林 旭 代 金 吳靖芳△ 張 靜 張文靜 薛 剛 高福祿

(河北北方學院,1 基礎醫(yī)學院,2 附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科,張家口 075000;3 河北師范大學,石家莊 050024)

甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid cancer,PTC)是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一,其預后良好,但仍有部分患者在確診前發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或經(jīng)治療后復發(fā)[1]。癌細胞轉(zhuǎn)移是一個復雜的過程,癌細胞的高黏附作用與腫瘤高轉(zhuǎn)移性密切相關。三葉因子3(trefoil factor 3,TFF3)是三葉因子家族成員之一,有學者認為TFF3是潛在的癌基因,且高表達的TFF3具有促進腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移的作用[2-5]。β-catenin作為Wnt/β-catenin信號通路中一個核心的靶點,直接參與了細胞黏附[6]。本課題組前期工作表明,TFF3在PTC中高表達并與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關[7],但關于TFF3是否通過影響PTC細胞的黏附作用進而影響該細胞向淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和侵襲能力尚未見報道。本研究對敲低TFF3表達的TPC-1細胞株進行同質(zhì)和異質(zhì)黏附實驗,明確TFF3對TPC-1黏附作用機制,為PTC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移機制提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、BSA基購自Gibco;TPC-1細胞株購自ATCC;鼠抗人β-catenin、activated leukocyte cell adhesion molecule (ALCAM)、MMP-9、MMP-2、E-cadherin購自Santa Cruz公司;FastQuan RT Kit購自TIANGEN公司;纖維連接蛋白(FN)購自美國Sigma公司;TRIzol裂解液購自Invitrogen公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒、RIPA裂解液、ECL發(fā)光液購自上海碧云天生物技術有限公司;蛋白預染marker、PowerUpTMSYBR Green Master Mix購自賽默飛科技有限公司。DAB顯色液購自中杉金橋公司。

1.2 細胞培養(yǎng)及分組

TPC-1細胞培養(yǎng)于含有10% FBS、1%青霉素-鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中;穩(wěn)定沉默TFF3表達的TPC-1細胞株(shTFF3-TPC-1)培養(yǎng)于含有10% FBS、1%青霉素-鏈霉素、嘌呤霉素(2mg/L)的RPMI 1640培養(yǎng)液中;轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒載體的TPC-1細胞株(shRNAC-TPC-1)培養(yǎng)于含有10% FBS、1%青霉素-鏈霉素、嘌呤霉素(2mg/L)的RPMI 1640培養(yǎng)液中,3株細胞慢病毒轉(zhuǎn)染成功建立了穩(wěn)定敲低TFF3表達的TPC-1細胞株(shTFF3-TPC-1)和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒載體的TPC-1細胞株(shRNAC-TPC-1),置于5% CO2、37℃的孵育箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.3 細胞同質(zhì)黏附實驗

取對數(shù)生長期的shTFF3-TPC-1、shRNAC-TPC-1、TPC-1 3組細胞用培養(yǎng)基制備成1×105/ml密度,每孔100μl接種于48孔板,37℃培養(yǎng)1h后洗去未黏附細胞,PBS洗3次收集未黏附細胞(同質(zhì)黏附細胞數(shù)=加入細胞數(shù)-未黏附細胞數(shù))。

1.4 細胞異質(zhì)黏附實驗

以10mg/L FN包被基底膜,超凈臺吹干后PSB洗3次,以1% BSA每孔200μl封閉1h,將3組細胞數(shù)調(diào)整為1×105/ml密度,每孔接種100μl,37℃孵育,90min后終止培養(yǎng)。4%多聚甲醛固定15min,400×顯微鏡下計數(shù)黏附細胞數(shù)量。

1.5 Real-time quantitative PCR (qPCR)檢測β-catenin、TFF3 mRNA水平

TRIzol法提取shRNA-TFF3-TPC-1、shRNAC-TPC-1、TPC-1 3組細胞總RNA;根據(jù)FastQuan RT Kit試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄cDNA;根據(jù)PowerUpTM SYBR Green Master Mix說明書進行qPCR檢測。β-catenin上游引物5′-TGCAGTTCGCCTTCACTATG-3′,下游引物5′-ACTAGTCGTGGAATGGCACC-3′;β-actin上游引物5′-CCTGGGCATGGAGTCCTGTG-3′,下游引物5′-AGGGGCCGGACT CGTCATAC-3′；TFF3上游引物：5′-AATGCACCTTCTGAGGCAC CT-3′，下游引物5′-CGTTAAGACATCAGGCTCC AGAT-3′。

