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        裸仁南瓜籽油活性成分分析及抗氧化能力評(píng)價(jià)

        2018-12-12 00:48:24田戴思慧沈鵬原賀向榮鐘晴劉東波
        食品與機(jī)械 2018年10期
        關(guān)鍵詞:南瓜籽鯊烯葡萄籽

        陳 田戴思慧沈鵬原賀向榮鐘 晴劉東波,3,4

        CHEN Tian1,2 DAI Si-hui1 SHEN Peng-yuan1,2 HE Xiang-rong1 ZHONG Qing1 LIU Dong-bo1,2,3,4

        (1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院,湖南 長(zhǎng)沙 410128;2. 國(guó)家中醫(yī)藥管理局亞健康干預(yù)技術(shù)實(shí)驗(yàn)室,湖南 長(zhǎng)沙 410128;3. 湖南省作物種質(zhì)創(chuàng)新與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南 長(zhǎng)沙 410128;4. 湖南省植物功能成分利用協(xié)同創(chuàng)新中心,湖南 長(zhǎng)沙 410128)

        (1. College of Horticulture and Landscape, Hunan Agricultural University, Changsha, Hunan 410128, China; 2. State Key Laboratory of Subhealth Intervention Technology, Changsha, Hunan 410128, China; 3. Hunan Provincial Key Laboratory of Crop Germplasm Innovation and Utilization, Changsha, Hunan 410128, China; 4. Hunan Coinnovation Center for Utilization of Botanical Functional Ingredients, Changsha, Hunan 410128, China)

        南瓜[Cucurbitamoschata(Duch. Ex Lam.)Duch. Ex Poir]屬葫蘆科(Cucurbitaceae)南瓜屬(Cucubita)一年生草本植物[1],在中國(guó)種植范圍廣,資源豐富,品種繁多,其口感甜美細(xì)膩,且具有降血糖、降血壓等功效[2]。南瓜籽是南瓜的成熟種子,其油脂含量豐富,經(jīng)榨取或浸提即得南瓜籽油[3]。2017年10月27日國(guó)家糧食局頒布了LS/T 3250—2017《南瓜籽油》標(biāo)準(zhǔn),南瓜籽油正式進(jìn)入食用油行列。南瓜籽油含有豐富的不飽和脂肪酸、植物甾醇、角鯊烯、氨基酸、胡蘿卜素、礦物質(zhì)及多糖等營(yíng)養(yǎng)成分[4],具有降血糖[5]、抑制男性禿頭[6]、殺蟲(chóng)[7]、治療前列腺增生[8]等作用。

        裸仁南瓜是南瓜的一種籽仁突變品種,在南瓜生長(zhǎng)進(jìn)化過(guò)程中,由籽仁木質(zhì)素的降低和缺失使種皮的第 2~4細(xì)胞層坍塌[9]。由于沒(méi)有堅(jiān)硬的外殼,可以直接食用,在食品加工過(guò)程中省去了剝皮的步驟,節(jié)省了大量的成本,具有很高的推廣價(jià)值[10]。已有學(xué)者對(duì)裸仁南瓜籽油的萃取工藝和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值進(jìn)行研究,如李全宏[11]探索了超臨界CO2流體萃取裸仁南瓜籽油的工藝,及其對(duì)油質(zhì)量的影響。劉玉梅等[12]分析了裸仁南瓜籽的營(yíng)養(yǎng)成分如粗脂肪、粗纖維、粗蛋白質(zhì)、微量元素等的含量,及裸仁南瓜籽油的脂肪酸組成和含量,發(fā)現(xiàn)鐵、鋅、銅、錳顯著高于普通南瓜籽。裸仁南瓜籽油脂肪酸含量高,主要包含以油酸和亞油酸為主的不飽和脂肪酸,其中亞油酸含量較花生油和菜籽油高。但目前對(duì)裸仁南瓜籽油其他活性成分,如植物甾醇、角鯊烯的組成及相對(duì)含量未見(jiàn)報(bào)道,其抗氧化功效研究也缺乏。

        本研究根據(jù)LS/T 3250—2017《南瓜籽油》標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)裸仁南瓜籽油,以香味純正清郁、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、深受消費(fèi)者青睞的葡萄籽油[13]和亞麻籽油[14]作為參照,采用GC-MS、HPLC分析比較裸仁南瓜籽油活性成分及其含量,并對(duì)裸仁南瓜籽油體外抗氧化活性進(jìn)行評(píng)價(jià),旨在為裸仁南瓜籽油的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與儀器

        1.1.1 材料與試劑

        裸仁南瓜籽油:依據(jù)本課題組專(zhuān)利[15]方法通過(guò)超臨界CO2萃取,在萃取壓力25 MPa,萃取溫度40 ℃,分離溫度50 ℃,分離壓力10 MPa條件下獲得;

