道抑制劑

Figure 1 High-throughput screening to identify CFTR inhibitors

2.2 噻唑烷酮CFTR抑制劑的構(gòu)象

噻唑烷酮是一種飽和形式的噻唑烷，它的第4個碳上有羰基，被認(rèn)為是一種具有幾乎所有生物活性類型的神奇的核[14]。Verkman團隊[15]合成了58種CFTRinh-172的結(jié)構(gòu)類似物，以鑒定和改善具有較好水溶性的CFTR抑制劑。如圖2所示，A環(huán)3位上的—CF3、B環(huán)上含有噻唑烷酮的核心以及 C環(huán)4號位上的羧基化合物對于CFTR的抑制作用最強。同時，還鑒定了2種具有很高抑制活性的化合物：Tetrazolo-172和Oxo-172，它們還兼具了較好的水溶性和較低的毒性，這樣的結(jié)構(gòu)探索使得CFTRinh-172成為相關(guān)CFTR抑制劑研究和開發(fā)的先導(dǎo)化合物，不斷受到追捧。

2.3 噻唑烷酮CFTR抑制劑的作用機制

2002年之前發(fā)現(xiàn)的CFTR抑制劑都是通過簡單的機械堵塞作用來阻斷細(xì)胞質(zhì)一側(cè)的孔道，故而活性和專一性都較差。而CFTRinh-172分子在正常生理pH值下含有一個負(fù)電荷，并以一種與電壓無關(guān)的方式阻斷CFTR介導(dǎo)的 Cl-電流[13]。Taddei等[16]指出單通道電壓膜片鉗數(shù)據(jù)顯示CFTRinh-172阻斷CFTR氯離子通道導(dǎo)致通道平均閉合時間延長，而不改變通道平均開放時間。這種影響是由于平均通道關(guān)閉時間延長而沒有改變平均通道開放時間。 短路電流試驗[17]表明抑制野生型G551D和G1349D CFTR中Cl-電流的CFTRinh-172抑制效力相似；然而，對于ΔF508CFTR，Ki則顯著降低。CFTRinh-172的應(yīng)用導(dǎo)致平均關(guān)閉時間的延長和頻道平均開放時間的縮短。數(shù)據(jù)[18]分析可見，CFTRinh-172不僅僅是簡單的孔隙阻斷劑：① CFTRinh-172 可以同時在CFTR氯離子通道開放和閉合2種不同的狀態(tài)下與之結(jié)合；② CFTRinh-172結(jié)合引發(fā)了CFTR蛋白的變構(gòu)效應(yīng)，起到抑制CFTR的作用，這明顯與簡單的堵孔的方式不同；③ CFTRinh-172的效力與開放時間之間的關(guān)系：開放時間越長，IC50就越低；④ 不能通過干擾NBD二聚體發(fā)揮作用。

圖2 噻唑烷酮CFTR抑制劑的結(jié)構(gòu)活性分析 [15]

2.4 CFTRinh-172的藥代動力學(xué)研究

使用14C標(biāo)記的CFTRinh-172，液相色譜及質(zhì)譜聯(lián)用以及小鼠腸道閉環(huán)模型分析研究CFTRinh-172藥理學(xué)和嚙齒動物的抗腹瀉效力，發(fā)現(xiàn)：① CFTRinh-172主要通過腎小球濾過而未經(jīng)化學(xué)修飾而被清除；② CFTRinh-172在小鼠靜脈輸注后5 min內(nèi)在肝中累積，此時膽汁中濃度是血液的5倍；③ 在給藥30～240 min時，CFTRinh-172主要富集在肝、腸和腎中，在腦、心臟、骨骼肌和肺中幾乎檢測不到；④ 大鼠靜脈推注后的藥代動力學(xué)分析顯示，分布容量為770 mL，再分布和消除半衰期分別為0.14，10.30 h；⑤ CFTRinh-172在肝微粒體中穩(wěn)定；⑥ 小鼠腸道閉環(huán)模型研究表明，單次腹腔注射20 mg的 CFTRinh-172可抑制霍亂毒素在十二指腸和空腸中的累積，在6 h后>90%，回腸中為60%和結(jié)腸中則不足10%；⑦ 在小鼠出生后6周內(nèi)，高劑量CFTRinh-172給藥[3 mg/(kg·d)，每日2次劑量]沒有觀察到毒性[19-20]。可以說，CFTRinh-172的代謝穩(wěn)定性、腸肝循環(huán)、腎功能減退、腸內(nèi)蓄積等特性是其良好止瀉作用的主要原因。

3 噻唑烷酮CFTR抑制劑與疾病

3.1 分泌性腹瀉

前面提到，CFTR氯離子通道是Cl-跨越腸道上皮細(xì)胞頂膜運輸?shù)闹饕緩?，?dāng)CFTR氯離子通道受到腸毒素影響而功能亢進時，Cl-等電解質(zhì)由小腸上皮細(xì)胞被大量排放到腸腔，從而驅(qū)動水分在滲透壓作用下流失，是分泌性腹瀉發(fā)病機制的關(guān)鍵性節(jié)點[21]。小分子CFTR抑制劑可減少動物模型中腸毒素誘導(dǎo)的腸道液體分泌。通過CFTRinh-172等專一性抑制劑關(guān)閉CFTR氯離子通道，在不干擾其他正常運轉(zhuǎn)的離子通道和轉(zhuǎn)運子的前提下，阻斷電解質(zhì)流失，成為治療分泌性腹瀉的新策略[22-23]。 在大鼠閉環(huán)模型中，單次腹膜內(nèi)注射200 μg的CFTRinh-172阻斷了90%以上的霍亂毒素和70% STa大腸桿菌毒素所誘導(dǎo)的腸液分泌；而在小鼠開環(huán)霍亂模型中，通過口服方法給藥的CFTRinh-172降低了≥90% 的霍亂毒素誘導(dǎo)的腸道液體分泌量[24]。CFTRinh-172顯著降低由cAMP依賴的霍亂弧菌，大腸桿菌和霍亂弧菌等病菌分泌的腸毒素引起的腸道內(nèi)電解質(zhì)分泌和水分流失，因此可以有效減少感染性、分泌性腹瀉中的腸道液體分泌。

