張 鑫 李瑞玲 孫學(xué)茹 吳 瓊 吳曉彤

ZHANG Xin LI Rui-ling SUN Xue-ru WU Qiong WU Xiao-tong

(內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010070)

(College of Life Science, Inner Mongolia University, Hohhot, Inner Mongolia 010070, China)

歐李(prunus humilis)因鈣含量高又稱作鈣果，屬于薔薇科櫻桃屬落葉小灌木，原產(chǎn)中國三北地區(qū)，現(xiàn)在主要分布于中國北方的山西、內(nèi)蒙古、遼寧等地[1]，是果藥兼用的野生樹種，其莖、葉、根皮和果實部位都具有較高的藥用和經(jīng)濟(jì)利用價值。歐李果肉中富含維生素、礦物質(zhì)、人體必需氨基酸等[2]。目前歐李果實及其系列產(chǎn)品歐李果脯、果汁、醋、紅色素、芳香物質(zhì)等均有研究開發(fā)[3-5]，歐李果實的工業(yè)生產(chǎn)日漸發(fā)展，果實加工后會產(chǎn)生大量的歐李仁，仁中的主要成分包括苦杏仁苷、歐李仁油和歐李仁蛋白[6]，三者都有較高的開發(fā)利用價值。近年來，關(guān)于歐李仁油和歐李仁蛋白提取分離工藝不斷優(yōu)化完善[7-9]，但對歐李仁中苦杏仁苷的研究有限，還未有完備的優(yōu)化工藝體系。

苦杏仁苷(amygdalin)是中國醫(yī)書中記載的一種常用藥，具有明確的生理、藥理活性，臨床上常用于止咳祛痰、鎮(zhèn)咳平喘、降血糖、抗凝血等，還可用于治療急慢性呼吸道感染、慢性氣管炎和膿皰病[10]。它可合用其他藥物治療皮膚癌[11]，抑制肺癌和前列腺癌細(xì)胞體外增殖[12-13]，促進(jìn)血T淋巴細(xì)胞分裂增殖[14]，且大量研究[15-17]表明苦杏仁苷在腫瘤、改善微循環(huán)、免疫抑制、動脈粥樣硬化、細(xì)胞纖維化等疾病方面的治療都起到了一定的輔助作用?？嘈尤受站哂锌捎^的臨床藥用價值，近年來，除杏仁外，其他原料如楊梅核仁、桃仁、枇杷核等也被作為提取苦杏仁苷的新來源。

苦杏仁苷的提取方法有很多，其中水提取、有機(jī)溶劑提取和超臨界CO2萃取法等較為常用。超臨界萃取法分離效果良好，但提取成本高，應(yīng)用到生產(chǎn)中有一定局限性；水和有機(jī)溶劑浸提法成本低，但耗時長、產(chǎn)率低。超聲波作用下原料細(xì)胞壁被破壞，有利于溶劑滲透到細(xì)胞中，從而提高提取率和縮短提取時間[18]，被廣泛用于提取分離植物中天然產(chǎn)物。本試驗擬以歐李種仁為原料，在以往傳統(tǒng)有機(jī)溶劑浸提法[19]的基礎(chǔ)上采用超聲輔助聯(lián)合提取苦杏仁苷，通過二水平試驗和響應(yīng)曲面法結(jié)合進(jìn)行工藝參數(shù)優(yōu)化，旨在為歐李的開發(fā)與利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

歐李種仁：安徽毫州徽濟(jì)堂；

苦杏仁苷標(biāo)準(zhǔn)品：98%， 南京澤朗醫(yī)藥科技集團(tuán)有限公司；

乙醇、石油醚：分析純，市售；

甲醇、乙腈：色譜純，市售。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

高效液相色譜儀：Agilent1260型，配有可變波長紫外檢測器和色譜工作站，安捷倫科技(中國)科技有限公司；

超聲波細(xì)胞破碎儀：Biosafer900-91型，賽飛中國有限公司；

水浴鍋：HH-6型，金壇市科興儀器廠；

中藥粉碎機(jī)：QE-500g型，浙江屹立工貿(mào)有限公司；

分析天平：BSA224S-CW型，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；

微波爐：G80F23CN1L_SD型，格蘭仕微波爐電器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 原料準(zhǔn)備 將歐李仁除雜后于烘箱中80 ℃干燥4 h除去水分，并于微波爐內(nèi)80火力滅酶4 min[20]，用高速中藥粉碎機(jī)粉碎3 min，過20目篩，粉末于-4 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 標(biāo)曲制作 準(zhǔn)確稱取0.02 g苦杏仁苷標(biāo)準(zhǔn)品充分溶解后置于10 mL 棕色容量瓶中，甲醇定容至刻度。 用移液槍依次準(zhǔn)確量取200，400，600，800，1 000 μL定容后溶液置于EP管中， 再分別加入相應(yīng)體積的甲醇補(bǔ)足至1 mL，得到終濃度分別為 400，800，1 200，1 600，2 000 μg/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液。用高效液相色譜法測定不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液相應(yīng)的峰面積。將標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)，制作苦杏仁苷標(biāo)準(zhǔn)曲線。

