盧永翎 肖留榜 夏秋琴 呂麗爽

LU Yong-ling XIAO Liu-bang XIA Qiu-qin LU Li-shuang

(南京師范大學(xué)金陵女子學(xué)院，江蘇 南京 210097)

(Ginling College, Nanjing Normal University, Nanjing, Jiangsu 210097, China)

1,2-二羰基化合物，如丙酮醛(methylglyoxal，MGO)和乙二醛(glyoxal，GO)，是糖基化反應(yīng)過(guò)程中非酶褐變和蛋白質(zhì)交聯(lián)產(chǎn)生的活性中間產(chǎn)物。MGO和GO是食品加熱(如蒸煮、油炸和焙烤等)和貯藏過(guò)程中形成的產(chǎn)物，MGO和GO不僅是顏色和芳香物質(zhì)的重要前體物質(zhì)，而且還會(huì)導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)改變從而令食品營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的下降。研究表明，1,2-二羰基化合物可促使蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，抑制絨毛、腺體及上皮細(xì)胞中的蛋白質(zhì)、DNA和RNA的合成，還可以引發(fā)人的糖尿病、阿茨海默癥等癥狀[1-4]，因此，已經(jīng)成為當(dāng)前食品安全研究的熱點(diǎn)[5-7]。由此，尋求抑制1,2-二羰基化合物、控制蛋白糖基化反應(yīng)成為亟需解決的問(wèn)題。

國(guó)內(nèi)外已有相關(guān)文獻(xiàn)，如章宇[8]87-112在研究食品中丙烯酰胺的形成過(guò)程時(shí)，運(yùn)用天冬酰胺—葡萄糖模型來(lái)模擬食品中丙烯酰胺的形成過(guò)程，為模擬食品加工條件提供了參考依據(jù)；Sara等[9]研究甘氨酸—葡萄糖模型在pH 6.8的條件下產(chǎn)生中間產(chǎn)物MGO、1-deoxy-2,3-hexodiulose和3-deoxy-2-hexosulose以及有機(jī)酸形成的動(dòng)力學(xué)路徑；Paul等[10]在pH 7.4、37 ℃的生理?xiàng)l件下研究胍基與活性羰基化合物MGO、GO和3-DG反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)及其機(jī)制；付全意[11]通過(guò)阿倫尼烏斯方程研究Lys-葡萄糖模擬體系中羧甲基賴氨酸的形成動(dòng)力學(xué)，并計(jì)算了該動(dòng)力學(xué)下的各種參數(shù)和反應(yīng)活化能。這些反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的研究報(bào)道均為研究精氨酸(Arg)—葡萄糖模型產(chǎn)生MGO和GO的動(dòng)力學(xué)提供了理論依據(jù)。

目前尚未有文獻(xiàn)報(bào)道在高溫條件下Arg-葡萄糖體系中MGO、GO產(chǎn)生及消除的變化過(guò)程，因此本研究將模擬食品高溫加工條件，建立Arg-還原糖模型，通過(guò)對(duì)比還原糖種類、溫度、時(shí)間、pH和抑制劑染料木黃酮等因素對(duì)體系中MGO和GO產(chǎn)生量的影響，確定主要影響因素；進(jìn)而在不同的反應(yīng)溫度條件下添加染料木黃酮考察MGO和GO形成的動(dòng)力學(xué)規(guī)律，探討其對(duì)該體系中MGO和GO的抑制過(guò)程；計(jì)算相應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)，分析在染料木黃酮介入前后的變化及其消除1,2-二羰基化合物的機(jī)制。本研究旨在為研究食品高溫加工過(guò)程中發(fā)生的美拉德反應(yīng)、體系中MGO和GO的形成過(guò)程，以及天然黃酮抑制MGO和GO的機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

