張慧君陳又銘宮春宇姜寧寧沙迪昕王文霞

ZHANG Hui-jun1,2 CHEN You-ming1,2 GONG Chun-yu1,2 JIANG Ning-ning1,2 SHA Di-xin1,2 WANG Wen-xia1,2

(1. 齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2. 黑龍江省普通高校農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

(1. College of Food Bioengineering, Qiqihar, Heilongjiang 161006, China; 2. Key Laboratory of Processing Agricultural Products of Heilongjiang Province, Qiqihar University, Qiqihar, Heilongjiang 161006, China)

玉米是世界三大糧食作物之一，因產(chǎn)量、可利用價(jià)值高且可再生而受到廣泛的關(guān)注。濕磨法是加工淀粉及其以淀粉為原料深加工產(chǎn)物的主要方法，該方法突出的特點(diǎn)是將玉米的各個(gè)組成部分有效地分離，如玉米濕法加工的副產(chǎn)品中，大約可以分離出占原料質(zhì)量5%～6%的玉米黃粉(Corn Gluten Meal，CGM)，其中蛋白質(zhì)含量約60%，主要成分為玉米醇溶蛋白(zein)等[1]。

由于玉米醇溶蛋白富含大量疏水性氨基酸，存在溶解性差，口感粗糙及含有色澤和不良?xì)馕兜葐栴}，長期以來許多工廠將玉米黃粉主要用作低價(jià)值動物蛋白飼料，極少在食品工業(yè)中應(yīng)用。但另一方面因?yàn)橛衩状既艿鞍椎奶厥獍被峤Y(jié)構(gòu)，使它能在無需添加劑、鞣制劑的條件下制成具有良好阻濕性及阻氧性、透明度高的薄膜。目前，國內(nèi)外對玉米醇溶蛋白的研究主要集中在果蔬、食品保藏等方面的應(yīng)用，如玉米醇溶蛋白膜配方及成膜條件的篩選等[2]。但是這種純玉米醇溶蛋白制備的膜，其抗拉強(qiáng)度、延展性等機(jī)械性能指標(biāo)不理想，如剛性強(qiáng)、易斷裂、柔軟性差，因此它的使用受到限制，作為膠囊壁材的資料更少。

蛋白質(zhì)改性即利用各種外界因素改變氨基酸殘基和多肽鏈，使蛋白質(zhì)分子空間結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)發(fā)生改變，從而獲得符合要求的蛋白特性[3-5]。糖基化改性是近年來常用的、安全的蛋白質(zhì)改性方法，包括干熱法和濕熱法。由于濕熱法適合制備單糖、雙糖或低聚糖-蛋白質(zhì)共價(jià)復(fù)合物，但是單糖的性質(zhì)不如干熱法中使用的多糖那么突出。干熱法利用蛋白質(zhì)和多糖發(fā)生糖基化反應(yīng)[6]，可在適當(dāng)?shù)南鄬穸群头磻?yīng)溫度范圍內(nèi)使蛋白質(zhì)中的氨基處于聚集松散狀態(tài)，且多糖僅有一個(gè)還原末端，有利于與羰基發(fā)生接枝交聯(lián)，反應(yīng)產(chǎn)物的機(jī)械性能和功能性都比較好。如原秀玲等[7]的研究表明海藻酸鈉干法糖基化改性乳清蛋白成膜性和膜的機(jī)械性有很大改善，林偉靜[8]用糖基化改性花生蛋白后制備膜的機(jī)械性能也有明顯提高。

菊粉(多聚果糖，inulin)作為功能性多糖，具有促進(jìn)礦物質(zhì)吸收、維生素合成和預(yù)防癌癥等作用[9]。目前尚未見采用菊粉對純玉米醇溶蛋白進(jìn)行改性的相關(guān)研究報(bào)道，本研究擬利用菊粉在玉米醇溶蛋白上導(dǎo)入羰基，在膜的周圍形成立體網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，提高膜的抗拉強(qiáng)度，以期為制備植物蛋白膠囊壁材料提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米醇溶蛋白：70%乙醇提取，蛋白含量90%，自制；

