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        水酶法提取南瓜籽油過(guò)程中乳狀液酶法聯(lián)合化學(xué)法破乳工藝研究

        2018-12-12 00:48:24張根生楊慧鐸岳曉霞劉志鑫許春明
        食品與機(jī)械 2018年10期
        關(guān)鍵詞:南瓜籽乳狀液酶法

        張根生 楊慧鐸 岳曉霞 劉志鑫許春明

        ZHANG Gen-sheng YANG Hui-duo YUE Xiao-xia LIU Zhi-xin XU Chun-ming

        (哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150076)

        (College of Food Engineering, Harbin University of Commerce, Harbin, Heilongjiang 150076, China)

        隨著科技的發(fā)展,很多非傳統(tǒng)的植物油提取工藝受到關(guān)注[1]。水酶法作為一種新型提油方法,被廣泛地應(yīng)用在大豆、花生、油菜籽、松籽和玉米胚芽等多種油料作物的油提取上[2-4]。在使用水酶法提取南瓜籽油時(shí),反應(yīng)溫度低,保持油的品質(zhì)同時(shí)又提高了蛋白質(zhì)利用率[5]。但是油提取率較低,只有小部分的油以游離油的形式存在,大部分的油是乳化狀態(tài),存在于離心后的乳狀膏或乳狀液中。為了提高游離油提取率,乳狀液破乳至關(guān)重要。乳狀液是由蛋白質(zhì)、磷脂和碳水化合物等組成的穩(wěn)定狀態(tài)[6]。兩親性水溶性蛋白吸附在O/W型乳狀液界面上,形成一層具有立體屏障的硬質(zhì)膜,阻止油的釋放。Bos等[7]研究表明磷脂具有很高的表面活性,對(duì)乳狀液穩(wěn)定性影響顯著。而碳水化合物通過(guò)增加黏度或使水相凝膠[8-9],來(lái)減少油體的聚集影響游離油的釋放,且效果隨其濃度的增加而增加[10]。

        水酶法提取植物油中乳狀液的破乳方法有:物理破乳方法[11-13]、化學(xué)破乳方法[14]、生物酶法破乳及多種方法聯(lián)合使用[15-16]。其中生物酶法破乳通過(guò)水解乳狀液中的蛋白質(zhì)或表面磷脂來(lái)釋放油脂,實(shí)現(xiàn)破乳。朱敏敏等[17]對(duì)水酶法提取番茄籽油過(guò)程中乳狀液破乳進(jìn)行了研究,使用風(fēng)味蛋白酶破乳,出油率提高至51.57%。Wu等[18]采用蛋白酶對(duì)水酶法提取的大豆油乳狀液進(jìn)行破乳,游離油得率為88%。Chabrand等[19]在大豆乳狀液中添加溶血磷脂酶A1破乳,游離油提取率為95%。目前,對(duì)于水酶法提大豆油乳狀液酶法破乳研究較多,而對(duì)南瓜籽油破乳研究較少。王麗波等[20]進(jìn)行水酶法提取南瓜籽油研究,南瓜籽出油率為38.34%,提取率為85%左右,雖然提取率較高,但是在最后提取南瓜籽油時(shí),直接在離心液中加入正已烷進(jìn)行萃取,使用有機(jī)試劑破乳,違背了水酶法提油綠色安全的初衷。本研究擬采用酶法對(duì)水酶法提南瓜籽油的乳狀液進(jìn)行破乳,同時(shí)對(duì)破乳后pH對(duì)乳狀液穩(wěn)定性的影響進(jìn)行分析,從而通過(guò)生物酶法聯(lián)合化學(xué)法提高破乳率,并且比較破乳前后油體平均粒徑大小分布,為提高水酶法提南瓜籽油的提取率提供參考。

        1 材料與方法

        1.1 材料與儀器

        1.1.1 材料與試劑

        南瓜籽:黑龍江賽美食品有限公司;

        地衣芽孢桿菌堿性蛋白酶(酶活力2.0×105U/g)、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶(酶活力6.0×104U/g)、木瓜蛋白酶(酶活力5.0×105U/g):北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;