精氨酸：分析純，上海生物生工有限公司；

染料木黃酮：98%、HPLC級(jí)，南京廣潤(rùn)生物試劑有限公司；

丙酮醛(40%水溶液)、乙二醛(40%水溶液)、鄰苯二胺(DB)：分析純，美國(guó)Sigma-Aldrich公司；

磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、2,3-丁二酮、葡萄糖：分析純，上海國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司；

甲醇：色譜純，上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

吡啶(99.5%)、六甲基硅烷(98%)、三甲基氯硅烷(99%)：分析純，成都市科龍化工試劑廠；

乙酸乙酯：分析純，南京化學(xué)試劑有限公司；

純凈水：杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀：Agilent Technologies 1290/6460 Triple Quad LC/MS、DAD G4212A型，美國(guó)安捷倫公司；

氣相色譜系統(tǒng)：7820型，美國(guó)安捷倫公司；

高效液相色譜系統(tǒng)：20 AT型，美國(guó)安捷倫公司；

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH-6型，金壇市富華儀器有限公司；

數(shù)顯恒溫油浴鍋：HH-S型，金壇市富華儀器有限公司；

電子分析天平：FA2104N型，上海精密科學(xué)儀器有限公司；

數(shù)字式pH計(jì)：PHS-3C型，上海三信儀表廠；

超聲波清洗器：KQ-300B型，昆山市超聲儀器有限公司；

氮?dú)獯蹈蓛x：HGC-12A型，上海喬躍電子科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 MGO和GO含量分析 采用氣相色譜法[12]，以DB為衍生化試劑，程序升溫條件：初始柱溫40 ℃ 保持1 min，升溫第一階段4 ℃/min升至140 ℃保持1 min，第二階段50 ℃/min 升至250 ℃保持1 min；載氣流量：H2流量30 mL/min，空氣流量300 mL/min，N2流量25 mL/min。

1.3.2 MGO和GO形成的單因素設(shè)計(jì) MGO和GO的制備參考文獻(xiàn)[13]，其中還原糖及精氨酸的終濃度均為60 mmol/L。

(1) 還原糖種類：在pH 7.4，反應(yīng)溫度121 ℃，未添加抑制劑的條件下，分別在0，5，15，30，60 min考察不同種類還原糖(葡萄糖、果糖、核糖、半乳糖)對(duì)MGO和GO形成的影響。

(2) pH：在還原糖為葡萄糖，反應(yīng)溫度121 ℃，未添加抑制劑的條件下，分別在0，5，15，30，60 min考察不同pH(6.5，7.4，9.2)對(duì)MGO和GO形成的影響。

(3) 溫度：在還原糖為葡萄糖，pH 7.4，未添加抑制劑的條件下，分別在0，5，15，30，60 min考察不同溫度(100，121，135，150，180 ℃)對(duì)MGO和GO形成的影響。

(4) 抑制劑染料木黃酮：在還原糖為葡萄糖，pH 7.4，反應(yīng)溫度121 ℃的條件下，分別在0，5，15，30，60 min考察抑制劑染料木黃酮(60 mmol/L)對(duì)MGO和GO形成的影響。

抑制率按式(1)計(jì)算：

(1)

式中：

C——抑制率，%；

W1——對(duì)照組GO/MGO含量，mmol/L；

W2——試驗(yàn)組GO/MGO含量，mmol/L。

1.3.3 Arg-葡萄糖模擬體系中MGO和GO形成的動(dòng)力學(xué)模型研究

(1) 樣品制備：在pH 7.4條件下，將終濃度均為60 mmol/L 精氨酸和葡萄糖混合液于100，121，135，150，180 ℃油浴中加熱0，5，10，15，20，30，40，60 min后分別取樣于樣品管中，于-20 ℃保存[8]115-118[14]。

