王婧 ,翟偉卜 ,孟菁 ,高環(huán) ,史金艷 ,張文蔚 ,韓榕 ,齊放軍 *
(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/植物病蟲害生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京100193;2.山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山西臨汾041004)
鏈格孢(Alternaria alternata)引起的棉花輪紋斑病又叫黑斑病 (Alternaria leaf spot,Black leaf spot),可全生育期危害棉花葉片,且發(fā)生范圍廣、危害嚴(yán)重、流行頻率高[1-2]。該病在我國各棉區(qū)均有發(fā)生,尤其在陰濕多雨的氣候條件下更易暴發(fā)流行,嚴(yán)重時可導(dǎo)致棉株葉片全部脫落成光稈,甚至枯死,在早發(fā)和重發(fā)田塊可降低產(chǎn)量30%~50%,造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3-4]。1995―1998年在新疆南疆的調(diào)查中發(fā)現(xiàn),擴(kuò)大種植的海島棉品種在后期極易發(fā)生輪紋斑病,特別是鈴期至吐絮期尤為嚴(yán)重,并有逐漸加重的趨勢[5]。2001年河北省館陶縣棉花輪紋斑病發(fā)生面積超過3 000 hm2,當(dāng)?shù)孛揶r(nóng)經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重[6]。湖北省鄂州市植物保護(hù)站經(jīng)過長期的監(jiān)測發(fā)現(xiàn),2005年前由鏈格孢屬真菌引起的棉花輪紋斑病還屬當(dāng)?shù)氐拇我『?,?005年之后,該病逐年加重,已成為該市的主要病害[7]。筆者團(tuán)隊研究發(fā)現(xiàn),棉花生長中后期,低溫會降低棉花的抗病性,導(dǎo)致棉花葉片易遭受鏈格孢菌的侵染,輪紋斑病暴發(fā)引起棉花早衰,從而對棉花生產(chǎn)造成嚴(yán)重的損失[8]。Venkatesh等[9]也證明氣候?qū)γ藁ㄝ喖y斑病的發(fā)生有重要影響。
一直以來,棉花輪紋斑病菌鏈格孢人工接種十分困難,主要原因是其孢子萌發(fā)條件苛刻,難以侵染正常生長的棉花葉片[10]。李莎在對棉花輪紋斑病研究中,主要采用涂菌+套袋保濕接種法,利用塑封袋保持棉葉較高的相對濕度,使棉株成功發(fā)病[11]。但套袋條件下,葉片所處環(huán)境通風(fēng)條件欠佳,所形成的葉斑不能排除其他霉菌所致;且涂菌葉片工作量大,傷葉不均勻,致使試驗(yàn)條件一致性較差。此外,套袋后的棉苗難以承受塑封袋,倒伏嚴(yán)重,生長受影響較大。因此,有必要對棉花輪紋斑病的接種方法進(jìn)一步優(yōu)化,在有效接種的前提下,保障試驗(yàn)條件的一致性,同時減輕雜菌對接種的干擾,免除塑封袋對棉花正常生長的影響,從而為棉花輪紋斑病的研究提供更好的接種方法。
供試的棉花品種有新陸早7號 (XLZ 7)、新陸早 13 號(XLZ 13)、新陸早 33 號(XLZ 33)、中植棉 KV3(KV3)。
棉花輪紋斑病病原菌鏈格孢為本實(shí)驗(yàn)室從棉花病葉分離、鑒定和保存[11]。