1.6 免疫細胞化學檢測β-catenin、ALCAM、MMP-9、MMP-2、E-cadherin的蛋白表達水平

消化3組細胞,調(diào)整細胞密度到1×104/ml。蓋玻片放于6孔板內(nèi),將1ml細胞懸液滴加于蓋玻片上,過夜。待細胞融合度達80%后,4%多聚甲醛固定15min。正常羊血請封閉15min,一抗4℃孵育過夜(β-catenin、ALCAM、MMP-9、MMP-2、E-cadherin,工作濃度均為1∶100),二抗(羊抗兔lgG)37℃孵育30min,三抗(辣根酶標記鏈霉卵白素)37℃孵育30min,DAB顯色,蘇木精復染,乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。陰性對照以PBS代替一抗。

1.7 免疫印跡檢測β-catenin、ALCAM、MMP-9、MMP-2、E-cadherin的蛋白表達水平

以RIPA液裂解3組細胞,提取總蛋白,BCA法測定蛋白濃度,SDS-PAGE電泳分離蛋白并且轉(zhuǎn)膜到PVDF膜上,脫脂奶粉封閉1h,PBST洗3次后,分別孵育一抗(β-catenin、ALCAM、MMP-9、MMP-2、E-cadherin,工作濃度均為1∶300)4℃過夜,辣根過氧化物標記的山羊抗兔/鼠抗體(1∶5000) 二抗37℃孵育1h,ECL顯色。

1.8 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 同質(zhì)黏附細胞數(shù)

shRNA-TFF3組同質(zhì)黏附細胞數(shù)(2111.15±427)顯著高于shRNAC組(1796.6±51)(P<0.01)與TPC-1組(1772.4±90)(P<0.01),shRNAC組與TPC-1組同質(zhì)黏附細胞數(shù)無差異。

2.2 異質(zhì)黏附細胞數(shù)

shRNA-TFF3組異質(zhì)黏附細胞數(shù)(638.83±68.88)顯著低于shRNAC組(885.67±45.12)(P<0.01)與TPC-1組(898.16±25.69)(P<0.01),shRNAC組與TPC-1組同質(zhì)黏附細胞數(shù)無差異。

2.3 TFF3及β-catenin mRNA水平

shRNA-TFF3組TFF3 mRNA水平顯著低于shRNAC組與TPC-1組(P<0.01);shRNAC組與TPC-1組TFF3 mRNA水平無差異(P>0.05)。shRNA-TFF3組β-catenin mRNA水平顯著低于shRNAC組與TPC-1組(P<0.01);shRNAC組與TPC-1組β-catenin mRNA水平差異無統(tǒng)計學差異(P>0.05)(圖1)。

圖1 沉默TFF3后細胞TFF3和β-catenin mRNA水平降低Fig 1 β-catenin mRNA and TFF3 mRNA levels decreased after silencing TFF3**P<0.01 vs shRNA-TFF3

2.4 ALCAM、β-catenin、MMP-9、MMP-2、E-cadherin蛋白水平

免疫細胞化學法顯示，ALCAM、E-cadherin、MMP-9、MMP-2、β-catenin陽性信號為棕黃色,均位于胞質(zhì)。shRNA-TFF3組ALCAM、MMP-9、MMP-2、β-catenin 免疫陽性信號明顯低于TPC-1組和shRNAC組;E-cadherin蛋白免疫陽性信號明顯高于TPC-1組和shRNAC組(圖2)。

免疫印跡檢測顯示，與TPC-1組與shRNAC組相比,shRNA-TFF3組ALCAM、β-catenin、MMP-9、MMP-2蛋白水平顯著降低,E-cadherin蛋白水平升高(圖3)。

3 討論

3.1 TFF3對細胞黏附的作用

黏附能力改變是腫瘤轉(zhuǎn)移的始動步驟,細胞黏附分子在腫瘤細胞表面表達量或分布模式的改變直接或間接影響細胞間以及細胞與胞外基質(zhì)的黏附及轉(zhuǎn)移潛能,是腫瘤細胞從原發(fā)灶逃逸以及定植的關鍵性環(huán)節(jié)。同質(zhì)黏附是指相同細胞之間的粘附,異質(zhì)黏附是指腫瘤細胞與宿主基質(zhì)的粘附。腫瘤細胞同質(zhì)黏附能力下降,使細胞間黏著力降低,易于脫離原發(fā)灶[8],異質(zhì)黏附能力上升,增加了逃逸腫瘤細胞異位種植能力[9]。沉默TFF3基因表達后,TPC-1細胞的同質(zhì)細胞數(shù)增加,即可以增強同質(zhì)細胞的黏附力。E-cadherin是廣泛分布于上皮細胞的鈣依賴性糖蛋白,介導同種細胞之間的黏附連接(同質(zhì)黏附),E-cadherin表達降低或缺失會導致同質(zhì)黏附能力下降,細胞骨架改變,癌細胞脫離原發(fā)灶。研究表明,E-cadherin在肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌中表達降低,腫瘤惡性程度越高其表達越低,細胞間黏附能力越差,侵襲能力越高[10-12]。Yuan等[13]在宮頸癌細胞中通過siRNA技術沉默TFF3后發(fā)現(xiàn)：STAT3 磷酸化下降,E-cadherin表達升高,提示TFF3可能經(jīng)STAT3/E-cadherin途徑通過調(diào)節(jié)細胞黏附能力來影響宮頸癌細胞侵襲能力。在TPC-1細胞中敲低TFF3表達后E-cadherin表達顯著升高,可增加細胞間黏著