圖3 腸道分泌途徑[22]

3.2 多囊腎病

多囊腎病(PKD)是一種人類遺傳性腎臟疾病，會導(dǎo)致腎功能衰竭。多囊腎病目前還沒有獲得批準(zhǔn)的藥物或是有效的預(yù)防策略，患者只能接受透析和腎臟移植。有報道[25]指出CFTRinh-172可以在MDCK細(xì)胞培養(yǎng)模型中抑制PKD囊腫的生長。后續(xù)有體外試驗[26]表明，CFTRinh-172在腎上腺器官的培養(yǎng)中起到延緩囊腫生長的作用。其后有數(shù)據(jù)[27-28]顯示，CFTRinh-172在試驗中幾乎完全抑制囊腫生長而不影響細(xì)胞增殖，同時還表現(xiàn)出了對囊腫數(shù)量和胚胎腎囊腫模型生長的顯著抑制；對新生兒腎特異性PKD1敲除小鼠進行皮下注射，治療小鼠7 d，對腎腫大、囊腫擴張和腎功能損害顯著降低，這些結(jié)果表明CFTR抑制劑具有減少PKD中囊腫生長的潛力。需要注意的是，如果選擇長期通過CFTR抑制劑治療，意味著需要抑制超過九成的CFTR氯離子通道，而這勢必會影響到呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)乃至生殖系統(tǒng)正常的功能。因此，CFTRinh-172投入使用尚需進一步的臨床前評估來判斷。

3.3 白血病

CFTR的異常表達或突變會導(dǎo)致一系列疾病，其中包括白血病[29]和胰腺癌[30]這樣的惡性腫瘤。Yan等[31]報道CFTRinh-172可以在K562和SUP-B15細(xì)胞中降低HDAC2蛋白的表達，并導(dǎo)致PTEN在mRNA和蛋白質(zhì)水平的增加以及PDK1和mTOR(PTEN的下游信號傳導(dǎo))活性的降低，而MTT試驗顯示CFTRinh-172可在Ph+白血病細(xì)胞中增強HDAC2的抑制劑的抗增殖作用。CFTR在急性髓系白血病患者及白血病細(xì)胞中均顯著呈高表達。TF1細(xì)胞中加入CFTR特異性抑制劑后，細(xì)胞的活力下降，細(xì)胞凋亡率顯著增加。CFTRinh-172可以抑制CFTR，通過經(jīng)典的Wnt信號通路抑制白血病細(xì)胞株TF1的生長，并促進其凋亡[32]。

4 結(jié)論與展望

CFTR功能亢進會導(dǎo)致分泌性腹瀉(如與霍亂相關(guān)的腹瀉)腸道液體分泌過多[33]。常染色體顯性遺傳性多囊腎病(ADPKD)是最常見的遺傳性腎病，腎上皮細(xì)胞CFTR介導(dǎo)的Cl-轉(zhuǎn)運也是常染色體顯性遺傳性多囊腎病(ADPKD)腎囊腫積液和生長的基礎(chǔ)[34]。CFTR在這種常見和嚴(yán)重疾病狀態(tài)中的參與使其成為治療干預(yù)的一個有吸引力的靶點，而CFTRinh-172因為直接與CFTR蛋白相互作用，高親和性、高專一性被證明是極其有用的試驗工具和先導(dǎo)化合物。

近年來，在CFTRinh-172發(fā)現(xiàn)之后，高通量篩選技術(shù)已被用于識別更有效的CFTR抑制劑，GlyH-101[35]、iOWH032[36-37]、PPQ-102[38]、Oridonin[39]等小分子化合物先后被篩選面世，獲得很高評價，而天然產(chǎn)物中的化合物，如cocoa flavanols[40]、EGCG和ECG[41]因為其安全性也備受肯定。其中，CFTRinh-172抑制細(xì)胞膜細(xì)胞質(zhì)側(cè)的CFTR，而GlyH-101引起膜外側(cè)的電壓依賴性阻滯，它們通過不同的機制抑制CFTR。CFTRinh-172已被證明能優(yōu)先與開放通道結(jié)合，可能會引發(fā)構(gòu)象變化，使其失活。由于不同的側(cè)向作用，CFTRinh-172應(yīng)用于膜的胞內(nèi)側(cè)時優(yōu)先，GlyH-101應(yīng)用于胞外，但是這2種較強的選擇性抑制劑至今依然是試驗中抑制CFTR活性的首選藥物。

有報道[42]指出CFTRinh-172在無CFTR氯離子通道蛋白表達的細(xì)胞中會誘導(dǎo)活性氧的產(chǎn)生，并導(dǎo)致線粒體功能的衰竭。由于存在潛在風(fēng)險，對于CFTRinh-172的實際應(yīng)用需要審慎看待，但這些試驗數(shù)據(jù)與氯化物的運輸損失是否有關(guān)還有待于進一步研究。而且，一直被關(guān)注的CFTRinh-172水溶性差的問題也需要通過多方面的考量來解決。盡管如此，可以樂觀地預(yù)見未來10年必將會誕生CFTR抑制劑新藥來預(yù)防和治療多囊腎病、腹瀉病和白血病等惡性疾病，給CFTR相關(guān)疾病的藥物研發(fā)帶來光明前景。