培養(yǎng)鏈格孢的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(Potato dextrose agar,PDA)制備:馬鈴薯 200 g,葡萄糖20 g,瓊脂粉20 g,蒸餾水1 L,121℃濕熱滅菌30 min。
1.2.1棉苗培養(yǎng)。選取外觀一致籽粒飽滿的種子,先用75%(體積分?jǐn)?shù))的乙醇表面消毒處理5 min,無菌水清洗后,用5%(體積分?jǐn)?shù))的雙氧水表面消毒處理2 h,隨后用無菌水沖洗3遍。播種于盛有營養(yǎng)土和蛭石混合土(體積比2∶1)的營養(yǎng)缽中,每缽播種10粒種子。將營養(yǎng)缽放置在晝夜溫度分別為28℃、22℃,光暗時間分別為16 h、8 h的條件下培養(yǎng),適時澆水,保持相對含水量在70%~80%。
1.2.2孢子懸浮液的制備。在PDA培養(yǎng)基上,于26~28℃暗光條件下進(jìn)行鏈格孢產(chǎn)孢培養(yǎng)15 d后,用無菌刀片刮取菌絲體及孢子,放入盛有適量無菌水的三角瓶中,在180 r·min-1搖床上振蕩培養(yǎng)15~20 min,用4層無菌紗布過濾,獲得孢子懸浮液。通過顯微計數(shù),用無菌水將孢子懸浮液的孢子含量調(diào)整至1.2×104mL-1左右并用于接種[12]。
1.2.3接種方法。(1)涂菌+套袋保濕接種法:待棉苗長至2片真葉完全展開時,用新配制的孢子懸浮液接種真葉。具體方法是用寬1.5 cm左右滅過菌的毛刷,蘸取孢子懸浮液(1.2×104mL-1),在棉花葉片背面輕輕均勻涂菌2次[13]。每片葉接種約1 mL孢子懸浮液。接種后用塑封袋套住葉片,以保持濕度[11]。白天溫度控制在28~30℃,夜晚溫度控制在22~25℃。
(2)涂菌+噴霧保濕接種法:待棉苗長至2片真葉完全展開時,用新配制的孢子懸浮液接種真葉。具體方法是用寬1.5 cm左右滅過菌的毛刷,蘸取孢子懸浮液(1.2×104mL-1),在棉花葉片背面輕輕均勻涂菌2次[13]。每片葉的接種量約為1 mL孢子懸浮液。采用加濕器噴霧保濕,每天加水1次,可連續(xù)噴霧保濕至少12 h,將環(huán)境濕度一直控制在90%以上,持續(xù)保濕5 d[14-15]。白天溫度控制在28~30℃,夜晚溫度控制在22~25℃。
(3)噴菌+噴霧保濕接種法:待棉苗長至2片真葉完全展開時,用新配制的孢子懸浮液接種真葉。具體方法是將孢子懸浮液(1.2×104mL-1)用噴壺均勻噴灑在棉花第1、第2片真葉的正反面。加濕器噴霧保濕及溫度控制條件與上述涂菌+噴霧保濕接種法相同。
上述3種接種方法每個處理均為12缽,每缽留苗5~6株,重復(fù)3次。
1.3.1涂菌接種病情分級標(biāo)準(zhǔn)。棉苗接種后每天觀察病害的發(fā)生情況,分別在接種第3、6、9、12、15、20天調(diào)查發(fā)病情況,并按以下標(biāo)準(zhǔn)記錄發(fā)病級別。參考Mehta的分級標(biāo)準(zhǔn)[16]:0級/免疫:全葉無病/極小免疫白斑;1級:發(fā)病面積占全葉總面積5%以下;2級:發(fā)病面積占全葉總面積5%~25%(含);3級:發(fā)病面積占全葉總面積25%~50%(含);4級:發(fā)病面積占全葉總面積50%~75%(含);5級:發(fā)病面積占全葉總面積75%以上,葉片干枯或脫落。