        葡萄籽油、亞麻籽油:河南省鯤華生物技術(shù)有限公司;

        角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品:純度≥99.5%,中國(guó)藥品生物制品檢定所;

        甲醇:色譜純,德國(guó)Merch kGaA 公司;

        DPPH(2,2-Diphenyl-1-picryhydrazyl)、ABTS[2,2-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6磺酸)二銨鹽]:分析純,美國(guó)Sigma公司;

        BSTFA+TMCS(99∶1)試劑: 梯希愛(ài)(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司;

        福林酚試劑:合肥博美生物技術(shù)有限公司;

        Tris-HCl試劑:全式金生物技術(shù)有限公司;

        沒(méi)食子酸、氫氧化鉀、正己烷、無(wú)水硫酸鈉、石油醚、苯、二氯甲烷七水合硫酸亞鐵鄰苯三酚、過(guò)硫酸鉀、鐵氰化鉀:分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;

        三氯乙酸石油醚:沸程60~90 ℃,純度≥98%,百靈威科技有限公司。

        1.1.2 主要儀器設(shè)備

        電子分析天平:AE240型,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;

        pH計(jì):S210 SevenCompact型,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;

        氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀:GCMS-QP2020型,日本島津公司;

        紫外分光光度計(jì):UV-1800型,日本島津公司;

        超聲波清洗器:KQ5200DE型,昆山超聲儀器有限公司;

        電熱恒溫干燥箱:DHG9246型,上海精紅實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;

        離心機(jī):2-16R型,湖南恒諾儀器設(shè)備有限公司。

        1.2 方法

        1.2.1 裸仁南瓜籽油質(zhì)量檢測(cè)

        (1) 水分及揮發(fā)物的測(cè)定:直接干燥法,按GB 5009.236—2016進(jìn)行,重復(fù)測(cè)定3次。

        (2) 酸價(jià)的測(cè)定:冷溶劑指示劑滴定法,按GB 5009.229—2016進(jìn)行,重復(fù)測(cè)定3次。

        (3) 過(guò)氧化值的測(cè)定:滴定法,按GB 5009.227—2016進(jìn)行,重復(fù)測(cè)定3次。

        1.2.2 脂肪酸組成分析 準(zhǔn)確稱(chēng)取裸仁南瓜籽油50.0 mg于試管中,加入體積比為1∶1的石油醚-苯混合溶劑2 mL溶解,加入0.4 mol/L的KOH-甲醇溶液2 mL,混勻后于室溫放置30 min,加2 mL蒸餾水混勻,于5 000 r/min離心10 min,取上清液待測(cè)。采用峰面積歸一法得出各脂肪酸的相對(duì)含量,各色譜峰相應(yīng)的質(zhì)譜圖檢索采用NIST標(biāo)準(zhǔn)普庫(kù)。葡萄籽油和亞麻籽油作相同處理。

        (1) GC條件:選用SH-RXi-5Sil MS (30 m×0.25 mm×0.25 μm) 毛細(xì)管色譜柱;升溫程序?yàn)槠鹗紲囟?70 ℃,保持3 min,以10 ℃/min 升溫至 180 ℃,再以 2 ℃/min升溫至200 ℃,保持1 min,最后以 3 ℃/min 升溫至220 ℃,保持15 min;進(jìn)樣口溫度250 ℃,載氣為高純氦氣,分流比50∶1,柱流量1 mL/min,進(jìn)樣量1 μL,溶劑延遲3 min。

        (2) MS條件:電離方式為EI,電子能量70 eV,離子源溫度230 ℃,接口溫度250 ℃,質(zhì)量掃描范圍是40~550 u,全掃描方式。

        1.2.3 植物甾醇組成分析 取3.00 g裸仁南瓜籽油,加入1.5 mol/L 的KOH-乙醇溶液30 mL,于80 ℃水浴回流,進(jìn)行皂化反應(yīng)2 h。皂化完成,趁熱加入5 mL的蒸餾水,以皂化液和正己烷體積比為1∶1萃取2次,皂化液和正己烷體積比為2∶1萃取1次,合并萃取液,經(jīng)蒸餾水,20% KOH溶液,20%乙醇溶液,蒸餾水依次洗滌,至流出液為中性。合并上層正己烷層,加適量無(wú)水硫酸鈉除水,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮得干的不皂化物。取適量不皂化物,加200 μL BSTFA+TMCS(99∶1)試劑在80 ℃下衍生40 min,冷卻,加入0.5 mL CH2Cl2溶液,得衍生化樣品,待測(cè)。采用峰面積歸一法得出各植物甾醇的相對(duì)含量,各色譜峰相應(yīng)的質(zhì)譜圖檢索采用NIST標(biāo)準(zhǔn)普庫(kù)。葡萄籽油和亞麻籽油作相同處理。

