林 旭 代 金 吳靖芳△ 張 靜 張文靜 薛 剛 高福祿

(河北北方學(xué)院,1 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,2 附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科,張家口 075000;3 河北師范大學(xué),石家莊 050024)

甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid cancer,PTC)是頭頸部最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,其預(yù)后良好,但仍有部分患者在確診前發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或經(jīng)治療后復(fù)發(fā)[1]。癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程,癌細(xì)胞的高黏附作用與腫瘤高轉(zhuǎn)移性密切相關(guān)。三葉因子3(trefoil factor 3,TFF3)是三葉因子家族成員之一,有學(xué)者認(rèn)為TFF3是潛在的癌基因,且高表達(dá)的TFF3具有促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移的作用[2-5]。β-catenin作為Wnt/β-catenin信號(hào)通路中一個(gè)核心的靶點(diǎn),直接參與了細(xì)胞黏附[6]。本課題組前期工作表明,TFF3在PTC中高表達(dá)并與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)[7],但關(guān)于TFF3是否通過(guò)影響PTC細(xì)胞的黏附作用進(jìn)而影響該細(xì)胞向淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和侵襲能力尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究對(duì)敲低TFF3表達(dá)的TPC-1細(xì)胞株進(jìn)行同質(zhì)和異質(zhì)黏附實(shí)驗(yàn),明確TFF3對(duì)TPC-1黏附作用機(jī)制,為PTC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、BSA基購(gòu)自Gibco;TPC-1細(xì)胞株購(gòu)自ATCC;鼠抗人β-catenin、activated leukocyte cell adhesion molecule (ALCAM)、MMP-9、MMP-2、E-cadherin購(gòu)自Santa Cruz公司;FastQuan RT Kit購(gòu)自TIANGEN公司;纖維連接蛋白(FN)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;TRIzol裂解液購(gòu)自Invitrogen公司;BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、RIPA裂解液、ECL發(fā)光液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;蛋白預(yù)染marker、PowerUpTMSYBR Green Master Mix購(gòu)自賽默飛科技有限公司。DAB顯色液購(gòu)自中杉金橋公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

TPC-1細(xì)胞培養(yǎng)于含有10% FBS、1%青霉素-鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中;穩(wěn)定沉默TFF3表達(dá)的TPC-1細(xì)胞株(shTFF3-TPC-1)培養(yǎng)于含有10% FBS、1%青霉素-鏈霉素、嘌呤霉素(2mg/L)的RPMI 1640培養(yǎng)液中;轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒載體的TPC-1細(xì)胞株(shRNAC-TPC-1)培養(yǎng)于含有10% FBS、1%青霉素-鏈霉素、嘌呤霉素(2mg/L)的RPMI 1640培養(yǎng)液中,3株細(xì)胞慢病毒轉(zhuǎn)染成功建立了穩(wěn)定敲低TFF3表達(dá)的TPC-1細(xì)胞株(shTFF3-TPC-1)和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒載體的TPC-1細(xì)胞株(shRNAC-TPC-1),置于5% CO2、37℃的孵育箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞同質(zhì)黏附實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的shTFF3-TPC-1、shRNAC-TPC-1、TPC-1 3組細(xì)胞用培養(yǎng)基制備成1×105/ml密度,每孔100μl接種于48孔板,37℃培養(yǎng)1h后洗去未黏附細(xì)胞,PBS洗3次收集未黏附細(xì)胞(同質(zhì)黏附細(xì)胞數(shù)=加入細(xì)胞數(shù)-未黏附細(xì)胞數(shù))。

1.4 細(xì)胞異質(zhì)黏附實(shí)驗(yàn)

以10mg/L FN包被基底膜,超凈臺(tái)吹干后PSB洗3次,以1% BSA每孔200μl封閉1h,將3組細(xì)胞數(shù)調(diào)整為1×105/ml密度,每孔接種100μl,37℃孵育,90min后終止培養(yǎng)。4%多聚甲醛固定15min,400×顯微鏡下計(jì)數(shù)黏附細(xì)胞數(shù)量。