        磷脂酶(1.0×105U/g):湖南世紀(jì)華星生物工程有限公司;

        硫酸銅、硫酸鉀、濃硫酸、無(wú)水乙醇、氨水、石油醚、氫氧化鈉、鹽酸:分析純,天津市富宇精細(xì)化工有限公司。

        1.1.2 主要儀器

        電熱鼓風(fēng)干燥箱:DHG-9420A型,上海一恒科學(xué)儀器有限公司;

        中草藥粉碎機(jī):FW135型,天津市泰斯特儀器有限公司;

        恒溫水浴鍋:DK-98-1型,天津市泰斯特儀器有限公司;

        集熱式恒溫磁力攪拌器:CL-200型,鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;

        酸度計(jì):PB-10型,賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;

        凱氏定氮儀:KDY-9820型,蘇州江東精密科學(xué)儀器有限公司;

        旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器:R205型,上海申勝生物技術(shù)有限公司;

        臺(tái)式高速離心機(jī):TG16-WS型,上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司;

        Zetasizer Nano粒度分析儀:ZEN3500型,英國(guó)馬爾文儀器有限公司。

        1.2 方法

        1.2.1 乳狀膏主要成分測(cè)定

        (1) 水分含量的測(cè)定:按GB 5009.3—2016的直接干燥法執(zhí)行。

        (2) 油脂含量的測(cè)定:按GB 5009.9—2016的堿水解法執(zhí)行。

        (3) 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定:按GB 5009.5—2016的凱氏定氮法執(zhí)行。

        (4) 總灰分含量的測(cè)定:按GB 5009.4—2016執(zhí)行。

        (5) 磷脂含量測(cè)定:按GB/T 5537—2008執(zhí)行。

        1.2.2 乳狀膏制備工藝流程

        南瓜籽仁→烘烤(105 ℃、1 h)→粉碎、過(guò)40目篩→浸泡1 h→磨漿→木瓜蛋白酶酶解(酶添加量4 500 U/g、酶解pH 7.5、酶解溫度50 ℃、酶解時(shí)間3 h)→滅酶(80 ℃、10 min)→離心分離(3 600×g、20 min)→乳狀液→靜置12 h→取上層乳狀膏

        1.2.3 酶法破乳工藝流程

        乳狀膏加去離子水→攪拌→酶解→滅酶(80 ℃、10 min)→離心分離(3 600×g離心20 min)→游離油

        1.2.4 酶的種類對(duì)破乳率的影響 取一定質(zhì)量的乳狀膏加入去離子水使液料比為1∶1 (mL/g),攪拌成均一的乳狀液后分別調(diào)節(jié)pH和溫度為各酶最適,依次添加2 000 U/g的地衣芽孢桿菌堿性蛋白酶、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶、黃曲霉酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶、磷脂酶進(jìn)行酶解,酶解時(shí)間為2 h,滅酶,冷卻至室溫后離心,抽取游離油稱量并計(jì)算破乳率。通過(guò)比較分析這5種酶對(duì)破乳率的影響。

        1.2.5 酶法破乳工藝單因素試驗(yàn)

        (1) 液料比對(duì)破乳率的影響:取一定質(zhì)量的乳狀膏,分別以0.5∶1.0,1.0∶1.0,1.5∶1.0,2.0∶1.0,2.5∶1.0 (mL/g)的液料比添加去離子水,攪拌成均一的乳狀液后調(diào)節(jié)pH為10.5,添加地衣芽孢桿菌堿性蛋白酶2 000 U/g,50 ℃ 酶解2.0 h,滅酶,冷卻至室溫后離心,抽取游離油稱量并計(jì)算破乳率。

        (2) 酶添加量對(duì)破乳率的影響:取一定質(zhì)量的乳狀膏加入去離子水使液料比為1∶1 (mL/g),攪拌成均一的乳狀液后調(diào)節(jié)pH為10.5,分別添加地衣芽孢桿菌堿性蛋白酶的量為1 000,2 000,3 000,4 000,5 000 U/g,50 ℃酶解2.0 h,滅酶,冷卻至室溫后離心,抽取游離油稱量并計(jì)算破乳率。