圖3 3組細胞E-cadherin、MMP-9、MMP-2、β-catenin、ALCAM蛋白表達水平(A)及各蛋白定量表達(B)Fig 3 Expression of E-cadherin,MMP-9,MMP-2,β-catenin,and ALCAMs in the three groups.A showed the representative bands of Western blotting.Quantitative analysis of Western blotting was shown in B**P<0.01 vs shRNA-TFF3

力,抑制腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移,這與Pandey[14]等報道TFF3可以通過介導調(diào)節(jié)STAT3下調(diào)E-cadherin的表達,進而降低ER+乳腺癌細胞侵襲能力的研究一致。同時這也說明E-cadherin是TFF3的下游蛋白,是TFF3介導癌細胞侵襲的關鍵調(diào)節(jié)因子[13]。孫琳等[15]通過檢測PTC患者組織和血清中E-cadherin含量水平顯示,E-cadherin在PTC患者血清中高表達,在癌組織中低表達,他們認為可溶性E-cadherin與PTC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關,血清中高表達的E-cadherin具有破壞細胞黏附的作用,從而促進癌細胞轉(zhuǎn)移。

黏附分子ALCAM是免疫球蛋白超家族成員之一,其主要通過同嗜性黏附形式(ALCAM-ALCAM)和異嗜性黏附形式(ALCAM-CD6)在細胞黏附過程中發(fā)揮關鍵作用,與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關[16]。Chaker等[17]認為ALCAM在PTC組織較癌旁組織高表達。孫琳等[18]報道PTC組織ALCAM的高表達與β-catenin、E-cadherin的異常表達有關,且三者的異常表達與PTC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關。Degen等[19]認為ALCAM可能通過調(diào)節(jié)黏附作用來影響該種細胞的惡性生物學行為。沉默TFF3后可以顯著減低TPC-1細胞中ALCAM的表達,與Chaker等[17]發(fā)現(xiàn)ALCAM高表達可以降低細胞黏附從而促進腫瘤轉(zhuǎn)移的研究一致。Tomita等[20]通過對前列腺癌細胞系研究發(fā)現(xiàn),ALCAM可以通過α-catenin與細胞骨架相

圖2 ALCAM、E-cadherin、β-catenin、MMP-9、MMP-2蛋白在3組細胞的表達，免疫細胞化學,bar=20μmFig 2 Protein expression of ALCAM,E-cadherin,β-catenin,MMP-9,and MMP-2 in the three groups,immunocytochemistry,bar=20μm

連接,并且α-catenin缺失可導致ALCAM向細胞質(zhì)定位,從而獲得侵襲表型。在TPC-1細胞中沉默TFF3后,細胞胞質(zhì)中ALCAM顯著降低。Lunter等[21]指出ALCAM可能通過調(diào)控MT1-MMP來影響MMP-2的活化,從而影響MMPs(基質(zhì)金屬蛋白酶)的激活。目前,對于甲狀腺癌細胞侵襲研究多集中在MMP-2和MMP-9上,Selemetjev等[22]指出MMPs特別是MMP-9可以通過增強VEGF-C作用促使TPC-1細胞向淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。在敲低TFF3組中,MMP-2和MMP-9低表達,提示沉默TFF3表達降低TPC-1細胞降解基底膜和胞外基質(zhì)的能力,降低癌細胞轉(zhuǎn)移能力,這與Lunter等[21]研究一致。

3.2 TFF3對WNT/β-catenin信號通路的作用

WNT/β-catenin信號通路是調(diào)控細胞正常發(fā)育過程的重要信號通路之一,在癌細胞黏附、運動、生長等過程中發(fā)揮調(diào)控作用[23]。WNT/β-catenin信號通路未激活時,β-catenin在細胞膜表面表達極低,參與細胞間的黏附過程[6]。這一通路激活的標志是β-catenin異常積累并向細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移。在甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞中β-catenin主要在細胞核和胞質(zhì)內(nèi)表達,但在沉默TFF3組β-catenin在胞核和胞質(zhì)內(nèi)表達明顯降低。另有文獻報道E-cadherin表達減少可以引起β-catenin向細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移,同時激活WNT/β-catenin信號通路[24]。我們認為沉默TFF3腫瘤細胞黏附能力改變,與WNT/β-catenin信號通路有關,這與之前Raja等[25]的研究一致。

綜上所述,沉默TFF3可以增強TPC-1細胞之間的同質(zhì)黏附能力,降低TPC-1細胞與基底膜的黏附的異質(zhì)能力,并且TFF3可能通過WNT/β-catenin信號通路影響TPC-1細胞黏附分子ALCAM、E-cadherin及降低MMPs的表達影響?zhàn)じ侥芰?抑制淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。