檢測條件：色譜柱 C18柱(150 mm × 4.6 mm，5 μm)；流動相為體積比20∶80的甲醇—水混合液；柱溫 30 ℃；檢測波長217 nm；流速1 mL/min；進(jìn)樣量20 μL，檢測時間15 min；進(jìn)樣次數(shù)2次。

1.2.3 提取苦杏仁苷

(1) 精確稱取2.5 g細(xì)粉末，加入25 mL石油醚在80 ℃水浴條件下回流萃取2 h，后真空抽濾除去油脂，石油醚(60～90 ℃沸程)通過旋蒸進(jìn)行回收，濾渣置于通風(fēng)櫥中2 h揮去殘留的石油醚后，得到脫脂粉末置于三角瓶中封口備用。

(2) 將2.5 g脫脂粉末，按液料比加入相應(yīng)體積的乙醇以保鮮膜封口，超聲細(xì)胞破碎儀破碎，結(jié)束后補(bǔ)足損失乙醇體積，置于水浴鍋中回流提取，過濾后得到粗提液。

(3) 檢查濾液體積，若回流過程中損失，補(bǔ)足損失乙醇體積，濾液于棕色試劑瓶中密封保存。

(4) 取1 mL過濾液于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，取部分用0.45 μm濾器過濾后，即得待測樣液。

(5) 試驗重復(fù)2次，利用高效液相色譜儀進(jìn)行測定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算含量。

1.2.4 提取率計算 苦杏仁苷得率按式(1)計算：

(1)

式中：

S——苦杏仁苷得率，%；

C——提取液中苦杏仁苷的濃度，mg/mL；

V——提取溶劑的體積，mL；

M——核仁質(zhì)量，g。

1.3 單因素試驗

(1) 固定乙醇濃度75%、提取溫度80 ℃、超聲時間15 min、超聲功率200 W，分別在液料比為4∶1，8∶1，12∶1，16∶1，20∶1 (mL/g)時提取苦杏仁苷，考察液料比對苦杏苷得率的影響。

(2) 固定液料比16∶1 (mL/g)、提取溫度80 ℃、超聲時間15 min、超聲功率200 W，分別在乙醇濃度為40%，50%，60%，70%，80%，90%，100%時提取苦杏仁苷，考察乙醇濃度對苦杏苷得率的影響。

(3) 固定液料比16∶1 (mL/g)、乙醇濃度75%、超聲時間15 min、超聲功率200 W，分別在提取溫度為30，40，50，60，70，80，90，100 ℃時提取苦杏仁苷，考察提取溫度對苦杏苷得率的影響。

(4) 固定液料比16∶1 (mL/g)、乙醇濃度75%、提取溫度80 ℃、超聲功率200 W，分別在超聲時間為10，20，30，40，50，60 min 時提取苦杏仁苷，考察超聲時間對苦杏苷得率的影響。

(5) 固定液料比16∶1 (mL/g)、乙醇濃度75%、提取溫度80 ℃、超聲時間15 min，分別在超聲功率為100，150，200，250，300，350 W時提取苦杏仁苷，考察超聲功率對苦杏苷得率的影響。

1.4 二水平試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，對料液比、乙醇濃度、提取溫度、超聲時間、超聲功率5個因素設(shè)置最高和最低2個水平，以苦杏仁苷得率為響應(yīng)值，進(jìn)行五因素二水平分析試驗。

1.5 響應(yīng)面試驗

通過對二水平試驗的數(shù)據(jù)分析，選擇對苦杏仁苷得率影響最顯著的因素以苦杏仁苷提取率為響應(yīng)值，建立三因素模型，使用Design-Expert 8.0軟件基于Box-Behnken試驗設(shè)計原理，進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計，試驗后對響應(yīng)面結(jié)果進(jìn)行二次回歸方程方差分析，從而得到最佳提取條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

如圖1所示，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=6.941x-780.13，相關(guān)系數(shù)為0.999 3。

