王浩宇 王 恬 程燕宇 魏 侖 高福祿 吳靖芳△

(河北北方學院,1 組織學與胚胎學教研室,2 臨床醫(yī)學本科,張家口 075000;3 河北師范大學生命科學學院,石家莊 050024)

唇腭裂是顏面部較常見的先天性畸形,并可伴隨鄰近組織器官的發(fā)育障礙,如鼻和上下頜骨的發(fā)育畸形。目前認為腭裂的發(fā)病機制是基因與環(huán)境因素相互作用的結(jié)果,其中藥物毒理研究表明,胚胎致畸敏感期藥物可誘發(fā)唇腭裂。地塞米松(dexamethasone)可導致胎兒發(fā)育畸形。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)-2基因的作用主要是針對骨及其相關(guān)組織的生長發(fā)育,誘導骨祖細胞向骨細胞分化和發(fā)育[1]。甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子(thyroid transcription factor,TTF)-2基因的作用主要是針對甲狀腺和腭的生長發(fā)育,若此基因發(fā)生突變可相應(yīng)地使甲狀腺發(fā)育障礙和腭裂的形成[2]。TTF-2基因?qū)θ艘灿蓄愃频淖饔肹3-4]。本研究通過地塞米松誘導胎鼠腭裂模型,應(yīng)用體視學顯微鏡觀察胚胎各時期的形態(tài)學變化,為進一步探討地塞米松對胎鼠發(fā)育的影響提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

地塞米松磷酸鈉注射液(鄭州卓峰制藥),BMP-2兔抗小鼠抗體(Bioworld technology公司,美國,型號BS3473);TTF-2兔抗小鼠抗體(Bioworld technology公司,美國,型號BS2240),SP免疫組織化學試劑盒,DAB顯示試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2 小鼠腭裂模型的建立

取健康成年昆明白小鼠,雄鼠24只,雌鼠48只,購自河北北方學院動物中心,于前一天下午6：00雌雄比例為2∶1合籠,次日早上7：00檢查雌鼠,發(fā)現(xiàn)陰栓之日定為孕期第零天。平均分為實驗組和對照組,實驗組在孕期11.5d腹腔注射地塞米松50mg/kg誘導腭裂動物模型,對照組以等量的生理鹽水代替。兩組小鼠的飼養(yǎng)條件相同,于孕期14.5、15.5、16.5d脫頸處死孕鼠取胎鼠并記錄總胎數(shù)、活胎數(shù)和死胎數(shù)。將胎鼠放入PBS沖洗,放入Bouin固定液中固定24h后進行后續(xù)實驗。

胎鼠頭顱側(cè)貌測量：將全部胚胎置于體視學顯微鏡下拍攝頭顱側(cè)位像,隨后在鏡下檢測腭裂發(fā)生,剔除實驗組中發(fā)育正常的胚胎。參照蔡志剛等[5]的研究方法,進一步在軟件中進行頭顱側(cè)位軟組織側(cè)貌測量研究(圖1)。BF：下頜體長度;∠NAK：上頜突角;∠NBD：下頜突角;∠ABD：上下頜關(guān)系角。

為保證定點的準確性,選擇下頜骨下緣延伸線L為基準線,參考口裂平面和下頜下緣平面,L的確定相對恒定。A：上唇最突點;B：下唇最突點;N：鼻根點;E：口角點;N：鼻額切線上鼻突點;L：下頜下緣延伸線;LL：口裂延伸線;AK、BD、NG、LL均平行于L;EF⊥BD。

1.3 H-E染色觀察腭部形態(tài)學變化

通過脫水、透明、浸蠟及定向包埋;冠狀位切片(以麥克爾軟骨為基準)，切片厚5μm;常規(guī)二甲苯脫蠟,梯度乙醇至水化,對標本行H-E染色,置于光鏡下觀察腭部的組織學變化。

1.4 免疫組織化學顯色法檢測BMP-2和TTF-2在鼻中隔軟骨中的表達

切片脫蠟至水,用0.01mol/L檸檬酸鹽抗原修復(fù)液水浴加熱修復(fù),室溫放置30min;3% H2O2室溫孵育10min,正常山羊血清封閉,室溫孵育30min,傾去血清,滴加適當比例一抗(1∶100)濕盒孵育4℃過夜;