1.5 Real-time quantitative PCR (qPCR)檢測(cè)β-catenin、TFF3 mRNA水平

TRIzol法提取shRNA-TFF3-TPC-1、shRNAC-TPC-1、TPC-1 3組細(xì)胞總RNA;根據(jù)FastQuan RT Kit試劑盒說(shuō)明書反轉(zhuǎn)錄cDNA;根據(jù)PowerUpTM SYBR Green Master Mix說(shuō)明書進(jìn)行qPCR檢測(cè)。β-catenin上游引物5′-TGCAGTTCGCCTTCACTATG-3′,下游引物5′-ACTAGTCGTGGAATGGCACC-3′;β-actin上游引物5′-CCTGGGCATGGAGTCCTGTG-3′,下游引物5′-AGGGGCCGGACT CGTCATAC-3′；TFF3上游引物：5′-AATGCACCTTCTGAGGCAC CT-3′，下游引物5′-CGTTAAGACATCAGGCTCC AGAT-3′。

1.6 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)β-catenin、ALCAM、MMP-9、MMP-2、E-cadherin的蛋白表達(dá)水平

消化3組細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度到1×104/ml。蓋玻片放于6孔板內(nèi),將1ml細(xì)胞懸液滴加于蓋玻片上,過(guò)夜。待細(xì)胞融合度達(dá)80%后,4%多聚甲醛固定15min。正常羊血請(qǐng)封閉15min,一抗4℃孵育過(guò)夜(β-catenin、ALCAM、MMP-9、MMP-2、E-cadherin,工作濃度均為1∶100),二抗(羊抗兔lgG)37℃孵育30min,三抗(辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素)37℃孵育30min,DAB顯色,蘇木精復(fù)染,乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹(shù)膠封片。陰性對(duì)照以PBS代替一抗。

1.7 免疫印跡檢測(cè)β-catenin、ALCAM、MMP-9、MMP-2、E-cadherin的蛋白表達(dá)水平

以RIPA液裂解3組細(xì)胞,提取總蛋白,BCA法測(cè)定蛋白濃度,SDS-PAGE電泳分離蛋白并且轉(zhuǎn)膜到PVDF膜上,脫脂奶粉封閉1h,PBST洗3次后,分別孵育一抗(β-catenin、ALCAM、MMP-9、MMP-2、E-cadherin,工作濃度均為1∶300)4℃過(guò)夜,辣根過(guò)氧化物標(biāo)記的山羊抗兔/鼠抗體(1∶5000) 二抗37℃孵育1h,ECL顯色。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 同質(zhì)黏附細(xì)胞數(shù)

shRNA-TFF3組同質(zhì)黏附細(xì)胞數(shù)(2111.15±427)顯著高于shRNAC組(1796.6±51)(P<0.01)與TPC-1組(1772.4±90)(P<0.01),shRNAC組與TPC-1組同質(zhì)黏附細(xì)胞數(shù)無(wú)差異。

2.2 異質(zhì)黏附細(xì)胞數(shù)

shRNA-TFF3組異質(zhì)黏附細(xì)胞數(shù)(638.83±68.88)顯著低于shRNAC組(885.67±45.12)(P<0.01)與TPC-1組(898.16±25.69)(P<0.01),shRNAC組與TPC-1組同質(zhì)黏附細(xì)胞數(shù)無(wú)差異。

2.3 TFF3及β-catenin mRNA水平

shRNA-TFF3組TFF3 mRNA水平顯著低于shRNAC組與TPC-1組(P<0.01);shRNAC組與TPC-1組TFF3 mRNA水平無(wú)差異(P>0.05)。shRNA-TFF3組β-catenin mRNA水平顯著低于shRNAC組與TPC-1組(P<0.01);shRNAC組與TPC-1組β-catenin mRNA水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(圖1)。

圖1 沉默TFF3后細(xì)胞TFF3和β-catenin mRNA水平降低Fig 1 β-catenin mRNA and TFF3 mRNA levels decreased after silencing TFF3**P<0.01 vs shRNA-TFF3