(2) 體系中反應(yīng)物葡萄糖含量測(cè)定：采用三甲基氯硅烷衍生化，氣相色譜方法[15]測(cè)定葡萄糖含量。色譜柱HP-5(30 m ×0.32 mm id，0.25 μm)；進(jìn)樣溫度250 ℃，壓力68 947.57 Pa，不分流；初始柱溫100 ℃保持5 min，程序升溫第一階段5 ℃ /min升至150 ℃保持5 min，第二階段5 ℃/min 升至240 ℃保持2 min；FID檢測(cè)器溫度280 ℃。載氣流量：H2流量30 mL/min，空氣流量300 mL/min，N2流量25 mL/min。

(3) 體系中反應(yīng)物Arg含量測(cè)定：使用1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB)液相色譜方法[16]測(cè)定Arg含量，流動(dòng)相：醋酸鈉緩沖溶液-乙腈(75∶15)。

(4) 體系中中間產(chǎn)物MGO和GO含量測(cè)定：同1.3.1。

(5) MGO/GO形成的動(dòng)力學(xué)模型參數(shù)計(jì)算：阿倫尼烏斯速率常數(shù)公式(arrhenius equation for the rate constant)是用來(lái)表征溫度對(duì)反應(yīng)速率常數(shù)影響的關(guān)系式，能反映反應(yīng)速率對(duì)溫度的依賴關(guān)系。從平衡常數(shù)與溫度的關(guān)系以及平衡常數(shù)與反應(yīng)速率常數(shù)的關(guān)系，推斷反應(yīng)速率常數(shù)k與溫度T的關(guān)系的指數(shù)形式為：

(2)

式中：

k——反應(yīng)速率常數(shù)；

A——指數(shù)前因子或頻率因子；

Ea——活化能，kJ/mol；

R——摩爾氣體常數(shù)，8.314/(mol·K)；

T——開(kāi)爾文溫度，K。

將式(2)積分可得：

(3)

(4)

(5)

式中：

t——反應(yīng)時(shí)間，s；

c(Arg)——Arg的濃度，mmol/L；

c(Glu)——葡萄糖的濃度，mmol/L；

c(MGO)——MGO的濃度，mmol/L；

c(GO)——GO的濃度，mmol/L；

k1——葡萄糖在Arg作用下生成MGO的反應(yīng)速率常數(shù)；

k2——葡萄糖在Arg作用下生成GO的反應(yīng)速率常數(shù)。

當(dāng)t=0時(shí)，Arg和葡萄糖的濃度為60 mmol/L；c(MGO) 和c(GO)為0 mmol/L。

1.3.4 染料木黃酮抑制Arg-葡萄糖模擬體系MGO和GO形成的動(dòng)力學(xué)研究

(1) 染料木黃酮抑制MGO和GO的量效關(guān)系：在pH 7.4，終濃度均為60 mmol/L精氨酸和葡萄糖混合液中，添加不同濃度染料木黃酮(0.005，0.050，0.500，5.000，50.000 mmol/L)，180 ℃反應(yīng)20 min，根據(jù)1.3.1檢測(cè)樣品中的MGO、GO含量，計(jì)算抑制率[8]115-116。

(2) 染料木黃酮抑制MGO和GO的動(dòng)力學(xué)研究：在pH 7.4，終濃度均為60 mmol/L精氨酸和葡萄糖混合液中，添加50 mmol/L染料木黃酮，分別反應(yīng)0，5，10，15，20，30，40，60 min，根據(jù)1.3.1檢測(cè)樣品中的MGO、GO含量，計(jì)算抑制率[8]117-118。

(3) 染料木黃酮抑制MGO/GO形成動(dòng)力學(xué)模型的構(gòu)建：同1.3.3(5)。

1.3.5 染料木黃酮消除Arg-葡萄糖模擬體系中1,2-二羰基化合物形成的機(jī)制研究

(1) 樣品的制備：將1.3.4(2)項(xiàng)下反應(yīng)5 min的樣品取出后解凍，取1 mL于10 mL離心管中，加入2 mL乙酸乙酯渦旋10 min，4 086×g離心10 min取出上清液，萃取2次。濃縮至干，用70%的甲醇復(fù)溶，備用。