二抗37℃孵育30min;DAB溶液顯色,蘇木精染液復(fù)染,鹽酸乙醇藍化,二甲苯透明,中性樹膠封片。

各組隨機選取8張載玻片,每張載玻片在光學顯微鏡(×400倍)下隨機取5個非重疊視野,用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件對數(shù)據(jù)進行分析。鼻中隔軟骨BMP-2和TTF-2表達陽性細胞為胞質(zhì)呈棕黃色。根據(jù)細胞染色強度與染色細胞所占面積的比積分吸光值(integral absorbance,IA值)對結(jié)果進行分析。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 胚胎腭裂的發(fā)生情況(表1)

腭裂發(fā)生率統(tǒng)計結(jié)果顯示(表1)，GD11.5d腹腔注射地塞米松50mg/kg誘導腭裂發(fā)生率大于50%，于GD14.5d、GD15.5d和GD16.5d取材胎鼠的腭裂發(fā)生率無差別，3組與同期對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

表1 各組胎鼠的腭裂發(fā)生率(%)Tab 1 The incidence of clefe palate of each group (%)

**P<0.01vscontrol

2.2 頭顱軟組織側(cè)貌分析(圖1,見封二，表2)

頭顱軟組織側(cè)貌形態(tài)學測量結(jié)果顯示,實驗組腭裂小鼠伴有明顯的下頜體(BF)短縮;上頜突角(∠NAK)、下頜突角(∠NBD)均顯示后縮畸形,實驗組∠ABD均明顯大于對照組(P<0.01),上下頜均表現(xiàn)出明顯的發(fā)育障礙,而下頜后縮較上頜后縮更加明顯。

2.3 H-E染色觀察

孕期14.5d：實驗組和對照組的胎鼠腭突均上抬至水平,對照組腭突進一步融合,并有上皮中縫形成,實驗組腭突無進一步融合,腭突不再生長;孕期15.5d：對照組的嵴上皮細胞繼續(xù)生長使上皮中縫消失,腭突完整。實驗組的腭突體積過小,兩腭突無法融合;孕期16.5d對照組腭部發(fā)育完好,實驗組形成腭裂(圖2，見封二)。

表2 胎鼠頭顱軟組織側(cè)貌形態(tài)測量學結(jié)果Tab 2 The craniomaxillofacial soft tissue morphology of mouse embryos

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

2.4 BMP-2和TTF-2蛋白的表達

免疫組織化學檢測顯示BMP-2和TTF-2在腭裂胎鼠鼻中隔軟骨中持續(xù)表達;孕期14.5～16.5d實驗組鼻中隔軟骨細胞中BMP-2陽性信號表達水平依次增強,且同時間實驗組陽性低于對照組(P<0.05);對照組鼻中隔軟骨TTF-2表達呈現(xiàn)波動性,孕期15.5d表達最高,而實驗組在孕期16.5d仍持續(xù)增高,數(shù)值高于對照組(P<0.05)(圖3，見封二,表3)。

表3 實驗組與對照組BMP-2與TTF-2的表達(IA值)比較Tab 3 The IA values of BMP-2 and TTF-2 in experimental and control groups

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

3 討論

目前腭裂畸形動物模型的制備方法有多種,因受實驗條件與技術(shù)手段的制約,國內(nèi)學者普遍選用C57BL/6J小鼠或昆明白小鼠作為致畸動物,而在選擇致畸藥物的種類、用量及給藥時間等方面存在較多差異。陳沐等[6]選用C57BL/6J小鼠用全反式維甲酸梯度濃度灌胃的方式建立腭裂模型,結(jié)果顯示100mg/kg為最佳誘導濃度。柴茂洲等[7]對孕期10d孕鼠連續(xù)3d 胃飼四氯苯對二惡英3μg/kg,聯(lián)合腹腔注射地塞米松6mg/kg,腭裂的發(fā)生率可達100%。本課題組通過前期實驗已證實,在孕期11.5d對昆明白小鼠腹腔注射地塞米松50mg/kg,同樣可以有效建立腭裂模型[8]。

先天性的腭裂患者往往伴有顱面部骨骼的發(fā)育畸形,形成咬合關(guān)系的錯亂以及造成顏面部的不美觀。動物實驗顯示,胚胎在過量攝入維甲酸類藥物可導致神經(jīng)系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)及顏面部畸形,而上頜骨的發(fā)育障礙是腭裂畸形的表現(xiàn)之一[9-10]。Kai等[11]對人類與鼠類腭裂的口腔組織結(jié)構(gòu)比較研究認為,腭裂標本鼻中隔的軟骨以及鼻中隔的附屬器官均表現(xiàn)出發(fā)育不足,組織內(nèi)細胞的增生與分化伴隨硬腭與軟腭關(guān)閉的全程。結(jié)合本研究頭顱軟組織側(cè)貌分析結(jié)果,顯示地塞米松誘導后胎鼠上頜骨長度縮短,導致整個上頜骨體形狀的整體改變,造成組織器官位置的變化,說明地塞米松誘導的腭裂模型,在抑制腭突融合產(chǎn)生腭裂畸形時,也會影響到頜面部的正常發(fā)育,這一點有別于繼發(fā)性腭裂,更接近于臨床上的原發(fā)性腭裂。