        (3) 酶解溫度對(duì)破乳率的影響:取一定質(zhì)量的乳狀膏加入去離子水使液料比為1∶1 (mL/g),攪拌成均一的乳狀液后調(diào)節(jié)pH為10.5,添加地衣芽孢桿菌堿性蛋白酶2 000 U/g,分別在40,45,50,55,60 ℃酶解2.0 h,滅酶,冷卻至室溫后離心,抽取游離油稱量并計(jì)算破乳率。

        (4) 酶解pH對(duì)破乳率的影響:取一定質(zhì)量的乳狀膏加入去離子水使液料比為1∶1 (mL/g),攪拌成均一的乳狀液后分別調(diào)節(jié)pH至9.5,10.0,10.5,11.0,11.5,添加地衣芽孢桿菌堿性蛋白酶2 000 U/g,50 ℃酶解2.0 h,滅酶,冷卻至室溫后離心,抽取游離油稱量并計(jì)算破乳率。

        (5) 酶解時(shí)間對(duì)破乳率的影響:取一定質(zhì)量的乳狀膏加入去離子水使液料比為1∶1 (mL/g),攪拌成均一的乳狀液后調(diào)節(jié)pH為10.5,添加地衣芽孢桿菌堿性蛋白酶2 000 U/g,50 ℃酶解時(shí)間分別為1.0,1.5,2.0,2.5,3.0 h,滅酶,冷卻至室溫后離心,抽取游離油稱量并計(jì)算破乳率。

        1.2.6 破乳率的測(cè)定

        (1)

        式中:

        R——乳狀液的破乳率,%;

        M1——破乳所得游離油質(zhì)量,g;

        M2——乳狀液中含油質(zhì)量,g。

        1.2.7 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 以酶法破乳單因素試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ),依據(jù)Box-Behnken的原理設(shè)計(jì)四因素三水平的優(yōu)化試驗(yàn),選液料比、酶添加量、酶解溫度、酶解pH 4個(gè)因素為自變量,每個(gè)因素做3個(gè)水平。以破乳率為響應(yīng)值,采用Design-Expert 8.0 作圖,通過(guò)響應(yīng)面分析法優(yōu)化酶法破乳工藝條件。

        1.2.8 南瓜籽油滴粒徑分布和Zeta電位測(cè)定 在離心分離前,分別取一定質(zhì)量未破乳和經(jīng)優(yōu)化的酶法破乳的乳狀液,加去離子水配置成0.1 g/L的溶液,分別取1 mL放入可拋棄型聚苯乙烯樣品池。設(shè)置折射率(RI)1.47,吸收值0.001,使用粒度分析測(cè)定油滴粒徑。在離心分離前,取等質(zhì)量經(jīng)酶法破乳的乳狀液,分別調(diào)節(jié)不同pH(3,4,4.5,5,6,7,8,9)后配置成0.1 g/L的溶液,取樣注入彎曲式毛細(xì)管樣品池中,進(jìn)行Zeta電位測(cè)定。

        2 結(jié)果分析

        2.1 乳狀膏主要成分

        乳狀膏主要成分測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知,乳狀膏中的水分、脂肪、蛋白質(zhì)含量較高。

        2.2 酶種類的選擇

        由圖1可知,在各酶最適條件和相同添加量的情況下進(jìn)行酶解反應(yīng),地衣芽孢桿菌堿性蛋白酶破乳率最高,破乳所得游離油最多,而磷脂酶破乳率低于大多數(shù)蛋白酶。因?yàn)槟竟系鞍酌该附馑频玫哪瞎献讶闋罡嘀械牡鞍踪|(zhì)被地衣芽孢桿菌堿性蛋白酶水解形成小分子肽或氨基酸,使得由蛋白質(zhì)形成的膜所包圍的油脂釋放出來(lái),得到游離油,實(shí)現(xiàn)破乳。雖然水解磷脂也是影響乳狀液穩(wěn)定性重要因素之一[19],但是由表1可知,南瓜籽乳狀膏中磷脂含量偏低而蛋白質(zhì)含量較高,所以對(duì)于南瓜籽乳狀膏來(lái)說(shuō),蛋白酶更適合破乳,最后選擇地衣芽孢桿菌堿性蛋白酶為反應(yīng)酶。