2.2 單因素試驗

2.2.1 液料比對苦杏仁苷得率的影響 由圖2可知，苦杏仁苷得率與液料比呈正相關(guān)，但當(dāng)液料比>12∶1 (mL/g)后，得率增長趨勢不再明顯，考慮到實際加工生產(chǎn)中節(jié)約原料以及液料比過大不利于后期濃縮提純，所以選取4∶1，16∶1(mL/g) 進(jìn)行二水平試驗。

圖1 苦杏仁苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 液料比對得率的影響

2.2.2 乙醇濃度對苦杏仁苷得率的影響 由圖3可知，苦杏仁苷得率隨乙醇濃度的增加先上升后下降，在乙醇濃度為80%時苦杏仁苷得率最高，為4.24%，濃度>80%時提取率減小，可能是隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，歐李仁中其他醇溶性雜質(zhì)溶出使提取溶液黏度增大，不利于乙醇溶液向細(xì)胞內(nèi)滲透，從而影響了苦杏仁苷的溶出，降低了苦杏仁苷的提取量[21]。綜上選用40%和80%進(jìn)行二水平試驗。

2.2.3 提取溫度對苦杏仁苷得率的影響 由圖4可知，隨著提取溫度升高，提取率逐漸增大，升至80 ℃時得率最高，高于80 ℃時略有減少，可能是溫度低時苦杏仁苷溶出速率被降低，而過高溫會破壞苦杏仁苷的結(jié)構(gòu)[22]，溶劑易揮發(fā)，使產(chǎn)率降低，故選擇30，80 ℃進(jìn)行二水平試驗。

2.2.4 超聲時間對苦杏仁苷得率的影響 由圖5可知，超聲時間>40 min以后，提取率隨著超聲時間延長而增加的趨勢不再明顯，原因是40 min左右的超聲處理已經(jīng)使大部分細(xì)胞破碎，再延長超聲時間也無法增加提取液中苦杏仁苷的含量?？紤]到實際生產(chǎn)中的效率問題，故選擇10，40 min進(jìn)行二水平試驗。

圖3 乙醇濃度對得率的影響

圖4 提取溫度對得率的影響

圖5 超聲時間對得率的影響

2.2.5 超聲功率對苦杏仁苷得率的影響 由圖6可知，隨著超聲功率的增大，苦杏仁苷得率逐漸升高，在超聲功率為200 W 時提取率最高，超聲波功率>200 W后又緩慢下降，功率過大和過小都不利于苦杏仁苷的提取，可能是超聲波功率過大時，過度破碎使細(xì)胞壁碎片以及大量不溶物等混入提取液中，使溶液中雜質(zhì)增多，不利于苦杏仁苷的浸出[23]。故選擇100，200 W進(jìn)行二水平試驗。

圖6 超聲功率對得率的影響

2.3 二水平試驗

為進(jìn)一步考察液料比、乙醇濃度、提取溫度、超聲時間和超聲功率對苦杏仁苷得率的影響，根據(jù)單因素變量試驗結(jié)果，分別選取每個因素里最高響應(yīng)值和最低響應(yīng)值所對應(yīng)的因素水平見表1，進(jìn)行五因素二水平優(yōu)化試驗，結(jié)果見表2。

以苦杏仁苷得率為響應(yīng)值，利用SPSS 16.0軟件對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行分析(表3)。由表3中F值可知，5個因素的改變對歐李種仁中苦杏仁苷得率的影響顯著性大小順序為A>B>E>D>C，即液料比>乙醇濃度>超聲功率>超聲時間>提取溫度，液料比的改變對苦杏仁苷得率的影響最為顯著，提取溫度的影響最不明顯。5個因素中，液料比、乙醇濃度、超聲功率和超聲時間所對應(yīng)的P值均<0.05，置信度>95%，提取溫度的P值>0.05，置信度<95%，但整體看來，A、B、E 3因素對得率的影響較大，所以選取液料比，乙醇濃度和超聲功率進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化試驗。

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

響應(yīng)面試驗因素及水平值見表4，對于提取溫度和時間兩項條件，從參考單因素試驗中的變化趨勢以及實際生產(chǎn)中的提高效率和節(jié)約能源出發(fā)，在接下來的試驗中，提取溫度取為70 ℃，超聲時間為40 min。

運(yùn)用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行設(shè)計及分析，表5為響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果，以苦杏仁苷得率為響應(yīng)因子，分析得到的回歸方程為：

表1 二水平試驗因素水平表

表2二水平試驗設(shè)計及結(jié)果

Table2 Scheme and experimental results of two-level, five-factor experimental design

試驗編號ABCDE得率/% 1-1-11-111.212-1-1-1110.783-1111-11.05411-1-115.775111114.3461-11-1-12.3371-1-11-11.978-11-1-1-11.87

表3 主體間效應(yīng)的檢驗?