(2) 液相色譜條件：色譜柱kromasil 100-5 C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm，流動(dòng)相甲醇-水(60∶40)，流速0.6 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，柱溫30 ℃。

(3) 質(zhì)譜條件：電噴霧負(fù)離子化(ESI-)檢測(cè)，掃描范圍為m/z100～1 000；噴霧電壓 4 000 V，霧化壓力310 264.07 Pa，輔助氣壓 34 473.79 Pa，毛細(xì)管溫度280 ℃，裂解電壓135 V。

1.3.6 統(tǒng)計(jì)分析方法 采用Excel 2013軟件和Minitab 16軟件統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)。所有試驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 Arg-還原糖模擬體系生成MGO和GO的影響因素分析

運(yùn)用氣相色譜法同時(shí)測(cè)定Arg-還原糖體系中產(chǎn)生的中間產(chǎn)物MGO和GO的量，通過(guò)色譜峰分別計(jì)算MGO、GO和丁二酮(內(nèi)標(biāo))的峰面積之比，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(MGO：y=1.454 5x+0.13 11，R2=0.996 1；GO：y=1.187 7x+0.157 1，R2=0.997 1)計(jì)算MGO和GO的含量。

2.1.1 糖種類對(duì)Arg-還原糖體系MGO和GO生成的影響

由圖1可知，在Arg-還原糖模擬體系中，除核糖和半乳糖體系外，均在反應(yīng)60 min時(shí)MGO和GO濃度達(dá)到最高值，且不同還原糖體系中GO的含量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷增加。而在核糖和半乳糖體系中MGO含量在反應(yīng) 30 min 時(shí)達(dá)到最高值，后有小幅度下降；而其他還原糖MGO產(chǎn)生量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)持續(xù)增高。對(duì)比MGO和GO產(chǎn)生量可知，MGO的量高于GO的，且約為GO量的3倍。

圖1 Arg-還原糖模型中還原糖對(duì)體系MGO和GO生成的影響

Figure 1 Effect of reducing sugar on the formation of MGO and GO content in Arg-reducing sugar models

2.1.2 pH值對(duì)Arg-葡萄糖體系MGO和GO生成的影響

由圖2可知，首先，MGO和GO的生成量均在pH為9.2 最高，其次為pH 7.4，而pH 6.5時(shí)MGO和GO的量很少。由此可以看出MGO和GO更容易在堿性條件下產(chǎn)生。此外，Weenen等[17]研究也表明MGO是由脫氧葡糖醛酮通過(guò)逆醇醛縮合作用裂解產(chǎn)生，而在pH>7時(shí)逆醇醛縮合和裂解作用加強(qiáng)[18]，有利于形成MGO，因此在堿性條件下含量增加明顯。

圖2 pH對(duì)Arg-葡萄糖模型體系MGO和GO生成的影響

Figure 2 Effect of pH on the formation of MGO and GO concentrations in Arg-glucose model

2.1.3 染料木黃酮抑制Arg-葡萄糖體系MGO和GO生成的能力 由圖3可知，染料木黃酮在180 ℃時(shí)可以有效地抑制Arg和葡萄糖反應(yīng)生成MGO和GO。當(dāng)反應(yīng)達(dá)到60 min時(shí)，染料木黃酮對(duì)MGO和GO的抑制率均達(dá)到最高，分別為47.5%和56.8%。

圖3 染料木黃酮抑制Arg-葡萄糖體系生成的MGO和GO

2.1.4 影響MGO和GO形成因素及其交互作用分析 由表1可知，體系中影響MGO和GO形成的最重要因素是時(shí)間，影響MGO形成的第二大因素是pH，其次為溫度；而影響GO的第二大因素是溫度，隨之是pH。