        不同字母表示差異顯著(P<0.05)

        2.3 酶法破乳工藝單因素試驗(yàn)

        2.3.1 液料比對(duì)破乳率的影響 由圖2可知,液料比對(duì)破乳率影響顯著,隨著水相的增加破乳率也明顯升高,當(dāng)液料比為1∶1 (mL/g)時(shí)破乳率達(dá)到最高值為83%;繼續(xù)增大水相,破乳率逐漸下降。這是由于在乳狀液中添加少量的水,可以降低乳狀液的黏度同時(shí)增加液體的流動(dòng)性[21],增大酶與底物的接觸面積,使得酶解更加充分。但是過(guò)量添加水相會(huì)導(dǎo)致底物質(zhì)量濃度變小,酶濃度變低就不能充分地與底物反應(yīng),破乳率會(huì)因此下降。

        不同字母表示差異顯著(P<0.05)

        2.3.2 酶添加量對(duì)破乳率的影響 由圖3可知,破乳率隨著酶添加量增加而逐漸變大,當(dāng)酶添加量為3 000 U/g時(shí),破乳率達(dá)到最高值(85.18%);繼續(xù)增加酶添加量時(shí),破乳率緩慢下降并趨于平穩(wěn)。說(shuō)明當(dāng)酶添加量逐漸增加至3 000 U/g 時(shí),乳狀液中酶濃度增大,可以滲透到脂質(zhì)體膜內(nèi),大部分的蛋白質(zhì)被水解,脂多糖被分解,由大量蛋白質(zhì)構(gòu)成的膜結(jié)構(gòu)被破壞,更多游離油被釋放出來(lái),破乳率變大;而再繼續(xù)添加更多酶只會(huì)影響游離油的釋放,因?yàn)槲捶磻?yīng)的地衣芽孢桿菌堿性蛋白酶附著在油體上或者其周圍,使得游離油不能被提取完全[22]。

        不同字母表示差異顯著(P<0.05)

        2.3.3 酶解溫度對(duì)破乳率的影響 由圖4可知,在地衣芽孢桿菌堿性蛋白酶的適宜反應(yīng)溫度范圍內(nèi)進(jìn)行單因素試驗(yàn),當(dāng)溫度在40~50 ℃時(shí),破乳率隨著溫度的升高而迅速增大直至最高點(diǎn),破乳率為最大值(85.08%);當(dāng)酶解溫度繼續(xù)升高時(shí),破乳率緩慢下降直至平穩(wěn)。因?yàn)楫?dāng)溫度逐漸升高至50 ℃,溫度接近酶的最適反應(yīng)溫度,可更好地作用于底物;而當(dāng)溫度升至60 ℃時(shí),小部分酶因?yàn)闇囟壬仙盍ο陆?,?dǎo)致破乳率小幅度下降。

        2.3.4 酶解pH對(duì)破乳率的影響 由圖5可見(jiàn),隨著酶解pH的增加,pH在9.5~10.5時(shí),破乳率也明顯增大。當(dāng)pH增加至10.5~11.5時(shí),破乳率下降。這可能是當(dāng)pH調(diào)節(jié)至11.5時(shí),乳狀液中負(fù)電荷增多,蛋白質(zhì)和油滴形成了極穩(wěn)定狀態(tài),對(duì)游離油的釋放造成阻礙。

        不同字母表示差異顯著(P<0.05)

        不同字母表示差異顯著(P<0.05)