菊粉：DP>10，純度>95%，佐源生物工程科技有限公司；

α-淀粉酶：7×104U/mL，寧夏夏盛實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司；

鄰苯二甲醛：化學(xué)純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；

十二烷基硫酸鈉：電泳級，天津市耀華化學(xué)試劑公司；

β-巰基乙醇：分析純，天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)公司；

硼砂：分析純，天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

質(zhì)構(gòu)儀：QTS-25型，美國博樂飛公司；

差示掃描量熱儀：Q-20DSC型，美國TA儀器公司；

掃描電子顯微鏡：s-3400型，日本日立有限公司；

超聲波信號發(fā)生器：WSL-1000D型，南京順流儀器有限公司；

真空冷凍干燥機(jī)：LYOQUEST-85型，西班牙泰士達(dá)公司；

傅里葉變紅外光譜分析儀；FI-IR/NIR型，美國PerkinElmer公司；

數(shù)顯膜測厚儀：GBCY01型，浙江盛泰芯電子科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 干法糖基化反應(yīng) 稱取玉米醇溶蛋白，用70%乙醇溶液溶解，配制成8%的玉米醇溶蛋白乙醇溶液，按比例加入一定質(zhì)量的菊粉，混勻，調(diào)節(jié)體系pH，超聲(500 W，10 min)，凍干，打磨成粉，倒入平皿，置于相對濕度為79%的溴化鉀溶液、在溫度60 ℃的干燥器內(nèi)反應(yīng)一定時(shí)間，得到玉米醇溶蛋白-菊粉的糖基化改性產(chǎn)物。

1.3.2 膜和膠囊殼的制備 稱取糖基化改性產(chǎn)物，用70%乙醇溶解配成8%的樣品溶液，在65 ℃下磁力攪拌30 min進(jìn)行溶膠。將溶膠倒入不銹鋼模具于70 ℃烘箱烘干成膜；將溶膠預(yù)熱至70 ℃、在涂有植物油的1#膠囊殼模具上進(jìn)行蘸膠，烘干后，取出膠囊殼。將烘干后的膜或膠囊殼于溫度30 ℃、相對濕度43%干燥器內(nèi)平衡48 h，進(jìn)行測定。

1.3.3 測定項(xiàng)目與方法

(1) 蛋白膜TS測定：將制備的改性膜剪成4 cm×1 cm的長方形狀，置于質(zhì)構(gòu)儀拉伸探頭上，固定好，夾距設(shè)定為20 cm，拉伸速度為5 mm/s。抗拉強(qiáng)度按式(1)計(jì)算：

(1)

式中：

TS——抗拉強(qiáng)度，MPa；

F——最大拉力，N；

L——膜樣品的厚度，mm(在膜的邊緣及中心等位置均勻取10個(gè)點(diǎn)，利用測厚儀測定其厚度，取平均值)；

W——膜樣品的寬度，mm。

(2) 玉米醇溶蛋白改性后的SDS-PAGE凝膠電泳測定：采用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)法檢測，考馬斯亮藍(lán)R-250染料，形成藍(lán)色條帶。糖基化改性后得到的糖蛋白產(chǎn)物的定性檢測使用高碘酸-Schiff試劑法，得到粉紅色或淺紅色條帶。

準(zhǔn)確稱取玉米醇溶蛋白和玉米醇溶蛋白-菊粉糖基化改性產(chǎn)物的凍干樣品(最佳工藝條件下)，用70%乙醇溶液溶解，配制成1 mg/mL的樣品蛋白溶液，于10 000 r/min離心10 min，取上清液，用分離膠濃度12%，濃縮膠4%，進(jìn)樣10 μL。恒壓控制，濃縮膠80 V，分離膠100 V。至樣品帶遷移到距離膠板底部1 cm左右停止電泳。同時(shí)，以低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白作為蛋白的標(biāo)準(zhǔn)樣品，辣根過氧化物酶作為糖基化產(chǎn)物的標(biāo)準(zhǔn)樣品。

(3) 蛋白膜紅外光譜掃描：采用傅里葉變紅外光譜分析儀測試，掃描范圍為500～4 000 cm-1，掃描范圍次數(shù)32次，分辨4 cm-1。

(4) 熱力學(xué)性質(zhì)測定：利用差示掃描量熱儀(DSC)在20～250 ℃內(nèi)掃描，升溫速度為10 ℃/min，測定玉米醇溶蛋白膜和玉米醇溶蛋白-菊粉糖基化改性膜的熱性質(zhì)。