反應(yīng)時(shí)間是影響MGO和GO形成的最主要因素，在反應(yīng)早期階段，MGO和GO均會(huì)隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)快速增長(zhǎng)；pH對(duì)MGO的影響較為顯著，位列第二，因?yàn)?，在堿性條件下MGO的形成大幅增加，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于GO的增加量，故pH對(duì)GO形成的影響位列第三；溫度對(duì)GO和MGO的形成作用均較為顯著，隨著反應(yīng)溫度的升高而使生成量增加。由此，進(jìn)一步探討MGO/GO產(chǎn)生的動(dòng)力學(xué)過(guò)程。

表1影響Arg-還原糖體系MGO/GO形成的因素及交互作用

Table 1 Contribution of factors and interactions on the production of MGO & GO

項(xiàng)目影響因素或交互影響因素所占比例/%MGOGO時(shí)間28.51725.673還原糖種類6.6546.814pH值20.85314.225染料木黃酮4.4935.457溫度13.51820.550時(shí)間×還原糖種類2.3561.831時(shí)間×pH5.2276.770時(shí)間×染料木黃酮0.9361.854時(shí)間×溫度4.9045.768誤差12.54211.058

2.2 Arg-葡萄糖模型中MGO和GO形成的動(dòng)力學(xué)研究

2.2.1 Arg濃度變化的動(dòng)力學(xué)曲線 從圖4中可以看出，Arg濃度隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而迅速降低；且溫度越高，Arg濃度衰減越快，特別是在反應(yīng)180 ℃時(shí)。在高溫加熱10 min之內(nèi)，Arg濃度下降到最低點(diǎn)。Arg濃度的降低主要來(lái)自兩個(gè)方面：① Arg與葡萄糖反應(yīng)生成Schiff base等產(chǎn)物[19]；② Arg參與交聯(lián)反應(yīng)，與自身交聯(lián)或是與中間產(chǎn)物MGO、GO交聯(lián)形成新化合物[20-24]。

圖4 Arg-葡萄糖模擬體系中Arg的動(dòng)力學(xué)變化曲線

2.2.2 葡萄糖濃度變化的動(dòng)力學(xué)曲線 由圖5可知，葡萄糖濃度隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，30 min后逐漸趨于平緩。而在同一時(shí)間點(diǎn)，溫度越高葡萄糖濃度越低；反應(yīng)物葡萄糖的變化趨勢(shì)與Arg的變化趨勢(shì)基本一致。葡萄糖濃度的降低也是源于兩個(gè)原因：① 葡萄糖自身受熱氧化降解形成糖基化中間產(chǎn)物MGO或GO[25]；② 葡萄糖與Arg生成Schiff base等產(chǎn)物。

圖5 Arg-葡萄糖模擬體系中葡萄糖的動(dòng)力學(xué)變化曲線

2.2.3 MGO/GO生成量的動(dòng)力學(xué)曲線 由圖6可知，在Arg-葡萄糖高溫加熱的體系中，MGO的濃度隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷增加；且反應(yīng)溫度越高，MGO的生成量越多。GO的濃度隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)遞增的趨勢(shì)，且隨著溫度的升高，GO生成量增加。其中與MGO生成量不同的是，在反應(yīng)溫度為100 ℃時(shí)，GO的生成量極少。

圖6 Arg-葡萄糖模擬體系中MGO/GO的動(dòng)力學(xué)變化曲線

Figure 6 The kinetics curve of MGO/GO in Arg-glucose model system in Arg-glucose model