        2.3.5 酶解時(shí)間對(duì)破乳率的影響 由圖6可知,隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng),破乳率緩慢上升了5.7%,當(dāng)酶解時(shí)間超過(guò)2.5 h時(shí),破乳率迅速下降了12.7%。這可能是隨著時(shí)間的延長(zhǎng),酶與底物發(fā)生反應(yīng),大量小油體聚集成大油滴,更多的游離油逐漸被釋放出來(lái),破乳率升高;而當(dāng)時(shí)間超過(guò)2.5 h,酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng),由于蛋白質(zhì)乳化特性,部分大油滴變成乳化油,無(wú)法以游離油的形式釋放出來(lái),導(dǎo)致破乳率大幅度下降[22]。

        2.4 響應(yīng)面優(yōu)化酶法破乳工藝條件

        2.4.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 根據(jù)酶法破乳的單因素試驗(yàn)結(jié)果,設(shè)計(jì)四因素三水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。以破乳率為響應(yīng)值,進(jìn)行響應(yīng)面分析,其試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)分別表2、3。

        不同字母表示差異顯著(P<0.05)

        2.4.2 響應(yīng)面結(jié)果分析 通過(guò)Design-Expert 8.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)破乳率的數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行分析,建立破乳率對(duì)反應(yīng)溫度、液料比、酶添加量、pH的二次回歸模型如下:

        R=88.42+0.13A-0.55B+0.23C-0.39D-0.37AB+0.34AC-0.46AD-0.64BC+1.48BD+0.12CD-0.88A2-3.03B2-2.28C2-2.59D2。

        (2)

        表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表

        表3 響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果

        利用Design-Expert 8.0對(duì)二次回歸方程模型進(jìn)行分析,破乳率的方差分析結(jié)果及其顯著性結(jié)果見(jiàn)表4。

        由表4可知,模型的P<0.000 1,說(shuō)明二次響應(yīng)面回歸模型極顯著;失擬項(xiàng)P=0.265 4>0.05,這表示失擬項(xiàng)差異不顯著;決定系數(shù)R2=94.14%,說(shuō)明模型能夠解釋94.14%的響應(yīng)值變化。根據(jù)以上各值可以判斷出,該模型與試驗(yàn)擬合度較高,試驗(yàn)誤差小,可信度較高,可以很好地描述試驗(yàn)結(jié)果,可實(shí)現(xiàn)酶法破乳工藝條件的優(yōu)化。由各因素的F值可以得到4個(gè)因素對(duì)破乳率影響大小順序?yàn)椋築(液料比)>D(pH)>C(酶添加量)>A(酶解溫度)。

        2.4.3 交互作用分析 由表4及圖7可知,BD的P<0.000 1,B和D交互作用對(duì)破乳率影響極顯著,破乳率隨著B(niǎo)與D水平的增加而升高;BC的P<0.05,說(shuō)明B和C交互作用對(duì)破乳率影響顯著,破乳率隨著液料比和酶添加量交互作用的增加先增加后下降;隨著A和D交互水平增加,破乳率變化比較平緩,與前2個(gè)交互作用相比較,此交互作用對(duì)破乳率影響不顯著。

        2.4.4 酶法破乳最佳工藝條件驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化出最佳酶法破乳工藝為:液料比0.9∶1.0 (mL/g)、酶添加量3 078 U/g、酶解pH 10.4、溫度51 ℃。由響應(yīng)面法得出此條件下酶法破乳的破乳率理論值為88.50%。為了驗(yàn)證該試驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可靠性,將最佳工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),每組重復(fù)3次取平均值。最后測(cè)得破乳率為88.39%,與響應(yīng)面預(yù)測(cè)所得的理論值相比,相對(duì)誤差為0.12%,此結(jié)果表明經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化后的條件可以更好地預(yù)測(cè)酶法破乳工藝。

        2.5 破乳前后油滴粒徑分布及pH對(duì)乳狀液穩(wěn)定性的影響

        2.5.1 破乳前后的油滴粒徑分布 由圖8可知,酶法破乳前油滴的平均粒徑為2.950 μm,破乳后平均粒徑增加至48.000 μm,粒徑明顯增大。這是因?yàn)槠迫榍坝腕w被蛋白質(zhì)所形成的膜包裹著,以較小的油滴形式不均勻地分布在乳狀液中,經(jīng)過(guò)酶法破乳后,蛋白質(zhì)膜被水解破壞,油體被釋放出來(lái)聚集成更大的油滴。比較破乳前后油滴平均粒徑大小,更加直觀地表達(dá)了破乳的重要性。