(5) 蛋白膜微觀結(jié)構(gòu)測定：將玉米醇溶蛋白膜和共價(jià)交聯(lián)產(chǎn)物膜，剪成0.5 mm2的試驗(yàn)片，進(jìn)行真空鍍金處理，加速電壓15 kV。將樣品放入掃描電子顯微鏡(SEM)中觀察拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同種類膜抗拉強(qiáng)度比較

分別測定改性后的玉米醇溶蛋白-菊粉膜、玉米醇溶蛋白膜、明膠膜的抗拉強(qiáng)度，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，制備膠囊殼的明膠膜抗拉強(qiáng)度為8.23 MPa、玉米醇溶蛋白膜為4.67 MPa、玉米醇溶蛋白-菊粉膜為11.5 MPa，說明改性后的蛋白膜抗拉強(qiáng)度得到提高。

2.2 SDS-PAGE凝膠電泳分析

圖2為玉米醇溶蛋白和、玉米醇溶蛋白與菊粉進(jìn)行糖基化反應(yīng)后的考馬斯亮藍(lán)染色圖和糖蛋白紅色染色圖，0和0′泳道的標(biāo)樣分別為14 400～97 400 Da的低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白和辣根過氧化物酶。

圖1 不同膜的抗拉強(qiáng)度

0. 標(biāo)準(zhǔn)蛋白 1. 玉米醇溶蛋白 2. 玉米醇溶蛋白-麥芽糖漿接枝物 3. 玉米醇溶蛋白-麥芽糊精接枝物 4. 玉米醇溶蛋白-菊粉接枝物 0′. 辣根過氧化物酶 1′. 玉米醇溶蛋白 2′. 玉米醇溶蛋白-麥芽糖漿接枝物 3′. 玉米醇溶蛋白-麥芽糊精接枝物 4′. 玉米醇溶蛋白-菊粉接枝物

圖2 SDS-PAGE考馬斯亮藍(lán)和糖蛋白染色圖

Figure 2 The electrophoretic profile of the samples stained for zein and zein-inulin

根據(jù)文獻(xiàn)[10]，按照溶解性和分子量，玉米醇溶蛋白可分為α-玉米醇溶蛋白、β-玉米醇溶蛋白、γ-玉米醇溶蛋白和δ-玉米醇溶蛋白四類。其中α-玉米醇溶蛋白主要是疏水性氨基酸，約占總玉米醇溶蛋白含量的75%～80%，β-玉米醇溶蛋白和γ-玉米醇溶蛋白含量約各占總玉米醇溶蛋白的10%，剩下是含量很少的δ-玉米醇溶蛋白。α-玉米醇溶蛋白分子量為23～24 kDa和26～27 kDa；β-玉米醇溶蛋白分子量約為17 kDa，γ-玉米醇溶蛋白分子量為27 kDa和18 kDa；δ-玉米醇溶蛋白分子量約為10 kDa。

由圖2可知，考馬斯亮藍(lán)染色的電泳中，1泳道的條帶中為玉米醇溶蛋白組分，其中分子量分布與文獻(xiàn)[10]一致，主要集中在α玉米醇溶蛋白的24～26 kDa以及少量的β-玉米醇溶蛋白(17 kDa)和雜蛋白(38 kDa以上)。4泳道為改性后的玉米醇溶蛋白-菊粉，由于菊粉的分子量(341～10 000 Da)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于玉米醇溶蛋白，因此接枝反應(yīng)后，第1和第4泳道的條帶位置改變不大，糖蛋白在考馬斯亮藍(lán)中無明顯的改變，無法鑒定是否進(jìn)行了糖基化反應(yīng)。因此，采用高碘酸希爾法，利用高碘酸的氧化作用與多糖分子進(jìn)行顏色反應(yīng)，以辣根過氧化物酶為陽性對照，以檢測接枝產(chǎn)物中是否有糖分子的存在。圖2中，1′泳道的玉米醇溶蛋白呈現(xiàn)淺淺的紅色，說明玉米醇溶蛋白本身含有少量的糖，與李海明[11]的研究結(jié)果一致。4′泳道為菊粉改性產(chǎn)物，顯示紅色條帶，證明糖基化反應(yīng)生成的交聯(lián)產(chǎn)物玉米醇溶蛋白-菊粉中有糖基的存在，從而確認(rèn)玉米醇溶蛋白中導(dǎo)入了菊粉分子。