        (1) GC條件:選用SH-RXi-5Sil MS (30 m×0.25 mm×0.25 μm)毛細(xì)管色譜柱;升溫程序?yàn)槌跏紲囟?50 ℃,保持3 min,以15 ℃/min升至290 ℃,保留20 min;進(jìn)樣口溫度280 ℃,載氣為高純氦氣,分流比50∶1,柱流量1 mL/min,進(jìn)樣量1 μL,溶劑延遲3 min。

        (2) MS條件:EI離子源,電子能量70 eV,離子源的溫度為230 ℃,接口溫度為280 ℃,質(zhì)量掃描范圍是40~550 u,全掃描方式。

        1.2.4 角鯊烯含量測(cè)定

        (1) 供試樣品溶液制備:取1.2.3所得的不皂化物,加甲醇溶解,定容至10 mL。得供試樣品。所制得的供試樣品按照1.2.4(3)色譜檢測(cè)條件進(jìn)樣,計(jì)算裸仁南瓜籽油角鯊烯含量,試驗(yàn)設(shè)置3組平行。葡萄籽油和亞麻籽油作相同處理。

        (2) 角鯊烯的標(biāo)準(zhǔn)曲線:準(zhǔn)確稱(chēng)取角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品20.0 mg,用甲醇溶解并定容至10 mL,獲得濃度為2 mg/mL的母液。分別取0.15,0.30,0.45,0.60,0.75 mL于10 mL容量瓶,溶解定容,制成0.30,0.60,0.90,1.20,1.50 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液,按照1.2.4(3)色譜檢測(cè)條件進(jìn)樣5 μL,以角鯊烯濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

        (3) 高效液相色譜條件:Agilent-ZORBAX SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相為甲醇,等度洗脫;柱溫30 ℃,流速0.8 mL/min,進(jìn)樣10 μL,檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm。

        1.2.5 抗氧化活性研究

        (1) 清除 DPPH自由基能力的測(cè)定:參考文獻(xiàn)[16~17]的方法,研究裸仁南瓜籽油清除 DPPH自由基的能力。葡萄籽油和亞麻籽油作相同處理。

        (2) 清除ABTS自由基能力的測(cè)定:參考文獻(xiàn)[18]的方法,研究裸仁南瓜籽油清除ABTS自由基的能力。葡萄籽油和亞麻籽油作相同處理。

        (3) 抗氧化能力評(píng)價(jià)指標(biāo)的計(jì)算:以油樣濃度為橫坐標(biāo),抗氧化能力為縱坐標(biāo),研究其相關(guān)性及變化趨勢(shì),求得計(jì)算公式。50%清除率對(duì)應(yīng)的濃度值為油樣自由基清除能力的IC50值,R為相關(guān)系數(shù),表示相關(guān)性(R值越接近1,相關(guān)性越好)。

        1.2.6 數(shù)據(jù)處理 通過(guò)Excel 2013處理數(shù)據(jù),利用OriginPro 8.6作圖。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 裸仁南瓜籽油質(zhì)量

        裸仁南瓜籽油的水分及揮發(fā)物為0.03%、酸價(jià)為1.32 mg/g、過(guò)氧化值為0.03 g/100 g,符合LS/T 3250—2017標(biāo)準(zhǔn)。

        2.2 脂肪酸組成

        裸仁南瓜籽油、葡萄籽油、亞麻籽油脂肪酸的GC-MS總離子流圖見(jiàn)圖1,脂肪酸組成及相對(duì)含量見(jiàn)表1。結(jié)果表明:裸仁南瓜籽油含有12種脂肪酸,以棕櫚酸、硬脂酸、共軛亞油酸為主。其中飽和脂肪酸8種,不飽和脂肪酸4種。不飽和脂肪酸含量高達(dá)74.68%,其中順式單不飽和脂肪酸、多不飽和脂肪酸相對(duì)含量分別為29.14%,45.54%。

        2.3 植物甾醇組成

        裸仁南瓜籽油、葡萄籽油、亞麻籽油植物甾醇的GC-MS總離子流圖見(jiàn)圖2,植物甾醇組成及相對(duì)含量見(jiàn)表2 。結(jié)果表明:3種油脂中植物甾醇含量最高的均為β-谷甾醇,在裸仁南瓜籽油中,β-谷甾醇含量達(dá)30.75%,△-7植物甾醇(麥角甾-7,22-二烯-3β-醇、膽甾-7-烯-3β,5α-二醇)含量相對(duì)較高,達(dá)10.76%,在葡萄籽油和亞麻籽油未檢測(cè)出麥角甾-7,22-二烯-3β-醇。

        2.4 角鯊烯含量

        角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品、裸仁南瓜籽油、葡萄籽油、亞麻籽油的HPLC色譜圖見(jiàn)圖3。角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=11.048X-17.61,R2=0.997 2,角鯊烯含量在300~1 500 μg/mL時(shí)線性關(guān)系良好;供試樣品連續(xù)進(jìn)樣6次,RSD為7.15%。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算,裸仁南瓜籽油、葡萄籽油、亞麻籽油中角鯊烯含量依次為5 490.00,68.45,19.62 μg/g。裸仁南瓜籽油中的角鯊烯含量顯著高于葡萄籽油和亞麻籽油。

        圖1 脂肪酸檢測(cè)的總離子流圖

        表1 脂肪酸組成及相對(duì)含量?