        方差來(lái)源平方和自由度均方F值P值顯著性模型119.1414.008.5133.13<0.000 1**A0.191.000.190.740.404 2B3.641.003.6414.170.002 1**C0.651.000.652.530.134 3D1.851.001.857.200.017 8*AB0.531.000.532.070.171 8AC0.461.000.461.800.201 0AD0.861.000.863.330.089 4BC1.661.001.666.480.023 3*BD8.731.008.7333.99<0.000 1**CD0.061.000.060.230.636 3A24.991.004.9919.440.000 6**B259.651.0059.65232.23<0.000 1**C233.651.0033.65130.99<0.000 1**D243.511.0043.51169.40<0.000 1**殘差3.6014.000.26失擬項(xiàng)2.9910.000.301.990.265 4凈誤差0.604.000.15總和122.7328.00

        圖8 粒徑分布

        2.5.2 不同pH下乳狀液的Zeta電位 由圖9可知,Zeta電位值隨著pH增加而降低。當(dāng)pH在 4.25~4.50時(shí),pH接近南瓜籽蛋白的等電點(diǎn),Zeta電位值接近于0,此時(shí)蛋白質(zhì)溶解性最差乳化力最小,吸附在油滴和水之間的蛋白最少,由于不存在靜電排斥作用,油滴易聚集在一起,乳狀液處于極不穩(wěn)定的狀態(tài)[23];當(dāng)pH在8~9時(shí),Zeta電位值<-37.3 mV,乳狀液負(fù)電荷增多,蛋白質(zhì)帶相同電荷相斥,由蛋白質(zhì)膜所包裹的油滴不易上浮聚集在一起,乳狀液處于穩(wěn)定狀態(tài)[24]。這也證明為了酶法破乳后酸化處理的意義,酶法處理后乳狀液pH值在8~9時(shí),乳狀液處于穩(wěn)定狀態(tài),為了再次提高破乳率,調(diào)節(jié)pH為4.25~4.50時(shí)接近南瓜籽蛋白等電點(diǎn),使乳狀液處于極不穩(wěn)定狀態(tài),游離油釋放的更充分。為方便工業(yè)化生產(chǎn),調(diào)節(jié)pH至4.5,使破乳率提高至95.47%。

        圖9 pH對(duì)乳狀液Zeta電位的影響

        3 結(jié)論

        本試驗(yàn)選用地衣芽孢桿菌堿性蛋白酶,酶解由水酶法提取南瓜籽油過(guò)程中產(chǎn)生的乳狀液,實(shí)現(xiàn)破乳提高南瓜籽油的提取率。通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)曲面優(yōu)化試驗(yàn),得出酶法破乳的最佳工藝為液料比0.9∶1.0 (mL/g)、添加地衣芽孢桿菌堿性蛋白酶3 078 U/g、調(diào)節(jié)pH 10.4、酶解溫度51 ℃、酶解時(shí)間2.5 h,驗(yàn)證所得破乳率為88.39%。同時(shí)還研究了pH對(duì)乳狀液穩(wěn)定性的影響,發(fā)現(xiàn)在酶法破乳后進(jìn)行酸化處理,通過(guò)調(diào)節(jié)pH至4.5,破乳率可達(dá)到95.47%。通過(guò)比較破乳前后油體粒徑分布的變化趨勢(shì),更加確定了本試驗(yàn)所研究的破乳方法的優(yōu)勢(shì),為水酶法提取南瓜籽油的破乳工藝條件提供了可靠的理論依據(jù)。但本試驗(yàn)只適用于水酶法提取南瓜籽油的破乳研究,有局限性,還需更深入地研究各種油料作物水酶法提取的破乳工藝。

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