免疫組織化學顯色結(jié)果顯示,孕期15.5d時正常對照組鼻中隔軟骨BMP-2呈高水平表達,實驗組地塞米松作用后表達下調(diào)(BMP-2持續(xù)增高);正常對照組鼻中隔軟骨TTF-2表達呈現(xiàn)波動性,孕期15.5d表達最高,而實驗組在孕期16.5d仍持續(xù)增高,數(shù)值高于對照組。BMP屬于是轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor β,TGFβ)超級家族的成員,參與胚胎發(fā)育中多種干細胞的分化活動,可誘導未分化間充質(zhì)細胞向骨細胞及軟骨細胞分化而BMP-2在膜內(nèi)成骨和軟骨內(nèi)成骨中呈現(xiàn)高表達[12]。TTF-2屬于叉頭/螺旋翼結(jié)構(gòu)域蛋白家族,通過特異性選擇結(jié)合甲狀腺球蛋白和甲狀腺過氧化物酶基因的啟動子來調(diào)控轉(zhuǎn)錄,其在胚胎發(fā)育中具有高度組織和時空特異性,是甲狀腺、腭等器官發(fā)育的重要調(diào)節(jié)因子[13]。

胚胎時期若TTF-2持續(xù)表達往往表現(xiàn)為甲狀腺發(fā)育不全或者腭裂,而正常小鼠的TTF-2表達并不持續(xù)是一個短暫的過程。在正常胎鼠腭突的發(fā)育過程中,當TTF-2表達降低或消失時,腭突將融合,腭裂也不會形成。Christian等[14]從基因角度表明TGFβ3和TTF-2的相互作用,也會對胎鼠腭部發(fā)育有重要的影響。兩種基因的協(xié)調(diào)發(fā)展使腭突向正常的方向發(fā)展,并且發(fā)生融合形成正常的腭部,當兩種基因的協(xié)調(diào)過程出現(xiàn)干擾就會導致腭突的發(fā)育畸形。而石冰等[15]通過建立地塞米松誘導腭裂模型,表明了地塞米松影響腭細胞表皮生長因子和TGFβ1的基因表達改變腭細胞的正常生長,從而形成腭裂。更有學者認為地塞米松可抑制間充質(zhì)細胞的增殖分化,直接影響腭突中間緣上皮細胞的代謝過程,啟動增殖和凋亡機制抑制胎鼠面部的發(fā)育導致腭裂等畸形的發(fā)生[16]。根據(jù)一些學者通過對腭裂發(fā)生機制的研究表明,腭裂的發(fā)生可追溯到胚胎細胞,通過影響胚胎細胞外基質(zhì)影響腭細胞的生長,當致畸因子作用于此時期便會發(fā)生腭裂,并且可影響多種生長因子的基因表達而導致此結(jié)果[17-18]。

綜上，地塞米松可有效誘導胎鼠腭裂及顱面部畸形的發(fā)生,該動物模型的建立是研究顱面部畸形的實用工具,并可為今后在胚胎學及分子生物學研究發(fā)病機制給予幫助。

圖1 胎鼠在孕期14.5、15.5、16.5d對照組(A～C)與實驗組(D～F)側(cè)貌分析,標尺=2mm.

圖2 胎鼠在孕期14.5、15.5、16.5d對照組(A～C)與實驗組(D～F)H-E染色結(jié)果,標尺=200μm。S：鼻中隔；P：腭突.

圖3 胎鼠在孕期16.5實驗組鼻中隔免疫組織化學顯色,標尺=50μm。A,B,C：BMP-2染色；D,E,F：TTF-2染色.

Fig 1 The craniomaxillofacial morphology of fetal mouse on gestation day 14.5、15.5、16.5 in the control group (A-C) and experimental group (D-F),bar=2mm.

Fig 2 H-E staining results in morphology change of fetal mouse on gestation day 14.5、15.5、16.5 in the control group (A-C) and experimental group (D-F).S：Septum nasi;P：Palatine process,bar=200μm.

Fig 3 lmmunohistochemistry results in nasal septum of the experimental group on gestation day 16.5,bar=50μm.A,B,C：BMP-2 staining;D,E,F：TTF-2 staining.