2.4 ALCAM、β-catenin、MMP-9、MMP-2、E-cadherin蛋白水平

免疫細(xì)胞化學(xué)法顯示，ALCAM、E-cadherin、MMP-9、MMP-2、β-catenin陽(yáng)性信號(hào)為棕黃色,均位于胞質(zhì)。shRNA-TFF3組ALCAM、MMP-9、MMP-2、β-catenin 免疫陽(yáng)性信號(hào)明顯低于TPC-1組和shRNAC組;E-cadherin蛋白免疫陽(yáng)性信號(hào)明顯高于TPC-1組和shRNAC組(圖2)。

免疫印跡檢測(cè)顯示，與TPC-1組與shRNAC組相比,shRNA-TFF3組ALCAM、β-catenin、MMP-9、MMP-2蛋白水平顯著降低,E-cadherin蛋白水平升高(圖3)。

3 討論

3.1 TFF3對(duì)細(xì)胞黏附的作用

黏附能力改變是腫瘤轉(zhuǎn)移的始動(dòng)步驟,細(xì)胞黏附分子在腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)量或分布模式的改變直接或間接影響細(xì)胞間以及細(xì)胞與胞外基質(zhì)的黏附及轉(zhuǎn)移潛能,是腫瘤細(xì)胞從原發(fā)灶逃逸以及定植的關(guān)鍵性環(huán)節(jié)。同質(zhì)黏附是指相同細(xì)胞之間的粘附,異質(zhì)黏附是指腫瘤細(xì)胞與宿主基質(zhì)的粘附。腫瘤細(xì)胞同質(zhì)黏附能力下降,使細(xì)胞間黏著力降低,易于脫離原發(fā)灶[8],異質(zhì)黏附能力上升,增加了逃逸腫瘤細(xì)胞異位種植能力[9]。沉默TFF3基因表達(dá)后,TPC-1細(xì)胞的同質(zhì)細(xì)胞數(shù)增加,即可以增強(qiáng)同質(zhì)細(xì)胞的黏附力。E-cadherin是廣泛分布于上皮細(xì)胞的鈣依賴性糖蛋白,介導(dǎo)同種細(xì)胞之間的黏附連接(同質(zhì)黏附),E-cadherin表達(dá)降低或缺失會(huì)導(dǎo)致同質(zhì)黏附能力下降,細(xì)胞骨架改變,癌細(xì)胞脫離原發(fā)灶。研究表明,E-cadherin在肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌中表達(dá)降低,腫瘤惡性程度越高其表達(dá)越低,細(xì)胞間黏附能力越差,侵襲能力越高[10-12]。Yuan等[13]在宮頸癌細(xì)胞中通過(guò)siRNA技術(shù)沉默TFF3后發(fā)現(xiàn)：STAT3 磷酸化下降,E-cadherin表達(dá)升高,提示TFF3可能經(jīng)STAT3/E-cadherin途徑通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附能力來(lái)影響宮頸癌細(xì)胞侵襲能力。在TPC-1細(xì)胞中敲低TFF3表達(dá)后E-cadherin表達(dá)顯著升高,可增加細(xì)胞間黏著

圖3 3組細(xì)胞E-cadherin、MMP-9、MMP-2、β-catenin、ALCAM蛋白表達(dá)水平(A)及各蛋白定量表達(dá)(B)Fig 3 Expression of E-cadherin,MMP-9,MMP-2,β-catenin,and ALCAMs in the three groups.A showed the representative bands of Western blotting.Quantitative analysis of Western blotting was shown in B**P<0.01 vs shRNA-TFF3

力,抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移,這與Pandey[14]等報(bào)道TFF3可以通過(guò)介導(dǎo)調(diào)節(jié)STAT3下調(diào)E-cadherin的表達(dá),進(jìn)而降低ER+乳腺癌細(xì)胞侵襲能力的研究一致。同時(shí)這也說(shuō)明E-cadherin是TFF3的下游蛋白,是TFF3介導(dǎo)癌細(xì)胞侵襲的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[13]。孫琳等[15]通過(guò)檢測(cè)PTC患者組織和血清中E-cadherin含量水平顯示,E-cadherin在PTC患者血清中高表達(dá),在癌組織中低表達(dá),他們認(rèn)為可溶性E-cadherin與PTC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān),血清中高表達(dá)的E-cadherin具有破壞細(xì)胞黏附的作用,從而促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。