2.3 蛋白膜FT-IR分析

采用玉米醇溶蛋白與菊粉進(jìn)行干法糖基化，與玉米醇溶蛋白膜作對比，進(jìn)行傅里葉紅外光譜分析，結(jié)果見圖3。

圖3 玉米醇溶蛋白膜和玉米醇溶蛋白—菊粉膜的FT-IR光譜圖

由圖3可知，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)與多糖分子以共價(jià)鍵接枝后，蛋白質(zhì)分子中羥基的含量就會增加，在紅外光譜的譜圖中會發(fā)現(xiàn)羥基的特征吸收峰先后增強(qiáng)。羥基的特征吸收峰有2個(gè)，分別是—OH伸縮振動吸收峰(3 700～3 200 cm-1)和C—O伸縮振動吸收峰(1 100～1 000 cm-1)。蛋白質(zhì)的特征吸收峰包括酰胺Ⅰ帶—NH彎曲振動(1 690～1 630 cm-1)、酰胺Ⅱ帶—NH彎曲振動(1 530～1 560 cm-1)和酰胺Ⅲ帶C—N彎曲振動和N—H彎曲振動(1 240～1 450 cm-1)。

從圖3還可以看出，相比未改性的玉米醇溶蛋白膜，干熱法改性玉米醇溶蛋白-菊粉膜在3 290.46 cm-1處的峰移至3 288.68 cm-1處、酰胺Ⅰ帶的叔酰胺1 645.99 cm-1處的峰移至1 643.28 cm-1處，酰胺Ⅱ帶的仲酰胺1 536.82 cm-1處的峰移至1 517.18 cm-1處，酰胺Ⅲ帶的1 242.85 cm-1處的峰移至1 239.03 cm-1處，振動吸收峰變小發(fā)生藍(lán)移，其中1 643.28 cm-1處峰的藍(lán)移來自于糖基化反應(yīng)后玉米醇溶蛋白的α-螺旋結(jié)構(gòu)減少，減少的α-螺旋結(jié)構(gòu)部分轉(zhuǎn)化成β-折疊。對此結(jié)果進(jìn)行分析，推測為：相比純的玉米醇溶蛋白，干法糖基化改性后的玉米醇溶蛋白-菊粉引入了新的多聚果糖鏈導(dǎo)致接枝后產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)中β-折疊含量增加，強(qiáng)化了蛋白質(zhì)分子間及分子內(nèi)的相互作用，使改性后產(chǎn)物的穩(wěn)定性增加[12]；另外，改性的膜在1 025.15 cm-1處生成了新的峰，它是C—O伸縮振動吸收峰，即羥基含量增加。這兩點(diǎn)說明原來玉米醇溶蛋白經(jīng)干法糖基化后二級結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，與菊粉產(chǎn)生了共價(jià)交聯(lián)。FT-IR測定結(jié)果可較好詮釋改性膜機(jī)械性能提高的機(jī)理。

2.4 熱性質(zhì)分析

蛋白質(zhì)是一種非結(jié)晶態(tài)的三維結(jié)構(gòu)，其非共價(jià)鍵的相互作用決定了結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，使蛋白質(zhì)具有玻璃態(tài)轉(zhuǎn)化行為。玻璃態(tài)轉(zhuǎn)化溫度取決于蛋白質(zhì)分子的空間效應(yīng)和分子間、分子內(nèi)的相互作用。玉米醇溶蛋白與干法糖基化的DSC掃描結(jié)果見圖4。

圖4 玉米醇溶蛋白和玉米醇溶蛋白-菊粉的DSC圖

由圖4可知，玉米醇溶蛋白膜的熱變性溫度約188.47 ℃，菊粉對玉米醇溶蛋白糖基化改性以后，改性交聯(lián)產(chǎn)物的熱變性溫度升高到194.02 ℃。當(dāng)玉米醇溶蛋白與菊粉發(fā)生了糖基化反應(yīng)時(shí)，玉米醇溶蛋白蛋白的空間結(jié)構(gòu)和鍵位都會發(fā)生一定的變化,從而導(dǎo)致熱吸收數(shù)據(jù)發(fā)生變化。熱變性溫度的提高說明蛋白質(zhì)的內(nèi)部結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，即通過糖基化的方法對玉米醇溶蛋白改性可提高玉米醇溶蛋白的熱穩(wěn)定性，與紅外結(jié)果一致。