?R2=0.996，調(diào)整R2=0.985。

R1=5.98+0.54A-0.45B-0.20C-0.26AB-0.40AC+0.10BC-1.20A2-2.55B2-1.83C2。

(2)

表4 響應(yīng)面三因素模型

表5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計及結(jié)果

表6 響應(yīng)面試驗方差分析結(jié)果?

? *表示差異顯著，P<0.05；**表示差異極顯著，P<0.01。

由F值可知3因素對苦杏仁苷得率的影響大小順序為A>B>C，與二水平試驗分析結(jié)果吻合。A、A2、B2、C2影響極顯著，一次項B、C，交互項AB、AC均為顯著，交互項BC不顯著，顯然各因素對得率的影響并不是簡單的一次關(guān)系，二次項也有顯著影響。

從圖7可以看出，當(dāng)超聲波功率為200 W時，乙醇濃度與液料比之間交互作用顯著。當(dāng)提取液料比一定時，隨著乙醇濃度的增加苦杏仁苷得率呈先增后減的趨勢，乙醇濃度在75%～80%時苦杏仁苷得率較大；當(dāng)乙醇濃度一定時，苦杏仁苷得率隨液料比的增加而增加，當(dāng)液料比達(dá)到 13∶1 (mL/g)后，得率上升不明顯。

由圖8可知，當(dāng)液料比為 12∶1 (mL/g) 時，乙醇濃度和超聲功率的交互作用對苦杏仁苷得率存在較顯著影響，苦杏仁苷得率隨著乙醇濃度及超聲功率的增加均呈先增大后減小的趨勢。

由圖9可知，當(dāng)乙醇濃度為80% 時，液料比和超聲波功率的交互作用顯著影響苦杏仁苷得率。當(dāng)提取液料比一定時，隨超聲波功率的增加，苦杏仁苷得率呈先增加后減少的趨勢。

圖7 乙醇濃度與液料比的交互作用

圖8 乙醇濃度與超聲功率的交互作用

圖9 液料比與超聲功率的交互作用

總體看，響應(yīng)面的陡峭程度隨液料比、乙醇濃度和超聲功率的變化起伏較大，等高線沿軸向變化相對密集，說明各因素對苦杏仁苷得率影響顯著。液料比與乙醇濃度、液料比與超聲功率的等高線圖呈明顯橢圓形，表明交互項AB、AC作用較強(qiáng)。以上結(jié)論與表6中方差分析一致。

2.5 優(yōu)化工藝條件及實驗驗證

通過二次回歸模型優(yōu)化確定歐李仁中苦杏仁苷最優(yōu)提取工藝條件為液料比13.01∶1 (mL/g)、乙醇濃度78.98%、超聲功率191.51 W，在此條件下，苦杏仁苷得率模型預(yù)測可達(dá)6.08%，考慮到實際應(yīng)用，將工藝條件修正為液料比13∶1 (mL/g)、乙醇濃度79%、超聲功率192 W進(jìn)行驗證實驗，實際操作測得得率為6.01%，與預(yù)測值相對誤差約為0.12%，相差較小，說明預(yù)測精度較高，回歸方程能較準(zhǔn)確地反映各因素對歐李仁中苦杏仁苷得率的影響。

3 結(jié)論

本試驗在單因素試驗和二水平試驗的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面試驗建立了超聲輔助歐李種仁中苦杏仁苷得率與液料比，乙醇濃度和超聲功率3因素之間的多元回歸模型，該模型具有良好的擬合性，試驗誤差較小，可用于歐李仁中苦杏仁苷得率的分析預(yù)測，最終確定了超聲輔助提取歐李仁中苦杏仁苷的最優(yōu)工藝條件為液料比13∶1 (mL/g)，乙醇濃度79%，提取溫度70 ℃，超聲時間40 min，超聲功率192 W，最終得率可達(dá)6.01%，高于常規(guī)非超聲輔助時歐李仁中苦杏仁苷的[19]，且略高于現(xiàn)有工藝中楊梅果核，桃核和枇杷核中苦杏仁苷含量[18,23-24]，但遠(yuǎn)低于杏仁中苦杏仁苷含量[25]。試驗中所涉及技術(shù)成熟，設(shè)備需求簡單常見，所使用有機(jī)溶劑可反復(fù)回收利用，在實際生產(chǎn)中具有較高可行性和經(jīng)濟(jì)性，對后續(xù)工業(yè)化開發(fā)有一定參考價值。不足之處是超聲破碎時處于室溫，未作恒溫處理，可能存在誤差；本試驗所得的苦杏仁苷提取溶液還需要后續(xù)進(jìn)一步純化，提高純度。