黏附分子ALCAM是免疫球蛋白超家族成員之一,其主要通過(guò)同嗜性黏附形式(ALCAM-ALCAM)和異嗜性黏附形式(ALCAM-CD6)在細(xì)胞黏附過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用,與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[16]。Chaker等[17]認(rèn)為ALCAM在PTC組織較癌旁組織高表達(dá)。孫琳等[18]報(bào)道PTC組織ALCAM的高表達(dá)與β-catenin、E-cadherin的異常表達(dá)有關(guān),且三者的異常表達(dá)與PTC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Degen等[19]認(rèn)為ALCAM可能通過(guò)調(diào)節(jié)黏附作用來(lái)影響該種細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。沉默TFF3后可以顯著減低TPC-1細(xì)胞中ALCAM的表達(dá),與Chaker等[17]發(fā)現(xiàn)ALCAM高表達(dá)可以降低細(xì)胞黏附從而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的研究一致。Tomita等[20]通過(guò)對(duì)前列腺癌細(xì)胞系研究發(fā)現(xiàn),ALCAM可以通過(guò)α-catenin與細(xì)胞骨架相

圖2 ALCAM、E-cadherin、β-catenin、MMP-9、MMP-2蛋白在3組細(xì)胞的表達(dá)，免疫細(xì)胞化學(xué),bar=20μmFig 2 Protein expression of ALCAM,E-cadherin,β-catenin,MMP-9,and MMP-2 in the three groups,immunocytochemistry,bar=20μm

連接,并且α-catenin缺失可導(dǎo)致ALCAM向細(xì)胞質(zhì)定位,從而獲得侵襲表型。在TPC-1細(xì)胞中沉默TFF3后,細(xì)胞胞質(zhì)中ALCAM顯著降低。Lunter等[21]指出ALCAM可能通過(guò)調(diào)控MT1-MMP來(lái)影響MMP-2的活化,從而影響MMPs(基質(zhì)金屬蛋白酶)的激活。目前,對(duì)于甲狀腺癌細(xì)胞侵襲研究多集中在MMP-2和MMP-9上,Selemetjev等[22]指出MMPs特別是MMP-9可以通過(guò)增強(qiáng)VEGF-C作用促使TPC-1細(xì)胞向淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。在敲低TFF3組中,MMP-2和MMP-9低表達(dá),提示沉默TFF3表達(dá)降低TPC-1細(xì)胞降解基底膜和胞外基質(zhì)的能力,降低癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力,這與Lunter等[21]研究一致。

3.2 TFF3對(duì)WNT/β-catenin信號(hào)通路的作用

WNT/β-catenin信號(hào)通路是調(diào)控細(xì)胞正常發(fā)育過(guò)程的重要信號(hào)通路之一,在癌細(xì)胞黏附、運(yùn)動(dòng)、生長(zhǎng)等過(guò)程中發(fā)揮調(diào)控作用[23]。WNT/β-catenin信號(hào)通路未激活時(shí),β-catenin在細(xì)胞膜表面表達(dá)極低,參與細(xì)胞間的黏附過(guò)程[6]。這一通路激活的標(biāo)志是β-catenin異常積累并向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移。在甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞中β-catenin主要在細(xì)胞核和胞質(zhì)內(nèi)表達(dá),但在沉默TFF3組β-catenin在胞核和胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)明顯降低。另有文獻(xiàn)報(bào)道E-cadherin表達(dá)減少可以引起β-catenin向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移,同時(shí)激活WNT/β-catenin信號(hào)通路[24]。我們認(rèn)為沉默TFF3腫瘤細(xì)胞黏附能力改變,與WNT/β-catenin信號(hào)通路有關(guān),這與之前Raja等[25]的研究一致。

綜上所述,沉默TFF3可以增強(qiáng)TPC-1細(xì)胞之間的同質(zhì)黏附能力,降低TPC-1細(xì)胞與基底膜的黏附的異質(zhì)能力,并且TFF3可能通過(guò)WNT/β-catenin信號(hào)通路影響TPC-1細(xì)胞黏附分子ALCAM、E-cadherin及降低MMPs的表達(dá)影響?zhàn)じ侥芰?抑制淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。