2.5 蛋白膜SEM分析

圖5表明了玉米醇溶蛋白膜和玉米醇溶蛋白-菊粉膜的表面微觀結(jié)構(gòu)在放大1 000，2 000，5 000，10 000倍后的差異。

a～d. 玉米醇溶蛋白膜放大1 000，2 000，5 000，10 000倍a′～d′. 玉米醇溶蛋白-菊粉膜放大1 000，2 000，5 000，10 000倍

品質(zhì)性能優(yōu)良的膜表面結(jié)構(gòu)沒有太多的孔洞、凹陷、突斑和裂紋。如圖5所示，以純玉米醇溶蛋白膜作為對照，利用SEM對玉米醇溶蛋白膜和玉米醇溶蛋白-菊粉膜表面放大1 000倍進(jìn)行觀察，純玉米醇溶蛋白制備的膜表面存在微小的孔洞結(jié)構(gòu)；糖基化改性后玉米醇溶蛋白-菊粉制備的膜，比較平整、表面微孔結(jié)構(gòu)消失。將玉米醇溶蛋白膜和玉米醇溶蛋白-菊粉膜同時(shí)放大2 000，5 000倍時(shí)，結(jié)果相同。當(dāng)將玉米醇溶蛋白膜和玉米醇溶蛋白-菊粉膜放大10 000倍時(shí)，可以清楚地看到玉米醇溶蛋白膜表面無規(guī)則分布著直徑大小不一的小孔，玉米醇溶蛋白-菊粉膜表面較光滑、平整、沒有孔隙。說明空洞等缺陷是導(dǎo)致膜機(jī)械性能差的主要原因，即對膜的抗拉強(qiáng)度造成一定的影響，與圖1的結(jié)果一致。進(jìn)一步證明玉米醇溶蛋白經(jīng)過菊粉干法糖基化改性，菊粉分子和玉米醇溶蛋白分子發(fā)生共價(jià)接合，使孔洞結(jié)構(gòu)消失。

2.6 膠囊殼的制備

將玉米醇溶蛋白和玉米醇溶蛋白-菊粉制備成膠液、經(jīng)過模具蘸膠、烘干得到1#膠囊殼，按照《中華人民共和國藥典(2015版)》檢測其外觀、膠囊體膠囊帽的松緊度、干燥失重、灼燒殘?jiān)痛嗨槎鹊戎笜?biāo)，結(jié)果見圖6和表1。

圖6 膠囊殼的制備

由表1可知，玉米醇溶蛋白膠囊殼由于脆性較大，在脫模過程中膠囊殼出現(xiàn)有裂痕，甚至易碎、導(dǎo)致殼體不完整，外觀不合格。而玉米醇溶蛋白-菊粉制備的膠囊殼，各項(xiàng)指標(biāo)均符合《中華人民共和國藥典2015版》的相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)，殼體沒有裂縫，套合后的膠囊體無漏粉現(xiàn)象，表面光滑，質(zhì)地均勻。膠囊的松緊度、灼燒殘?jiān)⒋嗨槎群透稍锸е鼐细瘛?/p>

3 結(jié)論

本研究采用干熱糖基化對玉米醇溶蛋白進(jìn)行改性，制備了玉米醇溶蛋白-多聚果糖共價(jià)接枝產(chǎn)物，研究了糖基化改性對玉米醇溶蛋白結(jié)構(gòu)和機(jī)械性能的影響。初步探討了改性反應(yīng)的機(jī)理。通過SDS-PAGE凝膠電泳、DSC、紅外光譜和掃描電鏡分析得出，玉米醇溶蛋白以共價(jià)鍵的形式有效地接入多聚果糖分子，使改性蛋白質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，膜的孔洞結(jié)構(gòu)消失，提高了抗拉強(qiáng)度。說明利用菊粉對玉米醇溶蛋白糖基化改性是提高膠囊殼機(jī)械強(qiáng)度，替代明膠膠囊的有效方法。

本研究從膜的機(jī)械性能、紅外結(jié)構(gòu)、熱力學(xué)和微觀掃描等方面綜合分析，干法糖基化制得膠囊殼的各項(xiàng)指標(biāo)滿足了《中華人民共和國藥典》的要求。因此后期擬在干法糖基化的原料方面作進(jìn)一步的篩選，盡可能選擇成本更低，更常見的食品添加劑類多糖作為糖基化原料。此外，玉米醇溶蛋白具有天然腸溶性，探索改性后的膠囊殼對腸溶效果的變化是今后研究發(fā)展的方向。

表1 檢測指標(biāo)