        ? “*”表示不飽和脂肪酸;“—”表示未檢測(cè)出。

        表2 植物甾醇組成及相對(duì)含量?

        ? “—”表示未檢測(cè)出。

        2.5 抗氧化活性評(píng)價(jià)

        2.5.1 DPPH自由基清除能力 圖4和表3表明,3種油對(duì)DPPH自由基的清除能力與其濃度呈正相關(guān),其中裸仁南瓜籽油對(duì)DPPH自由基具有良好的清除能力。裸仁南瓜籽油在濃度為20 mg/mL時(shí), 清除率達(dá)52.20%,高于葡萄籽油(37.98%)和亞麻籽油(43.51%)的。從IC50值來(lái)看,3種油對(duì)DPPH自由基清除能力大小順序?yàn)椋郝闳誓瞎献延?亞麻籽油>葡萄籽油。

        2.5.2 ABTS自由基清除能力 圖5和表4表明,3種油對(duì)ABTS自由基的清除能力與其濃度呈直線正相關(guān),其中裸仁南瓜籽油對(duì)ABTS自由基具有較優(yōu)的清除能力。在低濃度時(shí),裸仁南瓜籽油和亞麻籽油對(duì)ABTS自由基清除能力相當(dāng),均低于葡萄籽油;隨著濃度的增加,裸仁南瓜籽油對(duì)ABTS自由基清除能力增長(zhǎng)快于其他2種油,濃度為16 mg/mL 時(shí),裸仁南瓜籽油對(duì)ABTS自由基的清除能力與葡萄籽油相當(dāng),優(yōu)于亞麻籽油。從IC50值來(lái)看,3種油對(duì)ABTS自由基清除能力大小順序?yàn)椋浩咸炎延?裸仁南瓜籽油>亞麻籽油。

        圖2 植物甾醇檢測(cè)的總離子流圖

        3 結(jié)論

        通過(guò)對(duì)裸仁南瓜籽油的活性成分檢測(cè)分析,裸仁南瓜籽油的不飽和脂肪酸、β-谷甾醇、△-7植物甾醇和角鯊烯含量分別為74.68%,30.75%,10.76%,5 490 μg/g,其β-谷甾醇、△-7植物甾醇和角鯊烯含量顯著高于葡萄籽油和亞麻籽油,角鯊烯含量顯著高于文獻(xiàn)[19]報(bào)道的市售普通南瓜籽油的平均含量(1.14 μg/g)。天然植物甾醇具有良好的降膽固醇、抗炎、抗癌等功效[20-21],△-7植物甾醇可抑制由二氫睪酮過(guò)多引起的前列腺增生[22];角鯊烯為天然的抗癌、抗氧化劑,被廣泛應(yīng)用到食品、化妝品和醫(yī)藥行業(yè)[23]。因此可將裸仁南瓜籽油開(kāi)發(fā)為具有降膽固醇、抗癌、抗氧化的保健油脂或進(jìn)一步研究其功能成分,應(yīng)用到化妝品、藥品等行業(yè)。

        圖4 不同油脂對(duì)DPPH自由基的清除率

        圖5 不同油脂對(duì)ABTS自由基的清除率

        油樣線性回歸方程IC50/(mg·mL-1)R裸仁南瓜籽油y=27.830ln(x)-27.40916.140.973 4葡萄籽油 y=39.911ln(x)-79.45025.620.989 3亞麻籽油 y=34.832ln(x)-56.74021.420.979 5

        表4 不同油脂對(duì)ABTS自由基的清除效果

        對(duì)裸仁南瓜籽油進(jìn)行體外抗氧化活性評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn),裸仁南瓜籽油對(duì)DPPH、ABTS自由基具有良好的清除能力,抗氧化活性較強(qiáng),可能與其高含量的不飽和脂肪酸、植物甾醇,尤其是角鯊烯相關(guān),但具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。下一步將對(duì)裸仁南瓜籽油的活性部位進(jìn)一步分離純化,以明確其抗氧化作用的主要組分及裸仁南瓜籽油抗氧化機(jī)制。

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