2.3 染料木黃酮抑制Arg-葡萄糖模型體系中MGO/GO的動(dòng)力學(xué)研究

2.3.1 染料木黃酮抑制MGO/GO的量效關(guān)系 根據(jù)溫度、時(shí)間和抑制劑對(duì)Arg-葡萄糖模型體系中MGO和GO的形成量影響結(jié)果，選取在180 ℃，反應(yīng)20 min條件下，考察染料木黃酮對(duì)Arg-葡萄糖模型體系中MGO和GO的抑制作用的量效關(guān)系，染料木黃酮的添加量設(shè)定為0.005，0.050，0.500，5.000，50.000 mmol/L。由圖7可知，在上述添加量，染料木黃酮對(duì)Arg-葡萄糖中MGO的抑制率依次為21.1%，29.7%，37.1%，44.7%，50.4%，同時(shí)對(duì)GO的抑制率依次為37.7%，43.2%，50.0%，58.0%，65.0%。表明隨著抑制劑添加量的增加，抑制率增大，且各試驗(yàn)組存在顯著性差異(P<0.05)。由此推測(cè)：染料木黃酮可能在源頭抑制MGO/GO生成；抑或同等程度捕獲MGO/GO，從而呈現(xiàn)抑制率隨著濃度增加而增長(zhǎng)的良好相關(guān)性。另外，在180 ℃反應(yīng)20 min時(shí)，發(fā)現(xiàn)Arg-葡萄糖模型中對(duì)MGO和GO的抑制率均在添加量水平為50 mmol/L 時(shí)達(dá)到最大，因此，選用50 mmol/L為染料木黃酮的添加量。

圖7 Arg-葡萄糖模型中MGO/GO生成量與染料木黃酮添加量的關(guān)系

Figure 7 Relationship between MGO/GO contents and addition levels of genistein in Arg-glucose model

2.3.2 染料木黃酮抑制MGO/GO的動(dòng)力學(xué)研究 圖8為對(duì)照組(對(duì)照)和抑制組(+G)中MGO和GO含量隨著時(shí)間變化的曲線。結(jié)果表明，在Arg-葡萄糖模型體系中，反應(yīng)5 min，染料木黃酮即抑制MGO和GO生成，且隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制效果呈現(xiàn)增強(qiáng)趨勢(shì)。在反應(yīng)達(dá)到60 min 時(shí)，對(duì)Arg-葡萄糖模型中MGO和GO的抑制率分別為45.0%和51.1%。

2.3.3 染料木黃酮抑制MGO/GO的動(dòng)力學(xué)參數(shù)對(duì)反應(yīng)過(guò)程的影響 為了進(jìn)一步研究Arg-葡萄糖模擬體系中MGO和GO形成的動(dòng)力學(xué)機(jī)制，根據(jù)上述動(dòng)力學(xué)曲線圖(圖4～6)，計(jì)算不同溫度(100，121，135，150，180 ℃)下，反應(yīng)速率常數(shù)k以及表觀活化能Ea。從表2可以看出，在Arg-葡萄糖模型中，隨著溫度的升高，反應(yīng)速率常數(shù)逐漸提高，表明該反應(yīng)為吸熱反應(yīng)。在Arg-葡萄糖模型中MGO的表觀活化能顯著低于GO，因此MGO的反應(yīng)速率比GO高。表明體系中產(chǎn)生MGO反應(yīng)更易于發(fā)生。同時(shí)， MGO的反應(yīng)速率常數(shù)均比GO的反應(yīng)速率常數(shù)高，也可以得出該結(jié)論。

圖8 染料木黃酮抑制Arg-葡萄糖模型體系中MGO/GO的形成動(dòng)力學(xué)曲線

Figure 8 Inhibitory effect of genistein on the kinetic profiles of MGO/GO formation in Arg-glucose model

另外，對(duì)比對(duì)照組和抑制組發(fā)現(xiàn)，抑制組的反應(yīng)速率常數(shù)均低于對(duì)照組，說(shuō)明染料木黃酮可以抑制Arg-葡萄糖模型中MGO和GO的形成。

表2染料木黃酮介入前后，MGO和GO形成的動(dòng)力學(xué)模型參數(shù)

Table2 Parameter of kinetics models for the formation of MGO/GO before/after genistein involved in (n=3)