1.3.2噴菌接種病情分級標(biāo)準(zhǔn)。棉苗接種后每天觀察病害的發(fā)生情況,分別在接種第3、6、9、12、15、20天調(diào)查發(fā)病情況,并按以下標(biāo)準(zhǔn)記錄發(fā)病級別。參考Mehta的分級標(biāo)準(zhǔn)[16],稍作修改:0級/免疫:全葉無病;1級:發(fā)病面積占全葉總面積1%以下;2級:發(fā)病面積占全葉總面積1%~5%(含);3級:發(fā)病面積占全葉總面積5%~10%(含);4級:發(fā)病面積占全葉總面積10%~20%(含);5級:發(fā)病面積占全葉總面積20%以上。
1.3.3計算公式。涂菌接種和噴菌接種法的病情指數(shù)(ID)和發(fā)病率(rD)計算公式相同:ID=[∑(NDL,i×i)/N×imax(5)]×100;rD=NDL/N×100%。式中,i為棉葉病級,imax為最高病級,NDL,i為i級病葉數(shù),N為調(diào)查的總?cè)~片數(shù),NDL為發(fā)病總?cè)~數(shù)。
2.1.1不同接種方法棉花輪紋斑病的發(fā)病情況比較。選取棉花品種新陸早13號,采用不同的輪紋斑病接種方法進(jìn)行接種,結(jié)果(圖1)表明,涂菌+噴霧保濕接種法的發(fā)病率最高,為60%~70%,病情指數(shù)可超過30;噴菌+噴霧保濕接種法發(fā)病率可達(dá)50%,病情指數(shù)可超過20;涂菌+套袋保濕接種法與噴菌+噴霧保濕接種法相比,發(fā)病率相近,病情指數(shù)略低。
圖1 不同接種方法棉花輪紋斑病發(fā)病情況的比較Fig.1Comparison of different inoculation methods on disease incidence of cotton Alternaria leaf spot
2.1.2不同接種方法發(fā)病時間的比較。涂菌+噴霧保濕接種法與噴菌+噴霧保濕接種法相比,涂菌+噴霧保濕和涂菌+套袋保濕接種后3 d即可觀察到病斑;而噴菌+噴霧保濕接種法發(fā)病周期較長,發(fā)病進(jìn)程緩慢,接種后6 d左右才能觀察到葉片輕微病狀,邊緣輕微黃化失綠,有小的病斑形成。
2.1.3不同接種方法病斑比較。觀察不同接種方法的葉片病斑,結(jié)果(圖2)顯示:涂菌+噴霧保濕接種法與涂菌+套袋保濕接種法均可使葉片產(chǎn)生較大面積的黑色病斑,但病斑形狀不規(guī)則,且病斑一般發(fā)生在涂菌傷口周圍。噴菌+噴霧保濕接種法由于未對棉花葉片造成損傷,模擬鏈格孢菌田間發(fā)病環(huán)境,溫度和濕度適宜,所以發(fā)病均勻,且與田間癥狀一致,病斑呈圓形或不規(guī)則輪紋狀,從葉邊緣開始發(fā)展,使葉片逐漸黃化、干枯,直至脫落。棉花葉片黃花脫落,極可能是由于病原菌鏈格孢產(chǎn)生的毒素,破壞了棉葉的細(xì)胞組織,導(dǎo)致棉葉過早衰老。
圖2 不同接種方法病斑比較Fig.2 Comparison of different inoculation methods on leaf spots
分離不同接種方法的病原菌結(jié)果 (圖3)表明,涂菌+噴霧保濕接種法主要分離到的是鏈格孢菌,且雜菌較少,甚至沒有其他雜菌污染;噴菌+噴霧保濕接種法也只分離到鏈格孢菌,沒有發(fā)現(xiàn)被其他雜菌污染的情況;而涂菌+套袋保濕接種法不僅能分離到鏈格孢菌,還分離到其他雜菌。分析其原因可能是由于套袋后空氣不流通,有些病斑是由霉菌所引起。