組別溫度/℃反應(yīng)速度常數(shù)/(×10-3 min-1)MGOGO抑制組對(duì)照組活化能1800.767 2±0.0120.401 6±0.0111000.010 0±0.0050.001 0±0.0131210.024 3±0.0020.008 7±0.0331350.138 3±0.0530.084 1±0.0211500.457 9±0.0780.262 7±0.0401801.466 1±0.0450.931 8±0.041kJ/mol10.732 014.281 9

2.4 染料木黃酮消除Arg-葡萄糖體系中1,2-二羰基化合物的機(jī)制研究

由上述結(jié)果可知染料木黃酮的介入能顯著降低Arg-葡萄糖體系中MGO的形成，鑒于本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果，在模擬生理?xiàng)l件下(37 ℃，pH 7.4)，染料木素與MGO易于形成加合產(chǎn)物[26]。為驗(yàn)證在Arg-葡萄糖體系中染料木素是否具有同樣的效能，本試驗(yàn)選取添加染料木黃酮于Arg-葡萄糖體系中，180 ℃反應(yīng)5 min，采用LC-MS分析反應(yīng)混合物中染料木黃酮的變化。如圖9所示，除了染料木素色譜峰(12.16 min)外，出現(xiàn)新的色譜峰(6.43，7.08 min)。如圖10所示，ESI-MS(m/z)準(zhǔn)分子峰341[M—H]-，分子量比染料木黃酮多了72(MGO)，推測(cè)為染料木素-MGO的加合產(chǎn)物。由此可知染料木黃酮消除Arg-還原糖體系中1,2-二羰基化合物的機(jī)制是通過(guò)捕獲Arg-葡萄糖體系中生成的MGO形成加合產(chǎn)物，從而降低了體系中MGO。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)氣相色譜法檢測(cè)Arg-還原糖模型體系產(chǎn)生的中間產(chǎn)物MGO和GO，考察還原糖的種類、時(shí)間、pH、溫度和抑制劑染料木黃酮等對(duì)模擬體系生成MGO和GO的影響；采用動(dòng)力學(xué)模型研究高溫加熱條件下的Arg-葡萄糖模擬體系中MGO和GO形成以及染料木素抑制的動(dòng)力學(xué)過(guò)程。綜合分析各影響因素試驗(yàn)結(jié)果表明，時(shí)間是影響Arg-還原糖模型體系產(chǎn)生MGO和GO的最主要因素。在Arg-葡萄糖模型中MGO的反應(yīng)速率常數(shù)均大于GO的，生成MGO的表觀活化能均低于生成GO的活化能，說(shuō)明在此反應(yīng)過(guò)程中更容易生成MGO。染料木黃酮介入之后，1,2-二羰基化合物產(chǎn)生的化學(xué)反應(yīng)速率比介入之前明顯降低，說(shuō)明染料木黃酮可以有效抑制Arg-葡萄糖體系產(chǎn)生的1,2-二羰基化合物。當(dāng)染料木黃酮的添加量為50 mmol/L時(shí)抑制效果最佳。LC-MS結(jié)果表明染料木黃酮消除Arg-葡萄糖體系中的1,2-二羰基化合物的機(jī)制是染料木黃酮通過(guò)捕獲該體系中MGO形成加合產(chǎn)物而達(dá)到清除的效果。由于試驗(yàn)時(shí)間的限制，本試驗(yàn)研究了Arg-葡萄糖體系中糖基化中間產(chǎn)物MGO與GO的形成及抑制，今后還將進(jìn)一步研究該體系中糖基化終末產(chǎn)物AGEs的形成及抑制的相關(guān)機(jī)制。

圖9 染料木黃酮消除Arg-葡萄糖體系中1,2-二羰基化合物的機(jī)制液相圖

Figure 9 The liquid chromatogram of genistein on elimination of 1,2-dicarbonyl compounds in Arg-glucose model

圖10 染料木黃酮消除Arg-還原糖體系中1,2-二羰基化合物的機(jī)制質(zhì)譜圖

Figure 10 The mass spectrum of genistein on elimination of 1,2-dicarbonyl compounds in Arg-glucose model