圖3 各接種方法形成病斑中病原菌的再分離情況Fig.3 Pathogens re-isolation from lesions of different inoculation methods
繼續(xù)對涂菌+噴霧保濕接種法與噴菌+噴霧保濕接種法進(jìn)行比較,檢驗(yàn)不同棉花品種對輪紋斑病的抗性,結(jié)果表明,涂菌+噴霧保濕接種法中,新陸早7號和新陸早13號的發(fā)病率基本在60%左右(圖4-a),病情指數(shù)最高可達(dá)35~40(圖4-b),遠(yuǎn)高于中植棉KV3和新陸早33號(圖4-a,b),表現(xiàn)為感?。粐娋珖婌F保濕接種法中,新陸早7號和新陸早13號的發(fā)病率 (圖4-c)和病情指數(shù)(圖4-d)同樣也高于中植棉KV3和新陸早33號,表現(xiàn)為感病,說明2種接種方法皆能明顯區(qū)分棉花輪紋斑病感病品種新陸早7號、新陸早13號與抗病品種中植棉KV3、新陸早33號。但涂菌+噴霧保濕接種法在接種初期各品種植株發(fā)病率和病情指數(shù)就已達(dá)到一定水平,發(fā)病趨勢較緩;而噴菌+噴霧保濕接種法各品種棉株的發(fā)病率和病情指數(shù)呈自然上漲趨勢,但發(fā)病周期較長。
圖4 2種接種方法鑒別不同棉花品種對輪紋斑病抗性的差異Fig.4 Comparison of cotton varieties resistance to cotton Alternaria leaf spot identified by the two inoculation methods
觀察各品種植株發(fā)現(xiàn),新陸早7號和新陸早13號發(fā)病嚴(yán)重,接種葉片發(fā)黃失綠,甚至干枯、脫落;而中植棉KV3和新陸早33號,植株病情較輕,接種葉片無明顯失綠現(xiàn)象,且病斑大小基本穩(wěn)定并不繼續(xù)發(fā)展。
棉花輪紋斑病可發(fā)生在棉花生長的各個時期,且環(huán)境條件對棉花的抗病性有較大的影響,再加上接種困難,目前尚沒有高效的抗病鑒定方法。有研究表明,黑暗處理有利于棉花輪紋斑病病原菌分生孢子的萌發(fā),且其分生孢子萌發(fā)對溫濕度要求較高,在高溫高濕環(huán)境中較易萌發(fā)和侵染[11]。棉花葉片內(nèi)部營養(yǎng)物質(zhì)也能刺激分生孢子的萌發(fā)[17],棉花葉片損傷后內(nèi)部營養(yǎng)物質(zhì)外滲更利于輪紋斑病的發(fā)生;鏈格孢容易侵染葉齡較大或者遭受低溫等生理傷害的棉花葉片[8]。綜合考慮這些因素以及前期經(jīng)驗(yàn),本研究嘗試涂菌+噴霧保濕接種法與噴菌+噴霧保濕接種法,對棉株第1、第2片真葉進(jìn)行接種,用以替代涂菌+套袋保濕接種法,進(jìn)一步優(yōu)化棉花輪紋斑病的接種方法。
結(jié)果表明,噴菌+噴霧保濕接種法較所試的另外2種方法發(fā)病更加均勻和穩(wěn)定。這種方法不傷葉,避免了因?yàn)閭~不均勻造成的發(fā)病不均勻而影響試驗(yàn)結(jié)果的一致性。此外,噴菌+噴霧保濕接種法既可保證適宜病原菌生長的濕度,又可避免涂菌+套袋保濕接種法中因空氣不流通造成的葉片腐爛對病斑調(diào)查造成的干擾。且不套袋后,棉苗不用承受塑封袋質(zhì)量,能夠正常直立生長。
本研究建立的鏈格孢噴菌+噴霧保濕接種法接近田間自然發(fā)病條件,避免了雜菌污染,能夠有效區(qū)分棉花的抗感品種,是1種更適合棉花鏈格孢抗性研究的接種方法,可為棉花輪紋斑病的研究提供技術(shù)支持。